一种菊花光周期敏感型基因及其应用的制作方法

专利名称：一种菊花光周期敏感型基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及菊花光周期敏感型基因FT同源基因(命 名为CmFT)，同时涉及CmFT基因在调节菊花光周期敏感性中的应用。
背景技术：
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)为菊禾斗(Asteraceae)菊属多年生草 本花卉，是我国传统名花，也是世界上重要的观赏花卉之一，经长期的人工选育和栽培形成 了许多品种。菊花依据花期可分为夏菊(6-9月开花)、秋菊(10-11月开花)、寒菊(12月-翌 年1月开花)、四季菊(四季开花)等四个类型。目前栽培的菊花主要是秋菊，其它季节的 菊花品种相对较少，存在花期相对集中、花期短等问题，影响了菊花的周年生产和应用范围 的扩大，依靠人工遮光、补光等措施调控花期易导致花卉品质下降，增加生产成本。人们通过常规育种方法选育日中性菊花品种，从而解决菊花周年生产等问题，但 仍存在品种单一、性状遗传不稳定等问题。某些日中性菊花品种开花生理的研究对选育日 中性菊花品种具有一定的指导意义。通过分子育种方法结合常规育种手段定向选育日中性 菊花品种无疑更具普遍意义。转入外源基因的菊花改变花期的研究表明通过分子育种培育 新品种的可行性，然而有关菊花日中性分子机理的研究仍未见报道。近年来，随着一些植物光周期不敏感相关基因的定位、克隆和功能验证，人们对日 中性的形成机理有了更深的认识，这无疑对菊花日中性的分子机制研究和新品种选育提供 了契机。为了满足菊花适时、适地开花的要求，可以通过分离菊花光周期不敏感相关基因， 研究其分子调控机制，并在菊花中导入控制花期的关键基因，以达到改变花期的目的。光周期是白天与黑夜的周期循环，是调控开花的主要环境因子之一。光周期现象 (Photoperiodism)是生物体适应光周期变化而发生的各种生理反应现象。1920年，戈纳 (Garner W. W.)与阿拉德(Allard H. A.)首先证实日照长度是影响一年生烟草开花的关键 因素，之后在茎的伸长、休眠、落叶等生理反应中观察到光周期现象。许多植物日长控制开花时间的生理研究都支持外部同步模型，这表明日长响应的 分子基础是外部光信号和内部昼夜生理节律的相互作用。在植物上主要通过两类基因加以 分析拟南芥CONSTANS(CO)或水稻同源基因Heading datel (Hdl)，编码B_box锌指蛋白； 拟南芥FLOWERING LOCUS T(FT)或水稻同源基因Heading date 3a (Hd3a)，编码小分子转 录辅酶。相关研究表明，受光周期调控的CO峰形及表达量的改变对FT表达阈值的变化起 关键性作用，此外其它一些蛋白如拟南芥PHYT0CHR0ME AND FLOWERING TIME 1、水稻Early heading date 1等也分别参与了植物光周期遗传调控，且独立于CO(Hdl)对FT(Hd3a)起作 用；植物光敏感性机制正是通过一系列分子调控过程最终通过FT影响植物光周期特性。在拟南芥中FT首次被克隆鉴定，被认为是一个转录辅助因子。自从1996年报道 CO在茎顶中积累开始，目前主要的关注点已在光周期信号下游的过程。一个主要进展是发 现FT的表达量不仅在长日照下很高，而且呈现生物循环节律，在24h循环周期的后半时达最高峰。在短日照下FT表达量微乎其微，但是从短日照转移到长日照诱导成花的条件下依 赖CO的FT立即被诱导，再放回短日照下便引起FT表达量的下降。这些现象说明日长在FT 的积累中起重要作用。与FT相反，CO在长日照和短日照下均容易被检测出来，CO表达量循环振荡，但与 日长不相关。无论在长日照或短日照下，在夜间均有一峰值，但在长日照光照后半段有个次 峰。CO表达没有引发FT的积累表明CO/FT分子机制可能是外部一致模型的核心。Yanovsky和Kay研究tocl突变体间接地支持CO/FT分子机制可能是外部一致模 型的核心。此外，Roden等进行了不同日照长度的处理，证实了把CO峰值置于光照下促进 野生型植物在短日照下开花。高表达量CO蛋白处于光照条件下FT才受诱导表明CO活性 是在转录后调控的。通过一系列实验，GeorgeCoupland研究组阐明远红外和蓝光(分别被 光敏色素A和隐花色素2所感应)通过抑制依赖激酶的CO降解来调控CO蛋白的稳定性。 因此，Burming所指出生物节律产生的光感应开花调控因子确实存在，即CO蛋白。在夜间， CO可能通过SPA蛋白结合激酶，该激酶反过来与E3泛素连接酶COPl互相作用在菊花中分离和鉴定FT同源基因，并对其结构及功能进行分析，探讨菊花中CO/ FT分子机理，有利于从分子水平上了解菊花光周期控制花发育的机制。然而，到目前为止， 还没有有关菊花光周期敏感型基因的相关报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种菊花光周期敏感型基因，其为FT同源基因(命名为 CmFT)，属于FT亚家族成员。本发明的另一个目的在于提供上述光敏感基因CmFT在培育日中性菊花新品种中 的应用。