帕妥珠单抗变体及其评估的制作方法
【专利说明】帕妥珠单抗变体及其评估
[0001] 依照37CFR§ 1. 53 (b)提交的此非临时申请要求2013年4月16日提交的流水号 61/812, 603的美国临时申请依照35USC§ 119(e)的权益，通过援引将其完整收录。
[0002] 序列表
[0003] 本申请含有经EFS-Web提交并通过援引在此完整收录的序列表。2014年4月8日 创建的所述ASCII拷贝的名称为P5584Rl_W0_SeqList.txt且大小为31，363个字节。 发明领域
[0004] 本发明关注帕妥珠单抗（Pertuzumab)的变体。特别地，它关注：在帕妥珠单抗的 一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体，帕 妥珠单抗的无岩藻糖基化变体，帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)，和帕妥珠单抗的高分 子量种类（HMffS)。本发明进一步关注分离的变体，包含变体的组合物，药物组合物，和制品， 以及生成和表征变体及其组合物的方法。
[0005] 发明背景
[0006]帕妥珠单抗（PERJETA? )(也称作rhuMAb2C4)是一种单克隆抗体（MAb)，它 是称作"HER二聚化抑制剂"的一系列药剂中它所在类别的第一种。通过结合HER2,它抑制 HER2与其它HER受体二聚化并由此抑制肿瘤生长。帕妥珠单抗在2012年6月8日收到美 国食品和药品管理局（USFDA)批准用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌。
[0007] 美国专利No. 7, 862, 817 (Adams等人）记载了 2C4抗体的人源化变体，称作人源化 2C4型式574或重组人源化单克隆抗体2C4(rhuMAb2C4)。抗体结合人表皮生长因子受体 2 (HER2)胞外域（E⑶）中的亚域II。以实验室规模生成rhuMAb2C4抗体，并显示结合HER2 并抑制MDA-175细胞（其以1+水平表达HER2)和植入小鼠中的MCF7异种移植物生长。还 可参见Adams等人，CancerImmunol.Immunother. 55 (6) :717-727 (2006) 〇
[0008] 美国专利No. 6, 339, 142 (Blank和Basey)记载了包含抗HER2抗体及一种或多种 其酸性变体的混合物的HER2抗体组合物，其中酸性变体的量小于约25%。人源化单克隆抗 体4D5变体8 (humMAb4D5_8或曲妥珠单抗（Trastuzumab))是例不的HER2抗体。
[0009] 美国专利No. 7, 560, 111，美国专利No. 7, 879, 325,和美国专利No. 8, 241，630(Kao 等人）记载了在抗体的一条或全部两条轻链中包含氨基末端前导延伸（VHS-)的帕妥珠单 抗变体（rhuMAb2C4)，即所谓的"VHS-变体"。在于天然条件使用Ellman氏分析对参照材 料（I期），LotS9802A(II期），和400L规模工艺开发材料测试游离硫醇时，在测试的所有 材料中游离硫醇水平低于检测限度。测试的组合物中1-2%的帕妥珠单抗是无岩藻糖基化 (GO-F)的，如通过毛细管电泳（CE)测定的。参见美国专利No. 7, 560, 111 (Kao等人）的表 5〇
[0010] WO2009/099829 (Harris等人）记载了帕妥珠单抗的酸性变体，包括：脱酰胺变 体，糖化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，和唾液酸化变体。如披露的，变体表征如 下：
[0011] 表I:TO2009/099829(Harris等人）中的酸性变体
[0012]
[0013] CEX=阳离子交换。CE-SDS=具有十二烷基硫酸钠的毛细管电泳。
[0014] WO2009/099829 (Harris等人）中用于表征二硫化物还原变体的实验方法（即对 完整抗体的非还原CE-SDS)评估还原的链间二硫键，而非链内二硫键。
[0015] Zhang等人，Anal.Chem. 84(16) :7112-7123(2012)报告了在其可变重（VH域）中 具有未配对半胱氨酸（Cys22和Cys96)的重组抗体（mAbA)。发现未配对半胱氨酸对抗体 结合CD20没有显著影响，而且具有未配对半胱氨酸的mAbA在效力测定法（补体依赖性细 胞毒性，CDC，测定法）中是有完全活性的。
