致；两种方法均在样品D中显示一种主要降解产物，较小水平的更大HMWS。
[0339] 表11中呈现这些样品来自两种方法的定量结果的比较。
[0340] 表11:AUC和SE-HPLC结果的比较
[0341]
[0342] 注意1 :样品A由一个代表性帕妥珠单抗成品药批次组成，样品B由以1. 2毫勒克 斯小时进行光暴露的一个帕妥珠单抗批次组成，样品C由以3. 6毫勒克斯小时进行光暴露 的一个帕妥珠单抗批次组成，样品D由于pH3. 2进行酸处理的一个帕妥珠单抗批次组成， 而样品E由来自IE-HPLC的纯化的碱性变体组成。
[0343] 注意2 :相应的SE-HPLC层析图见图27。
[0344] AUC=分析性超速离心；HMffS=高分子量种类；RSD=相对标准偏差；SE-HPLC= 大小排阻高效液体层析。
[0345] 3样品A和B具有低于AUC技术的量化限度的HMffS水平。
[0346] 对于样品C，D，和E，通过两种技术测量的百分比HMWS有较好的一致性。样品A 和B中存在的低水平的HMWS阻止通过具有3. 7%的估算量化限度的AUC(Gabrielson和 Arthur，Methods54 :83-91(2011))对该种类的精确量化。SE-HPLC和AUC之间百分比HMWS 的表观分歧反映这一点（表11)。在一系列HMWS水平之间评估相关性。相关系数（Lin，L， Biometrics45 :255-68 (1989))计算为 0? 97(n= 5)，指示AUC和SE-HPLC之间对于HMffS 量化较好的一致性（图28)。
[0347] 这些结果确认SE-HPLC在对帕妥珠单抗测量HMffS方面是稳健的。
[0348] SE-HPLC能够检测和通过AUC精确量化观察到的所有HMWS种类。
[0349]通过SE-HPLC，SDS-PAGE，和CE-SDS分析的基于大小的异质性在各批次间是 一致的。SE-HPLC测定法对测试的所有批次显示相似水平的HMWS(0. 1 % -0. 2 % )和 LMWS(0. 0% -0. 1% )。通过SDS-PAGE分析对还原和非还原样品产生的条带样式是一致的， 就像通过CE-SDS生成的电泳概况。
[0350] 在一个实施方案中，通过SE-HPLC评估的主要种类帕妥珠单抗和HMffS变体和LMffS 变体的量如下：
[0351] 彡96%主峰，例如彡96. 7%主峰，例如彡97. 3%主峰，例如彡97. 4%主峰。
[0352] 彡 2 %HMWS，例如彡L7 %HMWS，例如彡L5 %HMWS，例如彡L4 %HMWS，例如 ^ 0. 8%HMffS0
[0353] 彡 2%LMWS，例如彡I. 6%LMWS，例如彡I. 2%LMWS，例如彡 0? 6%LMWS。
[0354] 通过SE-HPLC纯化的帕妥珠单抗HMWS和LMffS级分均展现与主峰和有完全效力的 对照相比降低的抗增殖活性。除显示更低FcRn结合的LMffS外，所有大小变体显示与对照 相比相当的HER2结合活性和FcRn结合活性。
[0355] 既然LMffS样品含有2/3Fab片段和l/3Fc片段，那么预期较低的抗增殖和FcRn结 合活性。HMWS显示较高的FeyRIIIa(⑶16)V158结合活性，但是较低的ADCC活性。LMffS显 示较低的FeyRIIIa(CD16)V158结合活性，而且对这种变体没有观察到ADCC活性（表12)。
[0356] 表12 :帕妥珠单抗主峰，HMWS，和LMffS的生物学活性
[0357]
[0358] 注意：相对于帕妥珠单抗参照标准（批次anti2C4907_2)报告的百分比活性。ADCC =抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；HMffS=高分子量种类；LMffS=低分子量种类。
[0359] aLMffS样品由2/3Fab和l/3Fc片段组成。显示的值反映基于分子量（Fab= 47644Da，Fc= 52800Da，和全长抗体=148088Da)的nM/nM调整。
[0360] b帕妥珠单抗参照标准（批次anti2C4907_2)具有2. 2 %的GO-F水平，而对照样 品具有1. 7%的G0-F。结果尚未校正无岩藻糖基化材料水平的差异。
