酶）并对如此生成的抗体片段进行HIC以 将未配对半胱氨酸变体与主要种类帕妥珠单抗分开。本文中的实施例1中公开一种例示性 此类测定法。
[0082] "HER受体"为属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，而且包括EGFR，HER2， HER3和HER4受体。HER受体通常会包含胞外域，其可结合HER配体和/或与另一个HER受 体分子二聚化；亲脂性跨膜域；保守的细胞内酪氨酸激酶域；和羧基末端信号传导域，其包 含数个可被磷酸化的酪氨酸残基。
[0083] 表述 "HER2" 指例如Semba等人，PNAS(USA) 82 :6497-6501 (1985)和Yamamoto等 人，Nature319 :230-234(1986)中记载的人HER2 蛋白质（Genebank登录号X03363)。
[0084] 在本文中，"HER2胞外域"或"HER2E⑶"指HER2中在细胞外部的域，或是锚定 至细胞膜或是在循环中，包括其片段。图1中显示J1ER2的氨基酸序列。在一个实施方案 中，HER2的胞外域可包含四个域："亚域I"（氨基酸残基约1-195;SEQIDNO:1)，"亚域 II"（氨基酸残基约196-319;SEQIDNO:2)，"亚域III"（氨基酸残基约320-488:SEQID NO:3)，和"亚域IV"（氨基酸残基约489-630;SEQIDNO:4)(残基编号不含信号肽）。参 见Garrett等人，Mol.Cell. 11 :495-505(2003);Cho等人，Nature421 :756-760(2003); Franklin等人，CancerCell5 :317-328(2004);和Plowman等人，Proc.Natl.Acad. Sci. 90 :1746-1750(1993);以及本文中的图 1。
[0085] "HER二聚体"在本文中为非共价联合的二聚体，其包含至少两个HER受体。例 如，此类复合物可在表达两种或更多种HER受体的细胞暴露于HER配体时形成，而且可以 通过免疫沉淀来分离，通过SDS-PAGE来分析，如Sliwkowski等人，J.Biol.Chem. 269(20): 14661-14665(1994)中记载的。其它蛋白质（诸如细胞因子受体亚基，例如gpl30)可以与 二聚体联合。优选地，JER二聚体包含J1ER2。
[0086] "HER异二聚体"在本文中为非共价联合的异二聚体，其包含至少两个不同HER受 体，诸如EGFR-HER2,HER2-HER3 或HER2-HER4 异二聚体。
[0087] "HER活化"指任一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转 导（例如由!ER受体的细胞内激酶域磷酸化!ER受体或底物多肽中的酪氨酸残基引起的）。 HER活化可通过HER配体结合包含感兴趣HER受体的HER二聚体来介导。HER配体结合HER 二聚体可活化二聚体中的HER受体中的一种或多种的激酶域，并由此导致HER受体中的一 种或多种中的酪氨酸残基磷酸化和/或别的底物多肽（诸如Akt或MPK细胞内激酶）中 的酪氨酸残基磷酸化。
[0088] "人源化"形式的非人（例如啮齿类）抗体为最小限度含有自非人免疫球蛋白衍 生的序列的嵌合抗体。对于绝大部分，人源化抗体为如下的人免疫球蛋白（受体抗体），其 中来自受体的高变区的残基用来自具有期望特异性，亲和力，和能力的非人种类（供体抗 体）（诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类）的高变区的残基替换。在一些情况中，人免疫 球蛋白的框架区（FR)残基用相应非人残基替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体中 或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰以进一步细调抗体性能。一般而言，人源 化抗体会包含基本上整个如下的至少一个，通常两个可变域，其中所有或基本上所有高变 环对应于非人免疫球蛋白的那些，而且所有或基本上所有FR为人免疫球蛋白序列的那些。 人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区（Fe)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关 于更多详情，参见Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature332: 323-329 (1988);和Presta，Curr.Op.Struct.Biol. 2 :593-596 (1992)。人源化HER2 抗体具 体包括曲妥珠单抗和人源化2C4抗体，诸如帕妥珠单抗，如本文中描述和定义的。