[0016] 10 20〇9/0〇9523(1^〇等人）披露了结合0)2〇的〇(^6(3112111^13(浊11嫩13 2117)抗体 的重组生产期间链间二硫键还原的阻止。
[0017] Harris，R.，Dev.Biol. (Basel，Switzerland) 122 :117-127(2005)披露了 omalizumab(-种人源化抗IgE抗体）的可变重（VH)域中的未配对半胱氨酸（Cys22和 Cys96)。未配对半胱氨酸形式具有显著更低的效力。
[0018] 发明概述
[0019] 本文中的实验数据关注帕妥珠单抗的变体形式，包括未配对半胱氨酸变体，无岩 藻糖基化变体，低分子量种类（LMffS)，和高分子量种类（HMffS)。用于鉴定，表征，和量化这 些变体的手段在用于帕妥珠单抗药物组合物的制造和品质控制方法中是有价值的。
[0020] 如此，在第一个方面，本发明关注包含帕妥珠单抗及其未配对半胱氨酸变体的组 合物，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/ Cys88未配对半胱氨酸。未配对半胱氨酸变体包括异二聚体变体（在帕妥珠单抗的仅一个 可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸）和/或同二聚体变体（在帕妥珠单抗的全 部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸）。
[0021] 组合物任选进一步包含一种或多种别的帕妥珠单抗变体，诸如无岩藻糖基化变 体，低分子量种类（LMffS)变体，高分子量种类（HMffS)变体，糖化变体，二硫化物还原变体， 不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端赖氨酸变体，甲硫氨酸氧化变 体，Gl糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。
[0022] 本发明还关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中 无岩藻糖基化变体的量为组合物的〇. 9-4. 1 %。在一个实施方案中，本发明关注包含帕妥珠 单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合 物的2%。依照这个实施方案，无岩藻糖基化变体的量大于美国专利No. 7, 560, 111，美国专 利No. 7, 879, 325,和美国专利No. 8, 241，630(Kao等人）中报告的量。
[0023] 在一个别的方面，本发明关注包含帕妥珠单抗，帕妥珠单抗的低分子量种类 (LMffS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类（HMffS)的混合物的组合物，其中LMffS的量为 彡1.6%且HMWS的量为彡1.7%。
[0024] 本发明还关注包含帕妥珠单抗，峰1，和峰2的混合物的组合物，其中峰1的量为 彡0. 5%且峰2的量为彡1. 0%，如通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠（R-CE-SDS)测定 法测量的。
[0025] 本发明的别的方面关注使用或包含本文中的组合物的药物组合物，制品，和治疗 癌症患者的方法。
[0026] 在一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括：（1)测 量组合物中未配对半胱氨酸变体的量，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全 部两个可变轻域中包含CyS23/CyS88未配对半胱氨酸；和/或（2)测量组合物中无岩藻糖 基化帕妥珠单抗的量；和/或（3)测量组合物中帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)或高分 子量种类（HMffS)的量。
[0027] 在还有一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性的方 法，其包括测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性 细胞介导的细胞毒性（ADCC)活性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约0.9至约 4. 1 %的范围中。