[0361] 毛细管电泳十二烷基硫酸钠（CE-SDS) =CE-SDS及激光诱导荧光（LIF)检测分析是 一种高灵敏度测定法，提供在变性条件下定量评估蛋白质的分子大小分布的手段。在非还 原样品的CE-SDS分析（图29)中，帕妥珠单抗像由96% -98 %总峰面积组成的主要峰及代 表LMffS和HMWS的次要峰一样迀移。对于测试的所有材料，通过这种技术测定的HMWS的量 为0.6%。其余种类像LMffS-样迀移，如图30 (扩展视图）中显示的。样品加热诱导的片 段化随烷基化而最小化（SalasSolano等人，Anal.Chem. 78 :6583-6594(2006))。表 13 中 列出通过CE-SDS分开的种类的相对分布。
[0362] 表13 :非还原帕妥珠单抗的相对分布，通过CE-SDS(百分比峰面积）
[0363]
[0364] 注意：由于舍入，加起来的总％可能不是正好100%。
[0365] CE-SDS=毛细管电泳十二烷基硫酸钠；HMffS=高分子量种类。
[0366] 观察到一种轻微差异，其中峰6自参照标准批次anti2C4-900_l(I/II期工艺）中 的0. 9%升高至参照标准批次anti2C4907-2,运行1，和运行3-7的1. 7% -2. 3%。
[0367] 在一个实施方案中，通过NR-CE-SDS分开或分离的帕妥珠单抗主峰（排除LMffS和 HMffS)为自约95%至约99%，例如自约96. 0%至约97. 8%。任选地，HMWS的量为彡1%， 例如彡0.6%，而LMffS的量为彡4%，例如彡3. 4%，如通过CE-SDS分开或分离的。
[0368] 实施例6 :帕妥珠单抗片段化的检测和量化
[0369]这个实施例的目的是为帕妥珠单抗片段的检测评估大小排阻层析（SE-HPLC)，还 原毛细管电泳十二烷基硫酸钠（R-CE-SDS)，和非还原CE-SDS(NR-CE-SDS)方法。
[0370] 材料和方法
[0371] 下文汇总这项研究中评估的样品。这些包括已经进行可能导致片段化升高的各种 加压条件的帕妥珠单抗样品。
[0372] ?参照标准（2C4907-2)
[0373] ?热加压（42 天，40°C)
[0374] ?酸处理（pH3. 2,1 天，4(TC)
[0375]?加速稳定性（30天，40°C，然后贮藏于大约5°C)
[0376] ?实时成品药（DP)稳定性（T= 0和T= 548天且贮藏于大约5°C)和相应原料 药（DS)
[0377] 以下述可报告值如上文实施例5所述进行SE-HPLC:LMWS，主峰，HMWS，和所有其它 超出量化限度（LOQ)的显著峰。
[0378] 以下述可报告值依照上文实施例5进行还原CE-SDS(R-CE-SDS):峰1，IX，峰2,峰 3,NGHC，HC，峰5,不完全还原，和其它超出LOQ的显著峰。
[0379]如上文实施例5所述进行非还原CE-SDS(NR-CE-⑶S)，其中通过自SDS络合步骤消 除二硫苏糖醇（DTT)，样品制备排除抗体还原步骤以容许非还原分析。
[0380]图31A-B，图32A-B，和图33A-B分别为，以及表14，15,和16中分别呈现通过 SE-HPLC，NR-CE-SDS，和R-CE-SDS获得的定性结果。
[0381] 峰鉴定基于Hunt&Nashabeh，AnalyticalChemistry71 :2390-2397 (1999);和 Ma&Nashabeh，ChromatographiaSupplement53 :S75_S89 (2001)。对于NR-CE-SDS分析， 通常包括峰2之后的一个小峰，在数据报告期间作为峰2的一部分。对于这项研究，作为峰 2a分开报告这个小峰以区别该片段与轻链（IX)。
[0382] 表14 =SE-HPLC定量数据（％峰面积）
[0389] NGHC=非糖基化重链，HC=重链
[0390] 数据评估：比较有关片段的百分比峰面积（或百分比校正峰面积，％CPA，用于 CE-SDS)以确定CE-SDS方法是否与SE-HPLC相比提供非冗余信息。有关片段包括具有未知 结构的峰，或已知含有自切割多肽链衍生的产物的那些。这些片段不同于抗体产品中存在 的和通过CE-SDS通常观察到的可解离的未成二硫键的重和/或轻链片段。片段峰必须与 其它峰解析开以实现灵敏的检测和精确的量化。
[0391] 检测小片段的能力：在R-CE-SDS和NR-CE-SDS分析二者中均能观察到小片段，而 且在两种测定法均命名为峰1。这些峰保留相同的总体形状和迀移时间，而且在两种测定法 中在加压条件下相似地增大。因此，峰1推测在两种测定法中含有相同种类。两种CE-SDS 测定法均能够检测小片段，如表17中记录的。