[0089] "完整抗体"在本文中为包含两个抗原结合区和一个Fc区的。优选地，完整抗体具 有功能性Fc区。在一个实施方案中，"完整帕妥珠单抗"具有约145, 197Da的分子量，仅测 量它的肽链。
[0090] 术语"高变区"在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通 常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基（例如轻链可变域中的残基24-34 (LI)， 50-56 (L2)和 89-97 (L3)和重链可变域中的 31-35 (HI)，50-65 (H2)和 95-102 (H3);Kabat 等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 版，PublicHealth Service，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD. (1991))和 / 或来自"高变 环"的那些残基（例如轻链可变域中的残基26-32 (LI)，50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链 可变域中的 26-32 (HI)，53-55 (H2)和 96-101 (H3);Chothia和Lesk，J.Mol.Biol. 196 : 901-917 (1987))。"框架区"或"FR"残基为那些除高变区残基以外的可变域残基，如本文中 定义的。
[0091] 术语"Fc区"在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc 区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以有所变化，但是人IgG重链Fc区 通常定义为自位于位置Cys226的氨基酸残基或自Pro230延伸至其羧基末端。可去除Fc 区的C末端赖氨酸（依照EU编号系统的残基449)，例如在抗体生产或纯化期间或通过重 组工程改造编码抗体重链的核酸。因而，完整抗体的组合物可包含去除所有K449残基的抗 体群体，无一K449残基去除的抗体群体，和具有有和无K449残基的抗体的混合物的抗体群 体。
[0092] 除非另外指明，在本文中免疫球蛋白重链中的残基的编号为Kabat等人， SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 片反，PublicHealthService, NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中EU索引的，通过援引明确收入本 文。"Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗体的残基编号。
[0093] "功能性Fc区"拥有天然序列Fc区的"效应器功能"。例示性"效应器功能"包括 Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC);吞 噬；下调细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR);等。此类效应器功能通常要求Fc区与结 合域（例如抗体可变域）组合，而且可使用多种测定法来评估。
[0094] "天然序列Fc区"包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序 列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGlFc区（非A和A同种异型）；天然序列人IgG2Fc 区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及其天然发生变体。
[0095] "裸抗体"为未缀合异源分子（诸如细胞毒性模块或放射性标记物）的抗体。