[0028] 在另一个方面，本发明关注用于生成组合物的方法，其包括：（1)生成包含帕妥 珠单抗及一种或多种其变体的组合物，并（2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以 评估其中变体的量，其中变体包含：（i)在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含 Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体；和/或（ii)帕妥珠单抗的无岩藻糖 基化变体；和/或（iii)帕妥珠单抗的高分子量种类（HMffS);和/或（iv)帕妥珠单抗的低 分子量种类（LMffS)，和/或（V)帕妥珠单抗的峰1片段，和/或（vi)帕妥珠单抗的峰2片 段。
[0029] 在另一个方面，本发明关注分离的帕妥珠单抗变体，其中分离的变体包含：(a) 帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含 Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体；和/或（b)帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸 变体，其中变体为在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含CyS23/CyS88未配对半胱氨酸 的同二聚体变体；和/或（c)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；和/或（d)帕妥珠单抗的高 分子量种类（HMffS);和/或（e)帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS);和/或（f)帕妥珠单 抗的峰1片段，和/或（g)帕妥珠单抗的峰2片段。
[0030] 在一个别的方面，本发明关注用于评估帕妥珠单抗组合物的片段化的方法，其包 括通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠（R-CE-SDS)测定法测量组合物中峰1和峰2的量 并确认峰1的量为< 5%且峰2的量为< 1. 0%。
[0031] 附图简述
[0032] 图1提供HER2蛋白质结构的示意图，及其胞外域的亚域I_IV(分别为SEQIDNO: 1-4)的氨基酸序列。
[0033] 图2A和2B描绘鼠单克隆抗体2C4的可变轻（VL)(图2A)和可变重（VH)(图2B) 域（分别为SEQIDNO:5和6);变体574/帕妥珠单抗的VL和VH域（分别为SEQIDNO: 7和8)，和人VL和VH共有框架（humK1，轻卡帕亚组I;humIII，重亚组III)(分别为SEQ IDNO:9和10)的氨基酸序列比对。星号鉴别帕妥珠单抗和鼠单克隆抗体2C4的可变域之 间或帕妥珠单抗和人框架的可变域之间的的差异。互补决定区（CDR)在括号中。
[0034] 图3A和3B显示帕妥珠单抗轻链（图3A;SEQIDNO:11)和重链（图3B;SEQID NO:12)的氨基酸序列。⑶R以粗体显示。轻链和重链的计算分子量为23, 526. 22Da和 49,216. 56Da(半胱氨酸处于还原形式）。碳水化合物模块附着至重链的Asn299。
[0035] 图4A和4B分别显示曲妥珠单抗轻链（图4A;SEQIDNO:13)和重链（图4B;SEQ IDNO:14)的氨基酸序列。可变轻和可变重域的边界以箭指示。
[0036] 图5A和5B分别描绘一种变体帕妥珠单抗轻链序列（图5A;SEQIDNO:15)和一 种变体帕妥珠单抗重链序列（图5B;SEQIDNO:16)。
[0037] 图6描绘（主要种类）帕妥珠单抗的结构，包括其4个链间和12个链内二硫键， 包括每个可变轻（VL)域中的Cys23/Cys88链内二硫键。描绘的域为：VL=可变轻域；VH= 可变重域；CL=轻链恒定域；CHl=重链恒定域I;CH2 =重链恒定域2 ;CH3 =重链恒定域 3〇
[0038] 图7显示帕妥珠单抗的非还原（天然）胰蛋白酶肽图。