本发明采用同源基因克隆法结合RACE技术，从菊花中分离了 FT同源基因CmFT，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，开放阅读框为525bp，编码174个氨基酸，该氨基酸序列如 序列表SEQ ID No. 2所示，其包含FT类蛋白保守基序和两个关键性氨基酸残基，进化树分 析表明CmFT属于FT亚家族成员。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明 蛋白还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有 同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术 人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明的基因和蛋白质可以从地被菊中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成 的方法得到。可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表 达载体导入宿主，得到转CmFT基因的转化体。本发明通过对CmFT的克隆、鉴定及表达分析，表明CmFT与菊花光周期敏感性密切 相关，在光周期促进开花中发挥一定的作用。本发明采用基因超表达或反义技术转化模式植物拟南芥和菊花，验证CmFT的功能，结果表明，同野生型植株相比，花期均提前，在短日 照条件下可提前7d开花，在长日照条件下提前8d开花，拟南芥莲座叶的叶片数相应地减 少。


图1.CmFT基因的基因组结构图。
图2.不同双子叶植物FT/TFL1蛋白系统进化树。
图3.植物正义表达载体PBI-CmFTf的构建。
图4.植物反义表达载体PBI-CmFTr的构建。
图5.拟南芥Kan抗性植株的筛选。
图6.转CmFT拟南芥花结构表型，其中，A中左盆为长日照处理30d时野生型拟南
芥，右盆植株为转正义CmFT拟南芥；B为A图的直立拍照图；C、D、E为转CmFT拟南芥在短 日照处理45d、50d、60d的花结构表型。图7.菊花G418抗性植株的筛选。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1. CmFT基因的分离和鉴定方法1.材料选择试验材料叶片及花蕾混合物取自地被菊品种‘七月桃花’，于-80°C超低温冰箱中 保存备用。2.设计引物除RACE试验中通用引物为试剂盒附带以外(3’RACE通用引物序列如3’Full RACE Core Set Ver. 2. 0说明书、5，RACE通用引物序列如SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit
说明书)，其余各基因引物序列见下表。
3.总RNA、DNA的提取及电泳分析A.总RNA的提取(采用液氮研磨法)1)取500 μ L裂解液RLT，转入1. 5mL离心管中，加入5 μ L β -巯基乙醇至终浓度 为1 %，再加入50 μ L PLANTaid混勻备用。2)液氮中研磨适量植物组织(叶片及花蕾混合物)成细粉后，取约为50mg细粉转 入上述装有裂解液的离心管，立即用手剧烈振荡20s，充分裂解，再用电动振荡机勻浆30s， 以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。3)将裂解物室温下13，000r/m离心Smin (温度条件下同)，沉淀不能裂解的碎片 和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管(避免接触沉淀物)， 加入0. 5体积的无水乙醇，立即吹打混勻，不要离心。4)将混合物加入一个吸附柱RA中，13，000r/m离心60s，去掉废液。5)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m离心30 60s，弃废液， 将吸附柱放回收集管中。6)取 61 uL RNase free ddH20,依次力口 入 8ul IOXReaction BufferU ulRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor^10 ul RNase-Free DNaseI 于RNasefree 离心管中，轻柔混勻配制成DNase I工作液，向吸附柱RA中央加入80 μ L的DNase I工作 液，室温放置15min。7)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m离心60s，弃废液，将吸附
柱放回收集管中。8)加0. 5mL漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，12，000r/m离心30s，弃废液， 加入0. 5mL漂洗液RW，重复一遍。9)将吸附柱RA放回空收集管中，13，000r/m离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗 液中残留乙醇抑制下游反应。10)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜 的中间部位加30 50 μ L RNase free ddH20(事先在65 70°C水浴中加热效果更好)， 室温放置2min，12，000r/m离心Imin收集总RNA。B.总DNA的提取