[0096] 术语"主要种类抗体"或"野生型抗体"在本文中指组合物中如下的抗体氨基酸序 列结构，它是组合物中数量上占优势的抗体分子。优选地，主要种类抗体为HER2抗体，诸 如结合HER2亚域II的抗体，比曲妥珠单抗更加有效地抑制HER二聚化的抗体，和/或结 合HER2上的异二聚体结合位点的抗体。在一个实施方案中，主要种类抗体为如下的抗体， 其包含0)1?11(5￡〇10勵：17或23)，0)1?-112(5￡〇10勵 ：18)，和0)1?-113(5￡〇10勵：19)， CDR-L1(SEQIDN0:20)，CDR-L2(SEQIDN0:21 或 24)和CDR-L3(SEQIDN0:22)，分别在 SEQIDNO:7和8中的VL和VH氨基酸序列（见图2A-2B)，和任选的SEQIDNO:11或15 中的轻链氨基酸序列和SEQIDNO:12或16中的重链氨基酸序列（见图3A-3B和5A-5B)。 在一个实施方案中，主要种类抗体为帕妥珠单抗。
[0097] "抑制HER二聚化"的抗体为抑制或干扰HER二聚体或异二聚体形成的抗体。在一 个实施方案中，此类抗体在其异二聚体结合位点处结合ffiR2。本文中最优选的二聚化抑制 性抗体为帕妥珠单抗。
[0098] HER2上的"异二聚体结合位点"指HER2的胞外域中如下的区域，其与EGFR，HER3 或HER4的胞外域中的一个区域形成二聚体，此时接触后者或与后者成界面。区域在HER2 的亚域II(SEQIDNO:2)中找到。Franklin等人，CancerCell5:317-328(2004)。
[0099] "结合HER2的异二聚体结合位点"的HER2抗体结合亚域II(SEQIDNO:2)中的 残基且任选还结合HER2胞外域的其它域，诸如亚域I和III(SEQIDNO:1和3)中的残基， 而且能至少一定程度地在空间上阻碍ffiR2-EGFR，HER2-HER3,或HER2-HER4异二聚体形成。 Franklin等人，CancerCell5:317-328(2004)表征HER2-帕妥珠单抗晶体结构，保存于 RCSB蛋白质数据库（身份代码IS78)，例示结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
[0100] "结合HER2的亚域II"的抗体结合亚域II(SEQIDNO:2)中的残基和任选的HER2 的其它亚域，诸如亚域I和III(分别为SEQIDNO:1和3)中的残基。
[0101] 为了本文中的目的，可互换使用的"帕妥珠单抗"和"rhuMAb2C4"指包含分别在 SEQIDNO:7和8中的可变轻（VL)和可变重（VH)氨基酸序列的抗体。本文中的图22和 23例示帕妥珠单抗的例示性生物学功能。在帕妥珠单抗为完整抗体的情况中，它优选包含 IgGl抗体；在一个实施方案中，包含SEQIDNO:11或15中的轻链氨基酸序列，和SEQID NO:12或16中的重链氨基酸序列。抗体任选是由重组中国仓鼠卵巢（CHO)细胞生成的。术 语"帕妥珠单抗"和"rhuMAb2C4"在本文中涵盖美国采用名称（USAN)或国际非专利名称 (INN)为帕妥珠单抗的药物的生物仿制药或故意拷贝。
[0102] 为了本文中的目的，可互换使用的"曲妥珠单抗"和rhuMAb4D5"指抗体包含分别在 SEQIDNO:13和14内的可变轻（VL)和可变重（VH)氨基酸序列（见图4A-4B)。在曲妥珠 单抗为完整抗体的情况中，它优选包含IgGl抗体；在一个实施方案中包含SEQIDNO: 13的 轻链氨基酸序列和SEQIDNO: 14的重链氨基酸序列。抗体任选是由中国仓鼠卵巢（CHO) 细胞生成的。术语"曲妥珠单抗"和"rhuMAb4D5"在本文中涵盖美国采用名称（USAN)或国 际非专利名称（INN)为曲妥珠单抗的药物的生物仿制药或故意拷贝。
[0103] "氨基酸序列变体"抗体在本文中为具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗 体。通常，氨基酸序列变体会与主要种类抗体拥有至少约70%同源性，且优选地，它们会与 主要种类抗体至少约80 %，和更优选至少约90 %同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体的 氨基酸序列内或附近的某些位置处拥有替代，删除，和/或添加。本文中的氨基酸序列变体 的例子包括脱酰胺抗体变体，在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸（例如VHS-) 的抗体，在其一条或两条重链上具有C末端赖氨酸残基的抗体，等，而且包括对重和/或轻 链的氨基酸序列的变异的组合。
