mAb有免疫反应的神经胶质细胞内含物和市售的小鼠单克隆抗a-突触核蛋 白抗体（Syn-I)或小鼠单克隆抗磷酸化Serl29a-突触核蛋白抗体（phospho-syn)。切片 用甲酚紫（蓝色）复染色，以使细胞核和细胞膜可视化。将相同的亮度调节应用于所有图 像。比例尺代表20ym(应用于所有图）。
[0259] 实施例11
[0260] 用Syn-02抗体测试来自已知患有神经退行性紊乱的患者的脑组织样品。抗体以 1比5000(0.2iig/ml)稀释液使用。在所有患者样品中，抗体均产生强染色。
[0261] 已知患者A患有常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征，其具有杂合性错义突 变结合帕金基因中的杂合性外显子缺失。如图16(A)所示，在突触和细胞进程中观察到低 聚a-突触核蛋白（箭头）。在含少量神经黑色素的神经元的细胞质内可见到非常小的聚 合体（箭状记号）。
[0262] 患者B是渐进性DLB患者。如图16⑶所示，在突触、路易氏神经突样结构和胞外 聚合体中观察到低聚a-突触核蛋白的免疫反应性。
[0263] 患者C具有迟发型先天性帕金森。如图16(C)所示，在路易氏体样胞质内内含物 和路易氏神经突中观察到低聚a-突触核蛋白的免疫反应性。
[0264] 这些结果显示本发明的抗体可用于诊断与a_突触核蛋白相关的神经退行性疾 病。
[0265] 实施例12
[0266] 用Syn-01、Syn-02、Syn-03、Syn-04、Syn-Fl和Syn_F2 抗体测试不同的脑组织样 品切片（海马CA2区、内嗅皮层浅层1-3、内嗅皮层浅层4-6、内嗅皮层神经突）。抗体以1 比5000稀释液使用。脑样品进行以下四种处理的一种：1)未处理，2)在柠檬酸盐缓冲液中 在120°C下高压灭菌10分钟，3)甲酸15分钟，或4)20yg/ml蛋白酶K处理。
[0267] 在4°C下孵育过夜。用含罗姆林（Romulin)作为色原体的组织染色HP试剂盒进行 检测。对照抗体Syn-I以1:1000稀释液使用。用甲酸将用对照抗体测试的组织样品预处 理15分钟。
[0268] 结果显示，甚至在未对脑组织预处理的情况下，抗体也起作用。然而，用预处理使 抗体更好地作用。经蛋白酶K处理的样品显示更好的结果。已知蛋白酶K处理增强异常突 触核蛋白（即胞质内聚合体）的免疫反应性，并降低弥漫性突触染色。在海马CA2区（A) 和内嗅皮层神经突（B)中的对照抗体和Syn-F2抗体的结果示于图17中。
[0269] 实施例13
[0270] 确定对于六种抗体克隆Syn-Fl、Syn_F2、Syn-01、Syn-〇2、Syn-〇3 和Syn-04 的重 链和轻链的可变区的多核苷酸和氨基酸序列。
[0271] 根据技术手册，使用TRIzol?PlusRNA纯化系统（英杰公司（Invitrogen))从 杂交瘤克隆Syn-Fl、Syn_F2、Syn-Ol、Syn-〇2、Syn-〇3和Syn-04中提取RNA。通过琼脂糖凝 胶电泳分析分离的总RNA。
[0272] 根据技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物利用Superscript?III第 一链合成系统将总RNA反转录为cDNA。根据金斯瑞（GenScript)的RACE的标准操作流程 扩增VH和VL的抗体片段。
[0273] 使用标准分子克隆技术将扩增的抗体片段克隆入克隆载体。进行菌落PCR筛选以 鉴定具有正确尺寸的插入的克隆。对每个抗体片段的不少于5种具有正确尺寸的插入的单 一克隆进彳丁测序。
[0274] 确定每个VH和VL区的DNA序列，并确定相应的氨基酸序列。确定每个重链和轻 链可变区的先导序列、框架区（FR1、FR2、FR3和FR4)和互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3)。 结果如图6所示。⑶RU⑶R2和⑶R3多核苷酸和氨基酸序列示于SEQIDNO: 13-48。
[0275] 编码Syn-Fl的VH和VL区的DNA序列分别在SEQIDNO: 1和3中提供。Syn-Fl 的VH和VL氨基酸序列在SEQIDNO: 2和4中提供。Syn-Fl的VH区的CDRUCDR2和CDR3 区分别列于SEQIDNO: 13、14和15。相应的氨基酸序列列于SEQIDNO: 16、17和18中。 Syn-Fl的VL区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQIDNO: 19、20和21。相应的氨基酸 序列列于SEQIDN0:22、23和24中。
[0276] 编码Syn-F2的VH和VL区的DNA序列分别在SEQIDNO: 5和7中提供。Syn-F2 的VH和VL氨基酸序列在SEQIDN0:6和8中提供。Syn-F2的VH区的CDR1、CDR2和CDR3 区分别列于SEQIDN0:25、26和27。相应的氨基酸序列列于SEQIDN0:28、29和30中。 Syn-Fl的VL区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQIDN0:31、32和33。相应的氨基酸 序列列于SEQIDNO:34、35和36中。
