α-突触核蛋白抗体及其用图
【专利说明】a-突触核蛋白抗体及其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及对a-突触核蛋白聚合体（例如淀粉样纤维、初原纤维或低聚物）具 有高结合亲和力且对a-突触核蛋白低聚物具有低结合亲和力的抗体或其片段。本发明还 涉及这些抗体及片段在诊断、治疗和预防与a-突触核蛋白相关的神经病理中的用途。
[0002] 背景
[0003] 突触核蛋白是小分子蛋白家族，约14kDa，其在神经组织中高水平表达。该家族的 三个成员是a-突触核蛋白、(6-突触核蛋白和y-突触核蛋白。
[0004]a-突触核蛋白主要在脑组织中表达，并主要位于突触前神经元末梢。人类形式的 a_突触核蛋白的一级结构是由140个氨基酸的多肽构成。人类a-突触核蛋白的野生型 序列可见于图20(SEQIDN0:49)。a-突触核蛋白通常以可溶性单体蛋白存在，但根据其 环境可采用若干不同的折叠构象。单体a-突触核蛋白也可以聚合成低聚物和高分子量不 溶性纤维。
[0005] 与突触核蛋白异常相关的疾病通常被称为共核蛋白病（synucleinopathy)。共 核蛋白病包括神经退行性疾病、帕金森氏病（PD)、路易氏体失智症（DLB)和多系统萎缩症 (MSA)。在共核蛋白病中，已表明，在和DLB的脑匀浆中可溶性a-突触核蛋白低聚物与 正常脑相比要高。此外，常常表征和DLB晚期的神经病理性病变（路易氏体）已经基本 上被认为是由纤维状a-突触核蛋白沉积物组成。
[0006] 市售a-突触核蛋白抗体是已知的，并且被广泛地用于表征脑中的病理。然而， 这种抗体是非特异性的，并且既识别a-突触核蛋白的单体形式又识别a-突触核蛋白的 聚合形式，并且无法识别a-突触核蛋白的所有聚合形式。
[0007] 已知的a-突触核蛋白抗体包括Syn-I(BD生物科学（BDBiosciences))和 mAb211 (圣克鲁斯生物技术有限公司（SantaCruzBiotechnology))，已知它们同样结合 a_突触核蛋白的单体形式和聚合形式。
[0008]W02011/104696公开了特异性识别初原纤维形式的a-突触核蛋白的抗体。这些 抗体显示与a_突触核蛋白原纤维和单体的低结合亲和力。
【发明内容】
[0009] 本发明涉及对a_突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对单体形式的a_突触 核蛋白具有低结合亲和力的抗体及其片段。
[0010] 本发明还涉及包含这种抗体或其片段的组合物、使用所述抗体或片段检测a_突 触核蛋白聚合体的存在的方法，以及它们在诊断与a-突触核蛋白相关的疾病中的用途。
[0011] 在其它实施方案中，本发明涉及包含这种抗体或其片段的组合物和使用所述抗体 或片段治疗或预防与a-突触核蛋白的病理相关的疾病的方法。
[0012] 使用对a_突触核蛋白聚合体有特异性的抗体可帮助揭示新的和其它共核蛋 白病的病理。
[0013] 通过产生对a_突触核蛋白聚合体有特异性并对a_突触核蛋白单体具有低结合 亲和力的抗体，本发明提供了跟踪与a-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的进展的新工 具。本发明的抗体还提供了可用于治疗与a-突触核蛋白相关的疾病的抗体。
【附图说明】
[0014] 现在将通过举例并参考附图来说明本发明，在附图中：
[0015] 图1示出如实施例1中所描述的用a-突触核蛋白原纤维免疫的宿主（宿主19、 22和23)和用a-突触核蛋白低聚物免疫的宿主（宿主210、211和212)的效价检测结果。
[0016] 图2示出如实施例2所描述的用于筛选杂交瘤对a-突触核蛋白聚合体（原纤维 (F)、低聚物（0)和单体（M))的特异性的点图（dotplots)结果。
[0017] 图3示出如实施例4所描述的使用抗体Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及对照Syn-I抗体（BD生物科学（BDBiosciences))进行的抑制ELISA的结 果。
[0018] 图4示出如实施例5⑷所描述的抗体Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I与由不同蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性的结果。
[0019]图 5 示出如实施例 5(B)所描述的抗体Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I与由0 -突触核蛋白和y-突触核蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反 应性。
