菊花花发育基因CmCO的克隆及其应用的制作方法

专利名称：菊花花发育基因CmCO的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及菊花(Chrysanthemum morflorium)花发育基因CmCO的克隆、功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
菊花是我国传统名花，也是世界四大切花之一。目前通过光周期调节花期技术进行周年生产，并常年供应市场。但由于菊花是短日照花卉，为周年生产而采取的春、夏季遮光和冬季补光等花期调控措施，造成大量的人力、物力和财力的浪费，制约了菊花产业快速发展，通过转基因技术培育光周期不敏感菊花新品种具有重要的理论和实践意义。CO是成花的重要计时基因，其产物达到一定域值时，显著地促进成花相关基因的表达(Onouchi H et al.，2000)，另外CO也可能具有直接促进花发育的作用(Samach A et al.，2000)。CO基因是Putterill (1995)采用图位克隆的方法分离到的，编码锌指蛋白转录因子，它在光周期调控中起关键作用，是感受外界光照和开花的桥梁。过量表达CO可以使拟南芥无论日照长短均可提前开花(Putterill J, 19995 ；Samach A et al. ,2000)高水平积累的CO蛋白激活了 FT基因的表达，从而促进拟南芥在长日条件下开花(Samach A et al.，2000)。Onouchi等Q000)发现由花椰菜花叶病毒35S启动子组成型表达CO会诱导早开花和丧失光周期敏感性。拟南芥CO突变体表现为长日照开花延迟，一些异源CO基因 (如短日照植物牵牛花PnCO基因和长日照植物萝卜&iC0基因)转入拟南芥CO突变体中， 可以使CO突变体恢复到正常表型，显示了植物CO类似基因在开花时间控制途径上的保守性和重要性(Robert et al. , 1998 ；Liu et al，2001)。随着分子生物学的发展，利用基因工程手段对花卉进行改良育种在近十几年也得到了迅速的发展。菊花的基因工程起步较晚，早期的研究主要是建立有效的菊花再生体系和探讨遗传转化中的各种因素对转化的影响，转入的基因主要是NPT IKKarle R等，1993) 和⑶S(BoaSe M R等，1998)报告基因。后期则以转入目的基因为主，旨在通过对菊花定向改良性状的研究，拓展菊花新品种。目前研究者已经从30余个物种中克隆到CO同源基因并对其序列特征、表达模式和功能特性进行了研究。

发明内容
为利用转基因技术调控植物开花时间，本发明提供了一种菊花花发育基因CmCO 及其在观赏作物中的应用，可以用来调控植物的花期。本发明从菊花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据GenBank中已发布的其它植物中CO基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 筛选重组子，进行序列分析。然后通过3'和5'末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术分别获得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA 的3'和5'端序列设计特异引物，以菊花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为CmCO。 该基因的全长cDNA为U89bp，其中开放阅读框部分为1149bp。由此推得，该基因具有382个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的!^aCO(Fragaria ananassa, ACJ06578)、PsCOL(Pisum sativum, AAX47172) > AtCO(Arabidopsis thaliana, NP_197088. 1)相比，氨基酸同源性分别为65. 8 %、62. 0%、55. 6 %。由此表明，经过上述克隆步骤得到了菊花花发育的基因CmCO。 该基因序列如下 序列表
(I)SEQ ID NO. 1 的信息
(a)序列特征 *长度1298碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源菊花(Chrysanthemummorflorium)
(f)序列描述:SEQID NO. 11ATGTTGMACMGAGAGTAACATTAACGCTAGTGGAGCGAACAGTTGGGCACGACTCTGT
61GACACATGCCGGTCAGCTCCCTGCACCGTGTATTGCCGAGCAGATTCTGCCTACTTGTGC
121GCCGGCTGTGATGCCCATGTTCACGCTGCCAATCGTGTTGCTTCCCGCCATAAACGCGTC
181AGGGTCTGCGAGGCGTGTGAGCGTGCTCCAGCTGCTTTTTTATGTAAGGCAGATGCAGCC
241TCTCTTTGCACCGCCTGTGATGCAGATATTCACTCTGCAAACCCTCTTGCACGACGCCAC
301CMCGTGTCCCGGTTATTCCTATTTCAGGGTCTACGTATGAATCTCAAGGCAGGTTTTTT
361CCCCAAGGGTCAGACGGAACTGTTAATAAAGAAGMGAAGACGAAGCAGCGTCGTGGCTG
421CTATTCGATACTCCTGCTAAMACAACCAAAACCMGAATATACGAACGAGTTTTTGTTT
481AATGGAGAGGGGGGTGTAGATGAGTATTTGGATCTTGTGGACTACAATTCTTGTCAAGAT
541ACTCAGTTTAGTGATGATCATAAATGCAATAATTTGCAATTTAATGATGACTATAAGTAT
601ACGAATGATGTTACTAATTATAGTAAGGATATGCGGAAGTATGGCAGAGGTGATGCAGAT
661AGCGTAGTGCCAGTTGGAGGTGGAGAGGCTAAGAAGGAGCATCAMTTTATGATCTTAAC
721TTCCAACATCMAAATTTCAATTGGGATGTGATTATGAGGCTTCMATGGTGGCTACAGC
781TACCCTGCTTCACGTGGTCATAGTGTTTCTATGTCATCACTGGATGTTGGAGTAGTACCA
841GMTCTTCAATCTCAAGTTCMGATCTTCAAAAGGGACAACTGACTTATTCTCAGGTACT
901TCAATTCAGATGCCAACGCAACTTACTCCGTTAGACAGAGAGGCMGAGTCTTGAGTTAC
961AGGGAAMGAAGAAAACAAGMAATTTGAGAAAACGATTAGGTACGCATCTAGMAAGCG
1021TATGCAGAAACAAGGCCTAGGATCAMGGCCGTTTCTCAAAGCGMCAAATGTTGATGTC
1081GAGGTGGATCMATGTTTTCGACAACATTAATGACAGAAGGCGGATACTGTATTGTCCCT
1141TCGTTTTMTGMTGGTTAGGAGCAATAGATGCCAATATTGTAACTGGTTTTTTTCATTC
权利要求
1.一个菊花花发育基因β ⑶，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IN NO. 1所示；其核苷酸编码氨基酸序列如SEQ IN NO. 2所示。
2.一个菊花花发育基因^⑶的应用，其特征在于该基因所编码的蛋白包含B-boxl， B-box2, CCT结构域及COOH区域，可以调控花期，培育对光周期不敏感植物新品种。
3.一个菊花花发育基因^⑶的应用，其特征在于该基因的过量表达能促使菊花提前开花。
全文摘要
本发明涉及菊花花发育基因CmCO的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明从菊花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA；设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应；将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子；然后通过3′和5′末端快速扩增技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以菊花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到菊花花发育基因CmCO。该基因在观赏作物中的应用，可以调控植物的花期。
文档编号A01H5/00GK102229936SQ201110150100
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者孙宪芝, 孙霞, 王文莉, 田素波, 郑成淑, 黄在范 申请人:山东农业大学