[0039] 图8描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图（全刻度）。
[0040] 图9描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图（0-120分钟）。
[0041] 图10描绘还原的和非还原的帕妥珠单抗的胰蛋白酶肽图（120-204分钟）。
[0042] 图11描绘木瓜蛋白酶消化的帕妥珠单抗的疏水相互作用层析（HIC)分析。
[0043] 图12描绘木瓜蛋白酶消化的帕妥珠单抗的HIC分析（扩展视图）。
[0044] 图13描绘完整帕妥珠单抗的HIC分析。显示包含下述各项的峰：富集的游离硫醇 同二聚体（全部两条轻链上的游离硫醇），游离硫醇异二聚体（一个轻链上的游离硫醇）， 和野生型同二聚体（主要种类抗体）。
[0045] 图14描绘帕妥珠单抗（批次anti2C4907_2)在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)测定法中的活性。
[0046] 图15描绘GO-F水平对ADCC活性的影响。测试的样品为III期帕妥珠单抗（G0-F =2. 2% )和I期帕妥珠单抗（G0-F= 0? 8% )。
[0047] 图16描绘对自帕妥珠单抗释放的N连接寡糖的毛细管电泳分析。
[0048] 图17描绘对自帕妥珠单抗释放的N连接寡糖的毛细管电泳分析（扩展视图）。注 意：Gl寡糖具有两种异构形式（标记为Gl和G1'），其中末端半乳糖残基附着至a1-6分 支或a1-3分支任一。
[0049] 图18描绘帕妥珠单抗Fab和Fc(有限的Lys-C消化）分开的反相-高效液体层 析（HP-HPLC)。显示有限的Lys-C消化的帕妥珠单抗和然后用N-乙基马来酰亚胺（NEM)处 理的有限的Lys-C消化的帕妥珠单抗。
[0050] 图19描绘肽作图，确认帕妥珠单抗游离硫醇Fab在其轻链含有游离Cys23和 Cys88。来自含有游离硫醇的Fab的L2肽被NEM标记并因此在肽图分析中移位。
[0051] 图20示意性描绘：主要种类或野生型IgGl(图20A)，Cys23/Cys88异二聚体变体 (图20B)，和Cys23/Cys88同二聚体变体（图20C)。
[0052] 图21描绘帕妥珠单抗批次的％GO-F对ADCC活性，使用本文中实施例4中的测定 法。
[0053] 图22示意性描绘帕妥珠单抗在HER2的异二聚体结合位点处结合，由此阻止与活 化的EGFR或HER3异二聚化。
[0054] 图23比较曲妥珠单抗（其结合HER2E⑶的近膜域附近的亚域IV)和帕妥珠单抗 (其结合HER2E⑶的亚域II)的活性。
[0055] 图24A和24B描绘附着至IgG抗体的寡糖结构。
[0056] 图25描绘帕妥珠单抗的大小排阻层析（SEC)分析（全刻度）。
[0057] 图26描绘帕妥珠单抗的SEC分析（扩展刻度）。峰包括主峰（主要种类抗体）， 高分子量种类（HMffS)，和低分子量种类（LMffS)。
[0058] 图27描绘帕妥珠单抗样品的大小排阻-高效液体层析（SE-HPLC)分析。样品A为 代表性帕妥珠单抗成品药批次。样品B为以1. 2毫勒克斯小时进行光暴露的帕妥珠单抗批 次。样品C为以3. 6毫勒克斯小时进行光暴露的帕妥珠单抗批次。样品D为于pH3. 2进 行酸处理的帕妥珠单抗批次。样品E为来自离子交换-HPLC(IEHPLC)的纯化的碱性变体。
[0059] 图28描绘分析性超速离心（AUC)沉降速度和SE-HPLC分析的一致性图 (concordanceplot)。误差棒代表来自n= 3测定的两个标准偏差。所有其它数据点表示 单次测定。圆圈表示具有低于AUC检测水平的HMWS水平的样品。
[0060] 图29描绘非还原帕妥珠单抗的毛细管电泳十二烷基硫酸钠分析（CE-SDS)及激光 诱导荧光（LIF)检测。
[0061] 图30描绘非还原（NR)帕妥珠单抗的CE-SDS-LIF(扩展视图）。
[0062] 图31A和31B描绘实施例6的SE-HPLC层析图：全刻度（图31A)和扩展刻度（图 31B) 〇
[0063] 图32A和32B描绘实施例6的非还原CE-SDS(NR-CE-SDS)电泳图：全刻度（图32A) 和扩展刻度（图32B)。
[0064] 图33A和33B描绘实施例6的还原CE-SDS(R-CE-SDS)电泳图：全刻度（图33A)， 和扩展刻度（图33B)。
