专利名称：Dig-10杀虫cry毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的杀虫Cry毒素及其控制昆虫的用途。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, B. t.)是一种土壤传播的细菌，其生成称作德尔塔内毒素或Cry蛋白的杀虫晶体蛋白。Cry蛋白是通过作用于易感昆虫的中肠细胞来发挥功能的口服毒药。已经显示了一胜Cry毒素具有针对线虫的活件。htto //www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/intro. html 处维护和定期更新德尔塔内毒素的广泛列表。西方玉米根虫 / 玉米根萤叶甲(Western corn rootworm, WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)，是一种在经济上重要的玉米害虫，由于作物产量损失和昆虫管理支出，其在北美洲每年引起估计10亿美元收入损失(Metcalf，1986)。WCR管理实践包括与大豆的轮作、化学杀虫剂和新进的表达B. t. Cry蛋白的转基因作物。然而，至今只有少数B. t. Cry蛋白实例提供商业水平的针对WCR的功效，包括Cry34Abl/Cry35Abl (Ellis 等，2002)、经修饰 Cry3Aal (Walters 等，2008)和经修饰 CryiBBbl (Vaughn 等，2005)。这些 B. t.蛋白在转基因玉米的根中生成时高度有效地防止WCR玉米根损伤(Moellenbeck等， 2001 ；Vaughn 等，2005 ；美国专利 No. 7361813)。虽然WCR抗性转基因玉米获得了成功，但是数个因素产生了发现和开发新的Cry 蛋白来控制WCR的需要。第一，尽管转基因玉米植物中当前采用的Cry蛋白的生成针对WCR 根损伤提供有力的保护，由此保护谷物产量，但是在人工侵袭试验中出现了一些WCR成虫， 指示昆虫幼虫控制不够完全。第二，抗性昆虫群体的发生威胁Cry蛋白在根虫控制中的长期耐久性。已经在田地了发生了小菜蛾(Plutella xylostella) (Tabashnik，1994)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) (Janmaat 和 Myers，2003，2005)、和谷实夜蛾(Helicoverpa zea) (Tabashnik等，2008)的对Cry蛋白有抗性的鳞翅类昆虫。可经由数种机制发生对B. t. Cry 蛋白有抗性的昆虫(Heckel等，2007 ;Pigott和Ellar，2007)。已经在昆虫内鉴定了 Cry蛋白的多个受体蛋白类别，而且每个受体类别内存在多个实例。例如可以依靠受体蛋白的钙粘蛋白域的毒素结合部分内的突变发生对特定Cry蛋白的抗性。抗性的另一种手段可以经由原毒素加工蛋白酶介导。鳞翅目物种中对Cry毒素的抗性具有复杂的遗传基础，有至少四种不同的主要的抗性基因。类似地，预测多种基因控制鞘翅目物种中对Cry毒素的抗性。 开发新的高效力Cry蛋白会为WCR管理提供额外的工具。可以在转基因玉米中组合生成具有不同作用模式的Cry蛋白来防止发生WCR昆虫抗性和保护B. t.技术用于根虫控制的长期效用。发明概述
本发明提供杀虫Cry毒素(包括本文中称作DIG-10的毒素以及DIG-10的变体)、 编码这些毒素的核酸、使用该等毒素控制害虫的方法、在转基因宿主细胞中生成该等毒素的方法、和表达该等毒素的转基因植物。SEQ ID NO :2给出野生型DIG-10毒素的预测氨基酸序列。如实施例1中描述的，自Dow AgroSciences LLC内部称作PS184M1的B. t.菌株分离了编码DIG-IO蛋白的核酸。测定了全长编码区的核酸序列，并自该核酸序列推导了全长蛋白质序列。DIG-10毒素与Cry7Ab3 (Genbank登录号ABX2452》和其它苏云金芽孢杆菌 Cry7 型蛋白(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro. html)具有一些相似性。本文中还描述DIG-10毒素的杀虫活性变体，而且统称为DIG-10毒素。DIG-10毒素可以单独使用，或者与其它Cry毒素组合使用，诸如Cry34Abl/ Cry35Abl (DAS-59122-7)、Cry3Bbl (M0N88017)、Cry3A(MIR604)、嵌合 CrylAb/Cry3Aa(FR8A, WO 2009/121633A1)、CryET33 禾Π CryET34、ViplA、Crylla、CryET84、CryET80、CryET76、 CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、和 CryET74，来控制发生抗性鞘翅类昆虫群体。DIG-10毒素也可以与RNAi方法组合使用，来控制其它昆虫害虫。例如，DIG-10可以与用于阻抑玉米根虫中的必需基因或昆虫害虫中的必需基因的dsRNA组合用于转基因植物。此类靶基因包括例如液泡ATP酶、ARF-l、Act42A、CHD3、EF-la、和TFIIB。合适靶基因的一个实例是液泡ATP酶，如W02007/035650中披露的。