1)取新鲜叶片幼嫩组织IOOmg于研钵中，加入液氮充分研磨，加入400 μ L缓冲液 LPl和6μ L RNase A(10mg/mL)混合液，漩涡振荡lmin，室温放置lOmin，加入130 μ L缓冲 液LP2，充分混勻，漩涡振荡lmin。2)常温下12，OOOr/m离心5min(温度条件下同)，将上清移至新离心管中。3)加入1. 5体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混勻，此时可能会出现絮状沉淀。4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12，000r/m离心30s， 去掉废液，吸附柱放回收集管中。5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12，000r/m离心30s，弃
废液，将吸附柱放回收集管中。6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，12，000r/m离心30s，弃废液。7)将吸附柱放回收集管中，12，000r/m离心2min，弃废液，将吸附柱置于室温下 lOmin，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。8)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加80 μ L 洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2 5min，12，000r/m离心2min，收集溶解物。C.电泳分析取5 μ L总RNA或总DNA放置于含Gel rad染料的1. 0%琼脂糖凝胶点样孔上，在 电泳缓冲液为ι χ TAE，电压为5V/cm条件下电泳30min，后在凝胶成像仪上观察样品的完整 性、电泳条带的清晰度，并进行拍照。4.总RNA的逆转录反应1)在冰浴的 PCR管中依次加入 Iyg 总 RNA、ly L olig(dT) 18 primer (0. 5 μ g/ μ L)、RNase-free ddH20 加至 12 μ L,混勻后离心；2) 65°C温浴5min，冰上冷却；3)依次加入 4 μ L5 X Reaction BufferU μ L RiboLockRNase Inhibitor (20U/ μ L)>2μ L dNTP Mix(IOmM)，1 μ L RevertAidM-MuLV ReverseTranscriptase(200U/ μ L)，混勻后离心；4) 42°C温浴60min，而后70°C温浴5min，冰上冷却，置_20°C冰箱保存备用。5. CmFT基因全长的克隆A. CmFT基因保守区序列的获得根据设计好的引物列表中FT同源基因的序列设 计引物FT-F和FT-R，以已经合成的cDNA为模板进行PCR扩增；B. CmFT基因 3，端 RACE序列的获得使用 Takara 3'-Full RACE Core SetVer. 2. 0 试剂盒扩增CmFT基因3’端序列，其中CmFT基因3’端的扩增引物为引物设计列表中的一 对正向引物CmFT3' -Fl和CmFT3' _F2，按照试剂盒使用说明书分别进行3’ RACE巢式扩 增；C. CmFT 基因 5，端 RACE 序列的获得采用 SMARTRACE cDNAAmplification Kit(Clontech)扩增CmFT基因5’端序列，其中CmFT基因5’端的扩增引物为引物设计列表 中的一对反向引物CmFT5 ‘ -Rl和CmFT5 ‘ -R2，进行5，RACE扩增；D. CmFT基因全长的获得与序列分析根据CmFT基因保守区、3’端和5’端RACE序 列拼接结果设计一对跨越ORF框的特异引物CmFT-F和CmFT-R，以已经合成的cDNA为模板 进行PCR扩增，回收特异片段，并进行T-A克隆与测序。
PCR反应体系
__体积W
5 χ Green Buffer5.0
MgCl2(25 mM)2.0
Taq(5U/pL) Total
0.15 252) PCR扩增程序如下PCR反应条件 6. CmFT基因组内含子的扩增根据已报道的FT同源基因外显子及内含子特征，设计跨越可能存在的三个内含 子区域的引物，分别为 CmFT-Fl 与 CmFT-Rl、CmFT-F2 与 CmFT_R2、CmFT_F3 与 CmFT_R3，进行 CmFT基因内含子的扩增。7.回收PCR产物特异片段，并进行T-A克隆与测序A. PCR产物的回收采用Tiangen离心柱型普通凝胶回收试剂盒，按照产品说明书方法略加修改，室 温条件下操作，具体步骤如下1)离心柱预平衡向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L平衡液 BL，12000r/m离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入无菌离心管中，称取重量。3)向胶块加入3倍提交溶胶液PN:当回收的目的片段< 150bp时使用6倍体积溶 胶液PN(如凝胶重为0. Ig,其体积可视为100 μ L，依次类推)。50°C水浴放置lOmin，其间 不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶胶块，可再补加一些溶胶 液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解，室温下冷却。