[0104] "酸性变体"为主要种类抗体如下的变体，其比主要种类抗体更加酸性。酸性变体 相对于主要种类抗体已经获得负电荷或丢失正电荷。此类酸性变体可使用依照电荷将蛋白 质分开的分开方法学来解析，诸如离子交换层析。在通过阳离子交换层析分开时，主要种类 抗体的酸性变体比主峰要早洗脱。
[0105] "二硫化物还原变体"具有一个或多个成链间二硫键半胱氨酸化学还原成游离硫 醇形式。这种变体可通过具有十二烷基硫酸钠的非还原毛细管电泳（CE-SDS)来监测，例如 如TO2009/099829 (Harris等人）在记载的。
[0106] 在本文中，"不可还原变体"或"不完全还原变体"为主要种类抗体如下的变体，其 不能通过还原剂（诸如二硫苏糖醇）处理化学还原成重链和轻链。此类变体可通过用还原 剂处理组合物并使用评估蛋白质大小的方法学（诸如具有十二烷基硫酸钠的毛细管电泳 (CE-SDS)，例如使用WO2009/099829 (Harris等人）中记载的技术）评估所得组合物来评 估。
[0107] "糖基化变体"抗体在本文中为具有与附着至主要种类抗体的一种或多种碳水化 合物模块不同的一种或多种碳水化合物模块附着至其的抗体。在一个实施方案中，糖基化 变体具有附着至抗体的一条或全部两条重链的寡糖结构，例如在重链的残基299处。在一 个实施方案中，主要种类抗体（例如帕妥珠单抗）包含GO寡糖，作为占优势的附着至它的 Fc区的寡糖。图24A-24B中描绘附着至IgGl的例示性寡糖结构。本文中的糖基化变体的 例子包括无岩藻糖基化变体，具有Gl或G2寡糖结构代替GO寡糖结构附着至其Fc区的抗 体（"G1糖基化变体"或"G2糖基化变体"），没有碳水化合物附着至抗体的一条或两条重 链的抗体（"非糖基化重链变体"），唾液酸化变体，等，以及此类糖基化改变的组合。参见 例如美国专利7, 560, 111 (Kao等人）。
[0108] 在抗体具有Fc区的情况中，寡糖结构可附着至抗体的一条或两条重链，例如在残 基299处。在一个实施方案中，GO为占优势的寡糖结构，其它寡糖结构，诸如GO-F，G-1， Man5,Man6,Gl-1，Gl(1-6)，Gl(1-3)和G2以较少的量在组合物中找到。
[0109] 除非另外指明，"G1寡糖结构"在本文中包括Gl(1-6)和Gl(1-3)结构。
[0110] 为了本文中的目的，"唾液酸化变体"为主要种类抗体如下的变体，其包含一种 或多种唾液酸化碳水化合物模块附着至一条或两条其重链。唾液酸化变体可通过在有 或无唾液酸酶处理的情况下评估组合物（例如通过离子交换层析）来鉴定，例如如WO 2009/099829中记载的。
[0111] "糖化变体"为糖（诸如葡萄糖）已经共价附着至例如其一条或全部两条轻链的抗 体。这种添加可通过葡萄糖与蛋白质（例如细胞培养培养基中的）上的赖氨酸残基的反应 而发生。糖化变体可通过对还原抗体的质谱术分析来鉴定，即评估重或轻链的质量的增加。 糖化变体还可通过硼酸盐层析来量化，如WO2009/099829 (Harris等人）中解释的。
[0112] "脱酰胺"抗体为其中一个或多个其天冬酰胺残基已经衍生化成例如天冬氨酸， 琥珀酰亚胺，或异天冬氨酸的。脱酰胺抗体的一个例子是如下的帕妥珠单抗变体，其中 帕妥珠单抗的一条或两条重链上的Asn-386和/或Asn-391是脱酰胺的。参见例如TO 2009/099829(Harris等人）。
[0113] "氨基末端前导延伸变体"在本文中指在主要种类抗体的任一条或多条重或轻链 的氨基末端处具有氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基的主要种类抗体。一种例示 性氨基末端前导延伸在抗体变体的一条或全部两条轻链上包含三个氨基酸残基，VHS-或由 其组成，在本文中称作"VHS-变体"。参见美国专利7, 560, 111 (Kao等人）。
[0114] "C末端赖氨酸变体"指在其重链的C末端处包含赖氨酸（K)残基的变体。参见美 国专利7, 560, 111 (Kao等人）。
[0115] "甲硫氨酸氧化变体"指其中包含一个或多个氧化的甲硫氨酸残基（例如氧化的 Met-254)的变体。参见美国专利7, 560, 111 (Kao等人）。
[0116] 术语"癌症"指哺乳动物中通常特征为不受调节的细胞生长的生理状态。本文中的 癌症的例子包括乳腺癌（例如转移性乳腺癌），胃癌，卵巢癌，原发性腹膜癌，和输卵管癌。 本文中的癌症的例子包括HER2阳性癌症和低HER3癌症。
[0117] "展示HER表达，扩增，或活化"的癌症或生物学样品为在诊断性测试中表达（包括 过表达）HER受体，已经扩增HER基因，和/或以其它方式证明HER受体活化或磷酸化的。