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-10毒素多肽，其包含选自下组的核心毒素区段(a)包含SEQ ID NO 2残基97至631的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO 2残基97至631的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO 2残基97至631的氨基酸序列及多至20个基酸的对由SEQ ID NO 2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-10毒素多肽，其包含选自下组的DIG-10核心毒素区段(a)包含SEQ ID NO 2残基1至631的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO :2残基1至631的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列多肽；(c)包含SEQ ID NO :2残基1至631的氨基酸序列及多至20个氨基酸的对由SEQ ID NO 2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-10毒素多肽，其包含选自下组的DIG-10核心毒素区段(a)包含SEQ ID NO 2残基1至1131的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO 2残基1至1131的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO :2残基1至1131的氨基酸序列及多至20个氨基酸的对由SEQ ID NO 2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的DIG-10毒素多肽，其包含选自下组的的DIG-10核心毒素区段(a)包含SEQ ID NO 2残基97至1131的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO :2残基97至1131的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO 2残基97至1131的氨基酸序列及多至20个氨基酸的对由 SEQ ID NO :2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种植物，其包含DIG-10毒素。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于控制害虫群体的方法，其包括使所述群体与杀虫有效量的DIG-10毒素接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其编码DIG-10毒素。在另一个实施方案中，本发明提供一种DNA构建体，其包含可操作连接至启动子的编码DIG-10毒素的核苷酸序列，该启动子不是自苏云金芽孢杆菌衍生的且能够在植物中驱动表达。本发明还提供一种转基因植物，其包含稳定掺入其基因组中的DNA构建体和一种用于针对害虫保护植物的方法，其包括将该构建体导入所述植物中。序列简述SEQ ID NO 1 编码全长 DIG-10 毒素的 DNA 序列；3393nt。SEQ ID NO :2 全长 DIG-10 蛋白序列；1131aa。SEQ ID NO 3经玉蜀黍优化的DIG-10核心毒素编码区；1893nt。SEQ ID NO :4CrylAb 原毒素区段；545aa。SEQ ID NO 5 嵌合毒素=DIG-IO 核心 /CrylAb 原毒素区段；1176aa。SEQ ID NO 6经双子叶优化的编码CrylAb原毒素区段的DNA序列；1635ntSEQ ID NO 7经玉蜀黍优化的编码CrylAb原毒素区段的DNA序列；1635nt发明详述DIG-10毒素，和杀虫活性变体。在SEQ ID NO 2的全长DIG-10毒素之外，本发明涵盖杀虫活性变体。通过术语“变体”，申请人意图包括片段、某些删除和插入突变体、和某些融合蛋白。DIG-10是一种经典的三域Cry毒素。作为描述本发明中包括的DIG-10毒素变体的前言，简要回顾一般的三域Cry毒素和特殊的DIG-10蛋白毒素的结构会是有益的。大多数苏云金芽孢杆菌德尔塔-内毒素晶体蛋白分子由两个功能性区段构成。 蛋白酶抗性核心毒素是第一个区段，而且对应于该蛋白质分子的大约前一半。完整的 130kDa原毒素分子被昆虫肠中的蛋白酶快速加工成抗性核心区段。被此加工删除的区段在本文中称作“原毒素区段”。认为原毒素区段参与毒素晶体形成(Arvidson等，1989)。通过降低蛋白酶对毒素分子的加工(Haider等，1986)或通过降低毒素溶解度(Aronson等， 1991)，原毒素区段可能如此通过限制核心对昆虫的可及性而赋予毒素以部分昆虫特异性。即使在某一个类别内，B. t.毒素在长度方面和在核心毒素部分至原毒素部分的过渡的精确位置方面有一定程度的变化。核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会位于全长毒素的约 50%至约60%之间。SEQ ID NO :2公开全长DIG-10多肽1131个氨基酸的序列，其中N端 631个氨基酸构成DIG-10核心毒素。SEQ ID NO :1的5'端1893个核苷酸是核心毒素的编码区。已经为 CrylAal、Cry2AaU Cry3AaU Cry3BbU Cry4Aa, Cry4Ba 和 Cry8Eal 测定了三维晶体结构。核心毒素的这些结构非常相似，而且由具有下文所述特征的三个不同域构成(综述见de Maagd等，2003)。域I是一束七个α螺旋，其中螺旋5被六个兼性螺旋包围。此域涉及孔形成，而且与其它孔形成蛋白共享同源性，包括溶血素和大肠杆菌素。DIG-10蛋白的域I包含SEQ ID NO 2的氨基酸残基36至沈2。域II由在β柱中填充到一起的三个反向平行的β片层形成。此域的环在结合昆虫中肠受体中发挥重要作用。在CrylA蛋白中，在域II β片层的顶点处表面暴露的环涉及结合鳞翅类钙粘蛋白受体。Cry3Aa域II环以相似方式结合马铃薯叶甲/科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say, Colorado potato beetle)的膜结合金属蛋白酶(Ochoa-Campuzano等，2007)。