[0392] 检测通过酸水解（酸剪切）生成的片段的能力：延长的酸暴露条件能生成片段，特 别是在Asp-Pro序列（帕妥珠单抗重链残基272-273)处，如酸处理样品的质谱分析所支持 的，其显示29039Da(HC1-272)和21513Da(具有GO聚糖的HC273-448)处的质量。这些 形式的理论质量分别为29031Da和21510Da。基于这些形式的预期迀移时间，在酸处理样 品的还原CE-SDS分析中能清楚地看到一个对应的峰（峰2,图34)，但是在非还原测定法中 是在低得多的水平（较低信号）检测到的。可以假定在NR-CE-SDS测定法中，峰2片段推 测是二硫化物连接的，并因此未检测到。既然酸处理样品中通过R-CE-SDS检测到的峰2水 平（5. 58% )超出对此样品通过SE-HPLC检测到的总LMWS(0. 26% )，那么可以得出结论， SE-HPLC也不足以检测这些形式。因此，还原CE-SDS测定法是本文中呈现的唯一能够检测 因酸水解而生成的片段化的测定法，如表17中记录的。
[0393] 检测Fab/DesFab片段的能力：通过SE-HPLC检测的LMffS和来自非还原CE-SDS测 定法的峰3之间有较好的线性相关性（r2= 0. 97)(图35)。经由用酶促生成的Fab进行的 共洗脱研究，LMffS鉴定为含有Fab片段。类似地，经由分别用酶促生成的Fab和DesFab进 行的共迀移研究（Ma&Nashabeh，同上），鉴定NR-CE-SDS测定法中的峰3和峰5。生成Fab 形式的重链切割产生desFab峰，所以推测它相对于Fab片段处于等价摩尔数量（对应于 2:1质量比），如此，关于这种形式的信息也能通过SE-HPLC间接获得，如表17中记录的。
[0394] 表 17 :通过SE-HPLC，NR-CE-SDS，和R-CE-SDS检测片段的能力
[0395]
[0396] 还原CE-SDS峰3 =R-CE-SDS峰3对于帕妥珠单抗是独特的，而且尚未在其它抗体 的CE-SDS分析中观察到。扩展表征结果支持如下结论，即峰3不是产品变体或杂质，而是 对帕妥珠单抗特异性的方法诱导人造物，由可解离形式的LC-LC二聚体组成。采用多种技 术来表征峰3。
[0397] 通过配有UV和LIF检测的R-CE-SDS观察到峰3,提示它不是染料标记或样品制备 人造物。
[0398] 在通过R-CE-SDS分析时，纯化的帕妥珠单抗轻链级分产生具有为LC理论大小大 约2倍的表观丽的峰3。
[0399] 在电泳条件包括较高毛细管温度时没有观察到峰3,而且在这些条件下没有观察 到其它共迀移片段。
[0400] 单氨基酸突变的研究鉴定出LC⑶Rl和⑶R2中与LC-LC二聚体形成有关的三个 氨基酸残基。当这三个残基任一用另一种氨基酸替换时，峰3完全解离且不再通过还原 CE-SDS观察到。
[0401] SDS-PAGE分析偶联MALDI-T0F蛋白质质量指纹（PMF)确认帕妥珠单抗中不存在宿 主细胞蛋白质，也没有以通过CE-SDS观察到的水平检测到类似条带。
[0402] 总之，这些结果支持峰3的鉴定是对帕妥珠单抗特异性的，方法诱导的LC-LC二聚 体。
[0403] 讨论
[0404] 对自这项研究获得的数据的评估指示：
[0405] (1)关于片段的检测，NR-CE-SDS与SE-HPLC相比确实提供非冗余信息。
[0406] (2)通过NR-CE-SDS方法获得的非冗余片段化信息（与SE-HPLC相比）也能使用 R-CE-SDS方法获得。
[0407] 如表16中显示的，还原测定法检测源自原料药制造期间可发生的低pH暴露的切 割产物。表18含有对帕妥珠单抗参照标准，III期材料（n= 3)和使用商业性制造工艺生 成的批次（n= 39)的还原CE-SDS峰1和峰2获得的值。使用3. 2的k值为峰1和峰2计 算95/99容许区间（TI)，并呈现于表18。峰1的95/99容许区间为0. 0至0. 4%CPA。峰 2的95/99容许区间为0? 3至0? 9%CPA。
[0408] 表18 :测试的43批次的R-CE-SDS定量数据（％CPA)
[0409]
[0413] 本文中对原料药释放选择峰I< 0. 5%和峰2 <I. 0%的最终接受标准。
[0414] 因为帕妥珠单抗原料药是冷冻贮藏的，所以对DS稳定性会预期无变化。另外，基 于在T= 0和T548d二者对成品药获得的R-CE-SDS数据（表19)，对任何命名种类没有观 察到显著变化。