[0065] 图34提供酸处理样品的NR-CE-SDS和R-CE-SDS电泳图的比较（扩展刻度）。
[0066] 图35描绘NR-CE-SDS和SE-HPLC之间Fab量化的相关性。
[0067] 发明详述
[0068] I?定义
[0069] "配对半胱氨酸"在本文中指蛋白质（诸如抗体）中形成二硫键的两个半胱氨酸残 基。此类二硫键可以是链间二硫键（例如抗体的重和轻链之间的或抗体的两条重链之间的 二硫键），或链内二硫键（例如抗体的一条轻链内的或抗体的一条重链内的）。大多数IgGl 抗体包含四个链间二硫键和十二个链内二硫键。见图6。
[0070] "未配对半胱氨酸变体"为蛋白质（例如抗体，诸如帕妥珠单抗）的一种变体，其中 一个或多个配对半胱氨酸没有处于成二硫键状态。此类未配对半胱氨酸可以是尚未配对以 形成二硫键（例如当蛋白质最初折叠成它的三级结构时）或可以是已经形成二硫键但其稍 后断裂（例如在制造期间或在贮藏后）。未配对半胱氨酸常常称作游离硫醇或游离氢硫基。 在一个实施方案中，未配对半胱氨酸来自链内二硫键。在一个实施方案中，未配对半胱氨 酸在抗体的轻链（例如可变轻域）中。在一个实施方案中，未配对半胱氨酸变体为Cys23/Cys88变体。
[0071] "Cys23/Cys88"未配对半胱氨酸变体缺乏抗体的一个或全部两个可变轻域中的半 胱氨酸残基23和88处的分子内二硫键。见本文中的图20(b)和（c)。
[0072] "同二聚体变体"缺乏抗体的全部两个可变轻域中的Cys23/Cys88二硫键。见本文 中的图20(c)。
[0073] "异二聚体变体"缺乏抗体的一个可变轻域中的仅一个Cys23/Cys88二硫键。见本 文中的图20(b)。
[0074] "无岩藻糖基化变体"为抗体的一种糖基化变体，其中附着至一条或全部两条重链 中的残基Asn299的一个或全部两个寡糖结构中缺乏岩藻糖，例如在核心寡糖结构中缺乏 Fuca(1->6)。
[0075] 帕妥珠单抗的"低分子量种类"或"LMWS"包含帕妥珠单抗的一种片段，其具有 小于主要种类或完整帕妥珠单抗的分子量的分子量（例如其中完整帕妥珠单抗具有约 145, 197Da的分子量，仅测量它的肽链）。LMffS可通过大小排阻高效液体层析（SE-HPLC)和 /或具有十二烷基硫酸钠的非还原毛细管电泳（CE-SDS)来检测，例如实施例5中的。在一 个实施方案中，LMffS包含通过CE-SDS获得的"峰6 "或由通过CE-SDS获得的"峰6 "组成 (见例如实施例5)。
[0076] "高分子量种类"或"HMWS"包含帕妥珠单抗的一种制备物，其具有大于主要种类 或完整帕妥珠单抗的分子量的分子量（例如其中完整帕妥珠单抗具有约145, 197Da的分子 量，仅测量它的肽链）。HMffS可通过大小排阻高效液体层析（SE-HPLC)和/或具有十二烷 基硫酸钠的非还原毛细管电泳（CE-SDS)测定法来检测，例如实施例5中的。
[0077] 本文中的"峰1"指其大小比帕妥珠单抗轻链（LC)要小的帕妥珠单抗片段。可以 通过CE-SDS测定法（优选还原CE-SDS(R-CE-SDS)测定法）将峰1片段与主要种类帕妥珠 单抗分开。见例如本文中的图33B，表16,和表18。优选地，帕妥珠单抗组合物中峰1的量 为< 0. 5%。任选地，如实施例6中所述进行R-CE-SDS测定法，而且校正峰面积（CPA)提供 组合物中的％峰1。
[0078] 本文中的"峰2"指其大小比要帕妥珠单抗轻链（LC)大且比帕妥珠单抗非糖基化 重链（NGHC)要小的帕妥珠单抗片段。可以通过CE-SDS(优选还原（R-CE-SDS)测定法）将 峰2与主要种类帕妥珠单抗分开。峰2排除R-CE-SDS测定法期间可出现的峰3,如本文中 的实施例6中解释的。见例如本文中的图33B，表16,和表18。优选地，帕妥珠单抗组合物 中峰2的量为彡1. 0%。任选地，如实施例6中所述进行R-CE-SDS测定法，而且校正峰面积 (CPA)提供组合物中的％峰2。
[0079] "片段化"指多肽链切割，例如帕妥珠单抗轻链和/或重链的切割。它不包括例如 NR-CE-SDS分析期间非共价联合的多肽链的解离。
[0080] "分析性测定法"为定性评估和/或定量测量组合物中分析物（例如抗体变体）的 存在或量的测定法。进行测定法的组合物可以是纯化的组合物，包括药物组合物。
[0081] "Fab疏水性相互作用层析测定法"或"FabHIC测定法"包含生成组合物中的抗体 的片段（例如Fab片段）（例如使用酶木瓜蛋白