域II与某些碳水化合物结合蛋白共享同源性，包括卵黄磷蛋白(vitelline)和榴莲凝素(jacaline)。DIG-10蛋白的域II包含SEQ ID NO :2的氨基酸残基267至476。域III是两个反向平行的β片层的β三明治。在结构上，此域涉及诸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白质的碳水化合物结合域。域III结合某些类别的受体蛋白，而且可能参与与第二类别的受体相互作用的寡聚毒素前孔的插入，在CrylA蛋白的情况中，实例有氨肽酶和碱性磷酸酶(Hon6e等，1991 ；Pigott和Ellar，2007)。鞘翅目中的类似Cry域III受体仍有待鉴定。保守的B. t.序列段2和3分别位于域II的N端和C 端附近。因此，这些保守的序列段2和3是三个功能域之间的大致边界区。已经为工程化重组B.t.毒素开发了这些具有保守DNA和蛋白质同源性的区(美国专利似.6，090，931; W091/01087 ；WO 95/06730 ；WO 1998022595)。DIG-10 蛋白的域 III 包含 SEQ IDNO 2 的氨基酸残基486至629。已经报告了域I的α-螺旋1在受体结合后被消除。Aronson等(1999)证明了结合至BBMV的CrylAc受到保护免于刚好在α -螺旋1后面的残基59处开始的蛋白酶K切割； 为CrylAb引用了相似的结果。Gomez等Q002)发现了在BBMV受体结合时形成的CrylAb 寡聚体缺少域I的α -螺旋1部分。还有，Soberon等Q007)显示了 CrylAb和CrylAc的缺少在三维Cry结构上涵盖α -螺旋1的大约60个氨基酸的N端删除突变体能够在钙粘蛋白结合缺失下将分子量约60kDa的单体装配成前孔。报告了这些N端删除突变体对Cry 抗性昆虫幼虫有活性。另外，Diaz-Mendoza等Q007)记载了保留对地中海玉米蛀虫/蛀 ^ ! (Mediterranean corn borer, Sesamia nonagrioides)白勺 舌f生白勺 43kDa 禾口 46kDa 的CrylAb片段。证明了这些片段包括氨基酸残基116至423 ；然而，没有阐明精确氨基酸序列，而且这些蛋白水解片段的活性的机制未知。Gomez等Q002) ；Soberon等(2007)；及 Diaz-Mendoza等(2007)的结果与Hofte等(1986)报告的自CrylAb的N端删除36个氨基酸导致杀虫活性丧失的结果形成对比。
通过比较DIG-10蛋白序列与结构已知的CrySEal蛋白序列，我们已经推导了 DIG-10毒素的域I中螺旋1、2A、2B、和3的起点和终点，及它们之间的间隔区的位置。表1 中描述这些位置。表1。DIG-10蛋白凸出的α -螺旋的氨基酸坐标。
权利要求
1.一种分离的多肽，其包含选自下组的核心毒素区段(a)包含SEQID NO 2的残基97至631的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQID NO 2的残基97至631的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQID NO 2的残基97至631的氨基酸序列及多至20个氨基酸的对由SEQ ID NO 2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。
2.权利要求1的分离的多肽，其包含选自下组的核心毒素区段(a)包含SEQID NO 2的残基1至631的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQID NO 2的残基1至631的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQID NO 2的残基1至631的氨基酸序列及多至20个氨基酸的对由SEQ ID NO 2编码的毒素的表达或活性没有不利影响的替代、删除、或修饰的多肽；或其杀虫活性片段。
3.一种植物，其包含权利要求1的多肽。
4.一种植物，其包含权利要求2的多肽。
5.一种用于控制害虫群体的方法，其包括使所述群体与杀虫有效量的权利要求1的多肽接触。
6.一种分离的核酸，其编码权利要求1的多肽。
7.一种分离的核酸，其编码权利要求2的多肽。
8.权利要求6的分离的核酸，其为SEQID NO :1或SEQ ID NO 3的。
9.权利要求1的多肽，其为SEQID NO 2或SEQ ID NO 5的。
10.一种DNA构建体，其包含可操作连接至启动子的权利要求6的核苷酸序列，该启动子不是源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的且能够在植物中驱动表达。
11.一种转基因植物，其包含稳定掺入其基因组中的权利要求10的DNA构建体。
12.一种用于针对害虫保护植物的方法，其包括将权利要求10的构建体导入所述植物中。
13.权利要求1或2的多肽，其具有针对玉米根虫的活性。
14.权利要求11的转基因植物，其中所述转基因植物包含用于阻抑玉米根虫中的必需基因的dsRNA。
15.权利要求14的转基因植物，其中所述必需基因选自下组液泡ATP酶，ARF-1， Act42A, CHD3, EF-I α，和 TFIIB。
16.权利要求11的转基因植物，其中所述转基因植物包含用于阻抑昆虫害虫中的必需基因的dsRNA。
全文摘要
公开了DIG-10Cry毒素、编码此类毒素的多核苷酸、此类毒素控制害虫的用途、和生成此类毒素的转基因植物。
文档编号C07K14/325GK102439029SQ201080032728
公开日2012年5月2日 申请日期2010年6月14日 优先权日2009年6月16日
发明者A.伍斯利, I.拉里努阿, J.里拉, K.纳瓦, T.海伊 申请人:陶氏益农公司