[0020] 图 6 示出如实施例 5 (C)所描述的抗体Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04以及Syn-I与由a-突触核蛋白肽NAC(61-98)、NAC(61-75)和截断型a-突触 核蛋白（1-122)形成的淀粉样纤维的交叉反应性。
[0021] 图7示出如实施例6所描述的使用Biacore的对于单克隆抗体（mAb)Syn-Fl、 Syn-F2、Syn-Ol、Syn-02、Syn-03 和Syn-04 以及mAb211 (圣克鲁斯生物技术有限公司（Santa CruzBiotechnology))的传感图结果。
[0022] 图8示出如实施例7所描述的用于表位确定而通过斑点杂交进行的对于mAb Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04,以及Syn-I抗体（对照）的肽扫描结 果。
[0023] 图9示出如实施例7所描述的通过ELISA进行的肽扫描的结果。用本发明的单克 隆抗体A)Syn-Fl、B)Syn-F2、C)Syn-01、D)Syn-02、E)Syn-03 和F)Syn-04,或者用对照抗体 G)Syn211、H)N-19、I)FL-140、J)Syn-l、K)3B6 和L)5C2 探测板。
[0024]图10示出如实施例7所描述的对放置在肽扫描ELISA的板上的X射线胶片的绘 图。对照抗体119、？1-140、502、3711-1、3711-211、386的绘图示于图10仏）中。本发明的 抗体Syn-Fl、Syn-F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04 示于图 10(B)中。
[0025] 图11示出如实施例8所描述的用于检测a-突触核蛋白聚合体的夹心ELISA的 结果。抗体Syn-Fl、Syn_F2、Syn-01、Syn-02、Syn-03 和Syn-04,以及Syn-I抗体被用作捕 获抗体，FL-140被用作检测抗体。
[0026] 图12示出如实施例9所描述的用于检测磷酸化Serl29-a-突触核蛋白聚合 体的夹心ELISA的结果。抗体Syn-02和Syn-F2,以及Syn-I被用作捕获抗体，并且兔抗 P-S129-a-突触核蛋白被用作检测抗体。
[0027]图13示出如实施例10所描述的来自未患帕金森氏病的受试者的对照病例的组织 的免疫组织化学分析。
[0028] 图14示出如实施例10所描述的来自帕金森氏病病例的组织的免疫组织化学分 析。
[0029] 图15示出如实施例10所描述的来自多系统萎缩病例的组织的免疫组织化学分 析。
[0030] 图16示出如实施例11所描述的来自帕金森载体ro患者（A)、渐进性DLB患者（B) 和典型患者的组织样品中Syn-02染色的结果。
[0031] 图17示出如实施例12所描述的来自海马CA2区（A)和内嗅皮层神经突⑶的脑 切片的处理的用Syn-F2抗体染色的结果。切片进行以下处理：1)未处理，2)在柠檬酸盐缓 冲液中在120°C下高压灭菌10分钟，3)甲酸15分钟，或4)20yg/ml蛋白酶K处理。具有 Syn-I抗体的对照5)在已用甲酸处理15分钟的组织样品上进行。
[0032] 图18示出如实施例14所描述的通过BiFC荧光分析显示形成斑点（箭头）而获 得的图像。
[0033] 图19示出如实施例14所描述的每个测试抗体的斑点阳性细胞的百分比％。
[0034] 图20示出人类a-突触核蛋白的野生型序列。
[0035] 详述
[0036] 本发明涉及对a-突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对a-突触核蛋白单体 具有低结合亲和力的抗体。相比结合a-突触核蛋白单体形式，所述抗体具有提高的结合 a_突触核蛋白聚合体的亲和力。
[0037] 在一个实施方案中，本发明涉及对a-突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对 a_突触核蛋白单体具有低结合亲和力的抗体或其片段。
[0038] 除非另有说明，术语a_突触核蛋白聚合体意图涵盖早期的可溶性聚合体形式的 a_突触核蛋白（例如低分子量和高分子量可溶性低聚物，包括初原纤维）和成熟的不可溶 性聚合体形式的a-突触核蛋白（例如成熟原纤维）。具体而言，所述抗体及其片段具有对 a_突触核蛋白原纤维的高结合亲和力，和对a_突触核蛋白低聚物的高结合亲和力。
[0039] 对a_突触核蛋白聚合体具有高亲和力意思是所述抗体或片段显示对于a_突触 核蛋白聚合体的解离常数Kd小于10 7M。优选地，所述抗体显示Kd小于10SM，或小于10 9M, 或甚至更优选地，Kd小于IOwM,或甚至小于10nM。优选地，所述a-突触核蛋白是人类 a-突触核蛋白。
[0040] 原纤维是不溶性高分子量聚合形式的a-突触核蛋白。