4)将上一步所得溶液加入一个预平衡吸附柱CA2中，室温放置2min，12000r/m离 心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。5)向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000r/m离心30s， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中，重复漂洗一次。注如果回收的DNA是 用于平末端连接实验或直接测序，在加入PW时选择静置5min后再离心。6)将吸附柱CA2放回收集管中，12000r/m离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CA2置于室温放置5 lOmin，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。7)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓 冲液EB，室温放置2 5min，12000r/m离心2min收集DNA溶液。B. PCR产物的克隆与鉴定1)大肠杆菌感受态细胞的制备a)-80°C保存的Escherichia coli T0P10接种于LB固体培养基上，37°C培养1620h。b)挑取固体培养基平板上新活化的单菌落接种于IOmL LB液体培养基中，37°C振 荡培养10 12h。c)取ImL新鲜菌液转接于IOOmL的LB液体培养基中，37°C继续振荡培养2. 53. 0h，使 OD6tltl 在 0.60.9。d)将新鲜培养液转入预冷的50mL离心管中，置冰上20min，4°C，5000r/m离心 IOmin0e)弃上清，加预冷的0. IM CaCl220mL，轻轻吹打，冰上放置30min，4°C下5000r/m 离心IOmin0f)弃上清，加入2. 5mL预冷的含20 25%甘油的0. IM CaCl2溶液，轻轻吹打混 勻，按每管100 μ L分装，-80°c保存备用。2) PCR产物与T载体的连接与转化a)在冰浴的PCR管中配制下列反应溶液，总体积为10. 0 μ L，混勻，16°C连接反应 过夜。 取5μ L加入至50μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受态细胞，冰中静置30min。b)42°C温浴90s，取出立即置于冰中静置3min。c)加入400yL 37°C预热的无抗生素LB液体培养基，37°C，150r/m振荡培养45min。d)取 100 μ L 菌液加入预先涂有 16 μ L 的 5% IPTG、40 μ L 的 2% X-gal 的 LBApr 固 体琼脂平板培养基上培养13h或过夜，形成蓝白斑单菌落。3)重组子筛选及插入片段的菌液PCR检测挑取白斑单菌落，接菌于LB-液体培养基中，37°C，150r/m，振荡培养8h或过夜。 菌液PCR反应液体系及反应条件同以cDNA或DNA为模板的PCR反应液体系及反应条件相 同。8. CmFT基因生物信息学分析分析CmFT基因全长序列所翻译的氨基酸序列，并与拟南芥FT/TFL1家族和部分双 子叶植物的同源序列进行比对。使用MEGA 4.0软件按邻接法构建双子叶植物FT类似蛋白 系统进化树。实验结果1.菊花CmFT基因cDNA全长的获得本发明根据GenBank 核酸数据库和 EST 库(http//www, ncbi. nlm. nih. gov/ Genbank/)中检索FT同源基因序列，用在线Blast软件分析它们的同源性。依据FT同源 基因的保守区域，通过Oligo 6、Primer Premier 5软件分别设计一对引物FT-F和FT-R， 预计扩增出FT cDNA保守区片段的大小为180bp与900bp左右。将PCR产物回收、纯化后 进行T-A克隆，菌液PCR检测后进行测序，获得了大小分别为183bp和890bp的保守区序 列。根据已知FT同源基因保守区序列分别设计了正向特异引物CmFT3' -Fl和巢式引物 CmFT3 ‘ -F2，分别与 Takara 3，-Full RACE Core Set Ver. 2· 0 试剂盒接头引物 3，RACE Outer Primer,3' RACE Inner Primer进行巢式PCR扩增，分别获得了菊花FT同源基因3’ 端序列大小为386bp和307bp。根据已知FT同源基因保守区序列分别设计了反向特异引物 CmFT5 ‘ -Rl 和巢式引物CmFT5' -R2，分别与 Clontech SMARTRACE cDNA Amplification Kit试剂盒接头引物UPM、NUP进行PCR扩增，对特异产物进行T-A克隆并测序，获得了目的 大小分别为370bp和403bp的5，端序列。