[0415] 表19 :DP稳定性样品的R-CE-SDS定量数据（％CPA)
【主权项】
1. 一种包含帕妥珠单抗（Pertuzumab)及其未配对半胱氨酸变体的组合物，其中未配 对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半 胱氨酸。2. 权利要求1的组合物，其中未配对半胱氨酸变体是在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域 中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异二聚体变体。3. 权利要求1的组合物，其中未配对半胱氨酸变体是在帕妥珠单抗的全部两个可变轻 域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体。4. 前述权利要求任一项的组合物，其中帕妥珠单抗和未配对半胱氨酸变体各自包含分 别在SEQ ID NO :7和8中的可变轻和可变重氨基酸序列。5. 前述权利要求任一项的组合物，其中帕妥珠单抗和未配对半胱氨酸变体各自包含在 SEQ ID NO : 11或15中的轻链氨基酸序列和在SEQ ID NO : 12或16中的重链氨基酸序列。6. 前述权利要求任一项的组合物，其进一步包含一种或多种别的帕妥珠单抗变体，其 中别的变体选自下组：无岩藻糖基化变体，低分子量种类（LMffS)，高分子量种类（HMffS)，糖 化变体，二硫化物还原变体，不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端 赖氨酸变体，甲硫氨酸氧化变体，Gl糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。7. 前述权利要求任一项的组合物，其中组合物中未配对半胱氨酸变体的量为<约 25%，通过Fab疏水相互作用层析（HIC)测定。8. 权利要求3的组合物，其中组合物中同二聚体变体的量为< 4. 9%，通过完整抗体的 疏水相互作用层析（HIC)测定。9. 权利要求2的组合物，其中组合物中异二聚体变体的量为自约13%至约18%，通过 完整抗体的疏水相互作用层析（HIC)测定。10. 权利要求1至9任一项的组合物，其已经进行分析性测定法以确认组合物中未配对 半胱氨酸变体的量为<约25%，通过Fab疏水相互作用层析（HIC)测定。11. 一种包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体的组合物，其中无岩藻糖 基化变体的量为组合物的〇. 9-4. 1 %。12. 权利要求11的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2%。13. -种包含帕妥珠单抗，帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)，和帕妥珠单抗的高分 子量种类（HMffS)的混合物的组合物，其中LMffS的量为< 1. 6%且HMWS的量为< 1. 7%，通 过大小排阻高效液体层析（SE-HPLC)测定。14. 一种包含帕妥珠单抗，峰1，和峰2的混合物的组合物，其中峰1的量为< 0. 5%且 峰2的量为< 1.0%，通过还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠（R-CE-SDS)测定法测量。15. -种药物组合物，其包含权利要求1至14任一项的组合物和一种或多种药学可接 受赋形剂。16. -种制品，其包含其中装有权利要求15的药物组合物的容器，和印有指导其使用 者使用药物组合物来治疗癌症患者的处方信息的包装插页。17. -种治疗具有癌症的患者的方法，其包括对癌症患者施用权利要求1至14任一项 的组合物或权利要求15的药物组合物。18. 权利要求17的方法，其中癌症为乳腺癌，胃癌，卵巢癌，HER2阳性癌症，或低HER3 癌症。19. 一种用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括：（1)测量组合物中未配对半胱 氨酸变体的量，其中未配对半胱氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含 Cys23/Cys88未配对半胱氨酸；(2)测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量；或（3)测 量组合物中帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)或高分子量种类（HMffS)的量。