[0041] 可溶性低聚形式的a-突触核蛋白以各种尺寸和形态出现，并包括二聚体、三聚 体、四聚体和多聚体。初原纤维是从单体形式形成a-突触核蛋白原纤维的途径中的中间 步骤。当使用术语低聚形式的a-突触核蛋白时，也意图包括初原纤维。
[0042] 抗体的其片段意思是其活性片段，即具有用于限定根据本发明的抗体的相同特征 的片段，也就是对a-突触核蛋白聚合体有高亲和力且对a-突触核蛋白单体有低结合亲 和力。为方便起见，当使用术语抗体时，也考虑显示相同特征的其片段。
[0043]对a_突触核蛋白单体具有低结合亲和力意思是抗体或片段与a_突触核蛋白单 体的结合比与a-突触核蛋白聚合体的结合小至少100倍，优选地约500倍，或者，与a-突 触核蛋白单体的结合亲和力比与a-突触核蛋白聚合体低1000倍。在一个实施方案中，抗 体或其片段对单体a-突触核蛋白的解离常数Kd大于10 5M。
[0044] 在一个实施方案中，抗体对a_突触核蛋白原纤维的亲和力可以高于对低聚形式 的a-突触核蛋白的亲和力。
[0045] 抗体的结合亲和力可通过使用本领域中认可的各种方法来测定，包括等温量热法 和基于表面等离子体共振的方法，例如实施例6中所描述的。结合也可以使用免疫测定如 酶联免疫吸附测定（ELISA)或放射免疫分析（RIA)来评价。优选地，使用表面等离子体共 振分析利用BIACore?X-100测定结合亲和力。
[0046] 在一个实施方案中，抗体是构象抗体（conformationalantibody)。所述抗体识别 构象表位，即抗体所识别的表位包括a-突触核蛋白的聚合体的三级结构。在一个实施方 案中，相比表5所描述的任何线型肽的表位，抗体结合较强地结合a_突触核蛋白原纤维。 具体而言，抗体与a-突触核蛋白原纤维的结合比与表5所描述的线型肽的表位高至少100 倍，优选500倍以上，或优选1000倍以上。
[0047]本发明的抗体可以弱结合a-突触核蛋白的氨基酸区127-140内的线型表位。弱 结合的意思是本发明的抗体与a-突触核蛋白的氨基酸区127-140内的线型表位的结合亲 和力比抗体与a-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少1〇〇倍，特别是比与a-突触核 蛋白原纤维的结合亲和力小至少100倍。优选地，与a-突触核蛋白的氨基酸区127-140 内的线型表位的结合亲和力比抗体与a-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小1000倍。在 一个实施方案中，所述抗体不识别或不结合a-突触核蛋白的线型表位。
[0048] 在一个实施方案中，被抗体所识别的表位包含a-突触核蛋白的C末端区。识别 包含a-突触核蛋白的C末端区的表位的意思是所述抗体有能力结合的至少部分的表位包 括至少部分的a-突触核蛋白的C末端区。
[0049] 在一个实施方案中，本发明的抗体也可以结合磷酸化a-突触核蛋白的聚合形 式。相比磷酸化a-突触核蛋白的聚合形式，所述抗体显示与磷酸化a-突触核蛋白的单 体形式的低结合亲和力，例如抗体与磷酸化a-突触核蛋白的单体形式的结合亲和力比与 聚合的磷酸化a-突触核蛋白的结合亲和力小至少100倍，优选小500倍，更优选小1000 倍。a-突触核蛋白的磷酸化可发生在Serl29。
[0050] 本发明的抗体还显示与其它淀粉样蛋白的低结合亲和力，所述淀粉样蛋白包括 突触核蛋白、y-突触核蛋白单体、IAPP(胰岛淀粉样多肽）、(6-淀粉样蛋白单体、 Tau(涛蛋白）和ABri，例如抗体与这些肽/蛋白中的一种或多种的结合亲和力比与a-突 触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少100倍。
[0051] 在一个实施方案中，本发明的a-突触核蛋白聚合体抗体与(6-突触核蛋白的结 合亲和力比与a-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少1〇〇倍，优选小1000倍。具体而 言，所述抗体与(6-突触核蛋白的结合亲和力比与a-突触核蛋白原纤维的结合亲和力小 至少100倍，优选小1000倍。
[0052] 在一个实施方案中，本发明的a-突触核蛋白聚合体抗体与Y-突触核蛋白的结 合亲和力比与a-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少1〇〇倍，优选小1000倍。具体而 言，所述抗体与Y-突触核蛋白的结合亲和力比与a-突触核蛋白原纤维的结合亲和力小 至少100倍，优选小1000倍。
[0053] 本发明的其它实施方案提供了在可变重（VH)链和可变轻（VL)链上包含限定的 ⑶R1-3区的氨基酸序列的抗体。
[0054] 在本发明的一个实施方案中，抗体包含可变重链（VH)，其中所述VH包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列。