根据所获得的菊花FT同源基因保守区、3，RACE 和5，RACE序列拼接结果设计一对特异弓I物CmFT-F和CmFT-R，进行PCR扩增，对特异条带进 行回收纯化、T-A克隆后进行测序，获得了大小为623bp的全长序列(其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示)，进一步验证了 3’与5’端扩增序列同属一个基因来源(命名为CmFT)。2.菊花FT基因结构分析根据已报道的FT同源基因外显子及内含子特征，分别在所获得的菊花FTcDNA全 长序列内设计三对引物，以菊花基因组DNA为模板，进行PCR扩增。为了对扩增产物的序列 进行拼接，三对引物跨过的cDNA序列均有部分重叠区域。三对引物扩增出三条长度分别为 310bp、1600bp、700bp左右的条带。根据得到的序列与已知cDNA序列进行拼接显示菊花 FT基因组转录区全长为2812bp，由3个内含子和4个外显子构成。内含子一长为116bp，内 含子二长为1545bp，内含子三长为626bp，剪切位点符合“GT-AG”法则；3. CmFT生物信息学分析根据所获得CmFT全长序列的测序结果，通过DNAman软件分析表明该基因包含一 个开放阅读框525bp，编码174个氨基酸和一个终止子。BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi)比对分析表明，该基因与杨属(Populus)、葡萄(Vitis vinifera)等大多数双子叶植物FT同源基因的同源性可达75%以上。通过氨基酸序列比对发现CmFT中 包含区分FT和TFLl蛋白亚家族的关键氨基酸残基酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)和14个保守 氨基酸基序(LGRQTVYAPGffRQN)和LYN/IYN三联体蛋白序列(Ahn et al.，2006)。实施例2. CmFT因的遗传转化利用植物表达载体pBI121为基本骨架，构建了 CmFT正反义表达载体，分别命名 为pBI-CmFTf和pBI-CmFTr。正义表达载体pBI-CmFTf在目的基因两端引入特异性酶切位 点Xba I与Sma I，反义表达载体pBI_CmFTr在目的基因两端引入反向酶切位点Sma I与 Xba I，通过RT-PCR对目的基因CmFT进行高保真扩增，连接到pGM_T中间载体，分别双酶切 PBI121和中间载体，回收载体大片段和目的片段，然后进行定向粘端_平末端的连接及酶 切鉴定。1.目的片段的扩增根据CmFT基因序列，设计合成跨越CmFT ORF的正义和反义两对分别含Xba I与 Sma I酶切位点的引物。正义引物对跨度622个核苷酸，反义引物对跨度624个核苷酸。引 物序列如下正义引物对primer1 :5' -CGTCTAGAGCCCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 2:5' ~AACCCGGGTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘反义引物对primer3 :5' -TTCCCGGGTCTCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 4:5' ~ATTCTAGACCTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘粗体划线部分表示在引物5’端引入酶切位点。1)反应体系如下PCR反应体系

2) PCR扩增程序如下PCR反应条件2. PCR回收产物与pGM-T的连接与转化a) PCR离心管中配制反应溶液(表5_1)，混勻离心，16°C连接反应过夜。b)取 5 μ L 连接产物 pGM-CmFTf 或 pGM-CmFTr 加至 50 μ L Ε. coliTOPIO 感受态细 胞中，冰中静置30min。c)42°C温浴90s，取出立即置于冰中静置3min。d)加入400 μ L无抗生素LB液体培养基，37°C，150r/m振荡培养45min。 e)取 100 μ L 菌液加入预先涂有 16 μ L 5% IPTG、40 uL 2% X-gal 的 LBApr 固体琼 脂平板培养基上培养12h或过夜，形成蓝白斑单菌落。3.质粒 DNA 的提取(TIAN prep Mini 试剂盒)a)柱平衡步骤向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L的平衡液 BL，12，000r/m离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。b)取1 5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12，OOOr/ m离心lmin，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管 中)。c)向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ L溶液Pl (请先检查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意如果有未彻底混勻的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。