20. 权利要求19的方法，其包括（1)，（2)，和（3)中的两项或三项。21. -种用于评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性的方法，其包括测量组合物中无岩 藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)活 性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约〇. 9%至约4. 1%的范围中。22. 权利要求21的方法，其包括使用毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF)测量无岩藻 糖基化帕妥珠单抗的量。23. -种用于生成组合物的方法，其包括：（1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其变 体的组合物，并（2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以评估其中变体的量，其中变 体包含：（i)在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨 酸的未配对半胱氨酸变体；（ii)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；（iii)帕妥珠单抗的高 分子量种类（HMffS);或（iv)帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)。24. 权利要求23的方法，其中（1)包括以制造规模自重组中国仓鼠卵巢（CHO)表达帕 妥珠单抗和变体并纯化组合物。25. -种分离的帕妥珠单抗变体，其中分离的变体包含：(a)如下的帕妥珠单抗的未 配对半胱氨酸变体，其中变体为在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配 对半胱氨酸的异二聚体变体；(b)如下的帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中变体为 在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的同二聚体变体； (c)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体；（d)帕妥珠单抗的高分子量种类（HMWS);或（e)帕妥 珠单抗的低分子量种类（LMffS)。26. -种用于评估帕妥珠单抗组合物的片段化的方法，其包括通过还原毛细管电泳 十二烷基硫酸钠（R-CE-SDS)测定法测量组合物中峰1和峰2的量并确认峰1的量为< 5% 且峰2的量为彡1.0%。27. -种用于生成组合物的方法，其包括：（1)生成包含帕妥珠单抗及一种或多种其片 段的组合物，和（2)对如此生成的组合物进行分析性测定法以评估组合物中峰1和峰2的 量。
【专利摘要】本申请公开帕妥珠单抗的变体。特别地，它公开：在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变体，帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体，帕妥珠单抗的低分子量种类(LMWS)，和帕妥珠单抗的高分子量种类(HMWS)。本申请进一步公开分离的变体，包含变体的组合物，药物组合物，和制品，以及生成和表征变体及其组合物的方法。
【IPC分类】C07K16/32, G01N33/53, A61P35/04
【公开号】CN105121471
【申请号】CN201480020921
【发明人】L·A·热纳罗, Y-h·高, 张永华
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年4月15日
【公告号】CA2907776A1, US20140308277, WO2014172371A2, WO2014172371A3