[0118] "HER2阳性"癌症包含具有比正常要高的HER2水平的癌细胞。HER2阳性癌症的 例子包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。用于鉴定HER2阳性癌症的方法包括：测量 J1ER2蛋白质的测定法，诸如免疫组织化学测定法（IHC)，测量HER2编码核酸的测定法，诸如 原位杂交（ISH)，包括荧光原位杂交（FISH;参见1998年10月公布的W098/45479)和发色 原位杂交（CISH;参见例如Tanner等人，Am.J.Pathol. 157(5) :1467-1472(2000);Bella等 人，J.Clin.Oncol. 26 :(May20suppl;abstr22147) (2008))，Southern印迹，或聚合酶链 式反应（PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR);脱落抗原（例如HER2ECD)测定法（参见 例如1990年6月12日公告的美国专利No. 4, 933, 294 ;和1995年3月28日公告的美国专 利5, 401，638);和体内测定法。任选地，HER2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学（IHC) 得分和/或彡2. 0的原位杂交（ISH)扩增比。
[0119] "低HER3"癌症包含具有比正常要低的HER3水平的癌细胞。低HER3癌症的例子 包括卵巢癌，原发性腹膜癌，和输卵管癌。参见例如美国专利No. 7, 981，418 (Amler等人）。 在一个实施方案中，低HER3是基于HER3mRNA表达水平测定的（等于或低于2. 81的浓度比， 如在COBASZ480?仪器上通过qRT-PCR评估的）。
[0120] "表位2C4"为HER2的胞外域中抗体2C4结合的区域。为了筛选本质上结合2C4 表位的抗体，可实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratoryManual，Cold SpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane(1988)中记载的。优选地，抗体阻断 2C4结合HER2达约50%或更多。或者，可实施表位作图来评估抗体是否本质上结合册1?2 的2C4表位。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的亚域II(SEQIDNO:2)的残基。2C4 和帕妥珠单抗在亚域I，II和III(分别为SEQIDNO: 1，2,和3)附近结合HER2的胞外域。 Franklin等人，CancerCell5:317-328(2004)。
[0121] "处理/治疗"指治疗性处理和防范性或预防性措施二者。需要治疗的那些包括早 就具有癌症的那些以及其中要预防癌症的那些。因此，本文中要治疗的患者可以是已经诊 断为具有癌症或可以是倾向或易得癌症。
[0122] 术语"有效量"指药物有效治疗患者中的癌症的量。有效量的药物可减少癌细胞 的数目；缩小肿瘤大小；抑制（即一定程度减缓和优选停止）癌细胞浸润入周围器官中；抑 制（即一定程度减缓和优选停止）肿瘤转移；一定程度抑制肿瘤生长；和/或一定程度减轻 一种或多种与癌症有关的症状。就药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它 可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。有效量可延长无进展存活（例如如通过实体瘤响 应评估标准（RECIST)或CA-125变化测量的），导致客观响应（包括部分响应，PR，或完全 响应，CR)，延长总体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状（例如如通过FOSI评估 的）。
[0123] 本文中的治疗剂的"固定"或"平坦"剂量指不管患者的重量（WT)或体表面积 (BSA)施用于人患者的剂量。因此，固定或平坦剂量不是以mg/kg剂量或mg/m2剂量，而是 以治疗剂的绝对量提供的。
[0124] "容器"指可用于容纳或装载药物组合物或组合物的物体。本文中的容器的例子包 括管形瓶，注射器，静脉内袋，等。
[0125] "静脉内袋"或"IV袋"为可容纳可经患者的静脉施用的溶液的袋。在一个实施方 案中，溶液为盐水溶液（例如约〇. 9%或约0. 45%NaCl)。任选地，IV袋是自聚