d)向离心管中加入250 μ L溶液Ρ2，温和地上下翻转6_8次使菌体充分裂解。注 意温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片 断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清 亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。e)向离心管中加入350 μ L溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混勻，此时 将出现白色絮状沉淀。12，000r/m离心lOmin，此时在离心管底部形成沉淀。注意P3加入 后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。f)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管 中)，注意尽量不要吸出沉淀。12，OOOr/m离心30 60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。g)向吸附柱CP3中加入50(^1^去蛋白液卩0，12，00017/111离心30 608，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。h)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m离心30 60s，倒掉收集管
中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。i)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m离心30 60s，倒掉收集管
中的废液。j)将吸附柱CP3放入收集管中，12，000r/m离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂
洗液去除。k)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50100 μ L洗脱缓冲液ΕΒ，室温放置2min，12，000r/m离心Imin将质粒溶液收集到离心管中。4.质粒的酶切提取质粒DNA 并用 Sma I 和 Xba I 分别单酶切 pGM-CmFTf、pGM-CmFTr 和 pBI121 质粒DNA。取200 μ LPCR离心管，依次加入以下试剂 25°C条件下先用Sma I酶切3 4h，然后在原体系中加Xba I于37°C下继续酶切 34h。5.酶切产物的回收及检测6.酶切产物的连接与转化a)在PCR离心管中配制下列反应溶液，混勻离心，在22°C连接反应2h，继而在4°C 连接反应48h。
质粒DNA IOx NEB Buffer 4 Sma I 或 Xba I
BSA CldH2O (双蒸水) Total
20 5 2
0.5 22.5 50
组分
体积OiL)
目的片段 IOx Ligation Buffer pBI121酶切回收产物 T4 DNA Ligase(3U L) Totalb)取_80°C保存的50 μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受态细胞，冰上融化。c)加入5μ L连接产物，轻轻旋转混勻，冰浴30min。d)42°C热击 90s，迅速冰浴 3min。
e)加入400 μ 1不含抗生素的液体LB培养基，37°C振荡培养45min。f)取150 200 μ 1培养液涂布于固体LB培养基上(含100 μ g/mL Kan)，37°C培 养16 24h。7.重组质粒的筛选与鉴定无菌条件下，随机挑取含100 μ g/mL Kan的LB平板上的单菌落，接种于IOmL含 100 μ g/mL Kan的液体LB培养基中，37°C振荡培养10 12h。通过PCR初步确定为阳性克 隆，再继续做酶切鉴定，并把含阳性克隆的菌液加甘油(终浓度25%)于-80°C保存备用。根据正义引物对(primer 1和primer 2)，反义引物对(primer 3和primer 4)分 别对正义表达载体ρΒΙ-CmFTf和反义表达载体pBI-CmFTr进行PCR鉴定a) PCR反应体系注*视不同引物略有改动。8.重组植物表达载体导入受体农杆菌A.农杆菌感受态的制备1)从平板中挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于含100 μ g/mL利福平的IOmL LB液 体培养基中，28°C，200r/m震荡培养约20h。2)把上述培养过夜的培养物按1100转接入液体LB培养基中，28°C，200r/m继 续震荡培养约4 6h，使农杆菌OD6tltl值约为0. 3 0. 5。3)将菌液倒入预冷的无菌离心管中，冰浴20 30min，4°C，5000r/m离心lOmin，
弃上清。4)加入 20mL 预冷的 0. IM CaCl2 和 0. 05M MgSO4 液，悬浮菌体，冰浴 30min。4°C，