[0277] 编码Syn-01、Syn-02、Syn-03和Syn-04的VH和VL区的DNA序列分别在SEQID N0:9和11中提供。Syn-01、Syn-02、Syn-03和Syn-04的VH和VL氨基酸序列在SEQID NO: 10和12和中提供。Syn-01、Syn-02、Syn-03和Syn-04的VH区的CDR1、CDR2和CDR3 区分别列于SEQIDN0:37、38和39。相应的氨基酸序列列于SEQIDN0:40、41和42中。 Syn-Ol、Syn-02、Syn-03和Syn-04的VL区的CDRl、CDR2和CDR3区分别列于SEQIDNO: 43、 44和45。相应的氨基酸序列列于SEQIDN0:46、47和48中。
[0278] 结果发现，Syn-01、Syn-02、Syn-03和Syn-04的VH和VL区的序列是相同的。
[0279] 表 6:
[0280]
(Iink)-aSyn(VlS)或aSynGC(SV2)(由Dr.PamelaMcLean馈赠，马萨诸塞州查尔斯1 镇麻 省综合医院（MassachusettsGeneralHospital，Charlestown，MA))将SH-SY5Y细胞转染。 用600μg/mlG418(英杰公司（Invitrogen),加利福尼亚卡尔斯巴德（Carlsbad,CA))选 择转染的细胞2-3周，直到菌落出现。用200μg/mlG418维持稳定的细胞系。
[0290] 在Iyg/ml正常小鼠IgG或a-突触核蛋白抗体（274、Syn-01、Syn-02、 Syn-Fl、Syn-F2、B11D12、F7A11)的存在下，将稳定过表达融合有维纳斯荧光蛋白（venus fluorescenceprotein)的C末端片段的人类a-突触核蛋白的SV2细胞与过表达被N末 端venus片段标记的a-突触核蛋白的VlS稳定细胞系共培养。在3天孵育后，用奥林巴 斯（东京，日本）FV1000共聚焦激光扫描显微镜分析BiFC荧光。
[0291] 在细胞中观察到色斑（punct)的形成（箭头）。对含有色斑形成的细胞的数量计 数，计算色斑阳性细胞的比例。结果如图18和图19所示。图中指出含有a-突触核蛋白 聚合体的细胞的百分比。本文所述的具体实施例和实施方案本质上仅是示例性的，并不意 图限制本发明。鉴于本说明书的其它实施方案和实施例及其优点对于本领域技术人员而言 将是显而易见的，并在本发明要求保护的范围内。
【主权项】
1. 一种抗体或其片段，所述抗体或其片段对a -突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力 且对突触核蛋白单体具有低结合亲和力。2. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含VH链，其中CDRl区 具有SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 40的氨基酸序列；其中，CDR2区具有SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:41的氨基酸序列；并且其中，CDR3区具有SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:30 或 SEQ ID NO:42 的氨基酸序列。3. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含VL链，其中CDRl区 具有SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 46的氨基酸序列；其中，CDR2区具有SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:35或SEQ ID N0:47的氨基酸序列；并且其中，CDR3区具有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36 或 SEQ ID NO:486 的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含免疫球蛋白重链可变 区（VH)，其中所述VH包含如SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序 列。5. 根据权利要求1所示的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含免疫球蛋白轻链可变 区（VL)，其中所述VL包含如SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序 列。6. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含免疫球蛋白重链可变 区（VH)和免疫球蛋白轻链可变区（VL)，其中，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO: 2和SEQ 10勵:4、3￡〇10勵:6和3￡〇10勵:8，或3￡〇10勵：10和3￡〇10勵：12所示的氨基酸序 列。7. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含： VH 链，其中，CDRl 区具有 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28 或 SEQ ID NO: 40 的氨基酸序 列；其中，CDR2区具有SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:41的氨基酸序列；并且 其中，CDR3区具有SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:42的氨基酸序列；和 VL 链，其中，CDRl 区具有 SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 34 或 SEQ ID NO: 46 的氨基酸序 列；其中，CDR2区具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:47的氨基酸序列；并且 其中，CDR3 区具有 SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36 或 SEQ ID NO:48 的氨基酸序列。8. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述a-突触核蛋白聚合体包括a-突 触核蛋白的初原纤维和/或可溶性低聚物。9. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述a-突触核蛋白聚合体包括a-突 触核蛋白原纤维。10. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段对人类a -突触核 蛋白聚合体的解离常数Kd小于10 7M。11. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段对单体的a -突触 核蛋白的解离常数Kd大于10 5M。12. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体对a _突触核蛋白原纤维的 亲和力高于对低聚形式的a-突触核蛋白的亲和力。13. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段结合包含a _突触 核蛋白的C末端区的表位。14. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段是构象抗体。15. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段不识别a _突触核 蛋白的线型表位。16. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。17. -种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1所述的抗体或其片段和药学 上可接受的稀释剂或载体。18. 权利要求1所述的抗体或其片段，其被用作药物。19. 一种多核苷酸，所述多核苷酸其包含如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9 或 SEQ ID NO: 11 所示的核酸序列。20. -种用于预防或治疗个体中与a _突触核蛋白病理相关的神经退行性紊乱的方 法，所述方法包括对所述个体给药权利要求1所述的抗体或其片段。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述神经退行性紊乱为帕金森氏病、路易氏体 失智症、阿尔茨海默病、多系统萎缩、精神病、精神分裂症或克雅二氏症。22. -种测试试剂盒，其用于确定个体是否患有神经退行性疾病的方法中，所述测试试 剂盒包括根据权利要求1所述的抗体或其片段。23. -种检测a -突触核蛋白原纤维和聚合体的方法，所述方法包括以下步骤： -在生物样品中加入根据权利要求1所述的抗体或其片段；以及 _检测在a _突触核蛋白原纤维和/或聚合体与所述抗体或片段之间形成的复合体的 存在。24. -种用于诊断与a -突触核蛋白相关的神经退行性疾病的方法，所述方法包括： -在来自受试者的生物样品中加入权利要求1所述的抗体或其片段；以及 _检测在a-突触核蛋白聚合体和所述抗体或片段之间形成的复合体的存在或不存 在。25. 权利要求1所述的抗体或其片段，其被用作显像剂。26. -种对a -突触核蛋白聚合体成像的方法，其包括： -对个体给药权利要求1所述的抗体或其片段，以及 -检测所述抗体。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述抗体包括可检测标记物。
【专利摘要】本发明描述了对聚合形式的α-突触核蛋白具有高亲和性且对单体形式的α-突触核蛋白具有低亲和性的抗体。该抗体用于诊断神经退行性疾病。
【IPC分类】C07K16/44, A61K39/395, A61P25/00
【公开号】CN105121473
【申请号】CN201480011360
【发明人】O·埃尔-阿格纳夫
【申请人】阿联酋大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年2月27日
【公告号】EP2961774A1, US20140241984, WO2014132210A1