145000r/m离心lOmin，弃上清。5)加入预冷的ImL含20 25%甘油的0. IM CaCl2和0. 05M MgSO4溶液，悬浮菌 体。按每管150 μ 1分装于离心管中，液氮速冻1 2min，于-80°c保存备用。B.液氮冻融法转化农杆菌取_70°C保存的农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上融化，分别加pBI-CmFTf、 pBI-CmFTr质粒DNA5 μ 1于感受态细胞中，旋转混勻，冰浴30min，液氮中速冻lmin，37°C 热击5min，迅速放置冰上2min，然后加入800 1000 μ 1液体LB培养基(不含抗生素)， 280C 140 160r/m振荡培养4 5h使农杆菌复苏。取300 μ 1培养液均勻涂布于含IOOyg/ mL利福平和100 μ g/mL Kan的平板上，待菌液被培养基吸收后倒置培养皿，28°C暗培养2d 左右ο9.阳性克隆的筛选和鉴定当单菌落长出后，随机挑取单菌落接种于含100 μ g/mL利福平和100 μ g/mLKan的 液体LB培养基中，于28°C，200r/m振荡培养1 2d，做PCR和酶切鉴定。实施例3.对光敏感基因CmFT的应用1. CmFT导入拟南芥进行功能验证采用哥伦比亚生态型拟南芥(A. thaliana ecotype Columbia)作为转化群体，栽 植于泥炭与蛭石(体积比为11)的混合生长介质中，置于培养温度为22 24°C，湿度 为60 70%，光照周期为16h/8h (光/暗)，光照强度为30001UX的光照培养箱中。把已 构建好的植物表达载体pBI-CmFTf的农杆菌株LBA4404采用花器浸泡法转化模式植物拟南 芥，筛选抗性植株，并进行分子鉴定和表型分析。1)分别以拟南芥总DNA、阴性对照野生型拟南芥总DNA、阳性对照质粒DNA为模板， 在 CmFT 和 GUS 内部设计一对特异引物 CmFT-⑶Sl CAGCGACAACAGGAGCACAG 和 CmFT-⑶S2ACCGCATCGAAACGCAGCAC 进行 PCR 扩增反应。按 Promega GoTaq Flexi DNAPolymerase 使用 说明，建立反应体系，进行电泳分析，结果显示阴性对照无扩增条带，阳性对照质粒能扩增 出605bp的条带，在所检测的14个抗性植株中，有12株能扩增出与阳性对照大小相符的条 带，为PCR阳性植株，但有2株存在假阳性，初步表明CmFT已经转入拟南芥基因组中，获得 了转基因植株；2)将转基因子代Tl和对照野生型拟南芥种子播种于泥炭与蛭石(体积比为 11)的混合生长介质中，于长日照16h/8h(光/暗)和短日照8h/16h(光/暗)条件下 培养，培养温度为22 24°C，湿度为60 70%，光照强度为30001ux。通过观察和比较发 现，无论在长日照(LD)或短日照(SD)条件下，拟南芥转化植株Tl代种子播种苗的花期与 野生型拟南芥相比，其花期均提前，在短日照条件下可提前7d开花，在长日照条件下提前 8d开花，拟南芥莲座叶的叶片数相应地减少，在SD和LD下转化植株均少于野生型拟南芥， 然而，转CmFT拟南芥花序及花结构表型与野生型拟南芥未观察到有明显变化。2. CmFT转化菊花的应用选取地被菊品种‘玉人面’和‘美矮粉’(种植于北京林业大学胖龙温室)，取脚芽 嫩枝上部茎段，用自来水冲洗10 15min，75%乙醇消毒30s，0. 1 %升汞消毒6min，无菌水 洗涤3 4次，接种于MS培养基上诱导茎段腋芽萌发，20d后接种无菌茎段于生根培养基获 得无菌苗作为转化群体。建立了短日照菊品种‘美矮粉’的高效再生体系及选择压临界浓度，利用已构建好的正反义表达载体pBI121-CmFTf和pBI121_CmFTr通过农杆菌介导法转 化菊花植株，利用抗生素筛选抗性植株并进行分子的初步鉴定。结果分别获得了 8和10株 转基因植物，与野生型相比，过表达转基因植株的开花期显著提前，而抑制表达转基因植株 的开花期显著延迟。
权利要求
菊花光周期敏感蛋白CmFT，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的菊花光周期敏感基因CmFT。
3.如权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求2或3所述基因在菊花品种选育中的应用。
7.权利要求2或3所述基因在调节拟南芥或菊花开花周期中的应用。
全文摘要
本发明涉及菊花光周期敏感型基因CmFT，同时涉及CmFT基因在菊花光周期敏感性中的应用。本发明采用同源基因克隆法结合RACE技术，从菊花中分离了FT同源基因CmFT，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，CmFT属于FT亚家族成员。CmFT与菊花光敏感性相关，通过遗传转化，将基因转入模式植物拟南芥和普通菊花品种，结果表明，该基因能够调节菊花的光周期，促进开花。
文档编号C12N5/10GK101921322SQ201010255730
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者张启翔, 潘才博, 石少川, 蔡明 , 高亦珂 申请人:北京林业大学