烯烃或聚氯 乙稀形成的。
[0126] "管形瓶"为适合于容纳液体或冻干制备物的一种容器。在一个实施方案中，管形 瓶为单次使用管形瓶，例如带塞子的20-cc单次使用管形瓶。
[0127] "包装插页"为奉食品和药物管理局（FDA)或其它管理机构之命，必须放置在每一 种处方药物的包装内部的传单。传单通常包括药物的商标，它的通用名，和它的作用机制； 陈述它的适应症，禁忌症，警告，预防措施，不利作用，和剂量形式；而且包括关于施用的推 荐剂量，时间，和路径的用法说明。
[0128] "药物组合物"为包含可安全施用于人患者的药学活性药物（例如帕妥珠单抗和变 体形式，诸如本文中公开的那些）和一种或多种"药学活性赋形剂"（例如缓冲剂，稳定剂， 张力调节剂，防腐剂，表面活性剂，等）的组合物。例如，此类组合物可以是液体的或冻干 的。
[0129] "重组"蛋白质为已经由遗传修饰宿主细胞（诸如中国仓鼠卵巢（CHO)宿主细胞） 生成的蛋白质。
[0130] "制造规模"指以商业规模（例如12, 000升（L)或更多）使用得到FDA或其它管 理机构批准的商业性工艺生产蛋白质药物（例如抗体）。
[0131] "纯化"指一个或多个纯化步骤，诸如蛋白A层析，离子交换层析，等。
[0132] "分离的"变体指通过一种或多种纯化或分析规程已经与主要种类或野生型抗体 分开的变体。此类分离的变体可评估它的生物学活性和/或效力。
[0133] II?抗体组合物
[0134] (i)主要种类抗体
[0135]本文中的抗体组合物包含结合HER2的抗体（HER2抗体），任选人源化HER2抗 体。例如，本文中的人源化抗体可包含掺入人可变重域中的非人高变区残基且可进一步 在选自下组的位置包含框架区（FR)替代：69H，71H和73H，利用Kabat等人，Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 版，PublicHealthService,National InstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中列出的可变域编号系统。在一个实施方案 中，人源化抗体在位置69H，7IH和73H中的两个或全部包含FR替代。
[0136] 本文中的一种例示性感兴趣人源化抗体包含VH⑶R残基：
[0137] -GFTFTDYTMX(SEQIDNO:17)，其中X优选为D或S，例如GFTFTDYTMD(SEQIDNO: 23)，作为CDR-Hl;
[0138]-DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQIDNO: 18)，作为CDR-H2 ;和 / 或-NLGPSFYFDY(SEQID NO: 19)，作为⑶R-H3,任选包含那些⑶R残基的氨基酸修饰，例如其中修饰本质上维持或改 善抗体的亲和力。例如，供本发明的方法使用的抗体变体可在上述可变重CDR序列中具有 自约一处至约七处或约五处氨基酸替代。可通过亲和力成熟制备此类抗体变体，例如如下 文所述。
[0139] 人源化抗体可包含VL⑶R残基：
[0140]-KASQDVSIGVA(SEQIDNO:20)，作为CDR-Ll;
[0141] -SASYX1X2X3,其中X1优选为R或L，X2优选为Y或E，且X3优选为T或S(SEQID NO:21)，例如SASYRYT(SEQIDNO:24)，作为CDR-L2 ;和 / 或
[0142]-QQYYIYPYT(SEQIDNO:22)，作为CDR-L3，
[0143] 例如，在前一段中的那些可变重域⑶R残基之外。
[0144] 此类人源化抗体任选包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰本质上维持 或改善抗体的亲和力。例如，感兴趣抗体变体可在上述可变轻CDR序列中具有自约一处至 约七处或约五处氨基酸替代。可通过亲和力成熟制备此类抗体变体。
[0145] 本申请还涵盖结合HER2的亲和力成熟抗体。亲本抗体可以为人抗体或人源化抗 体，例如包含分别为SEQIDNO:7和8的可变轻和/或可变重序列（即包含帕妥珠单抗的 VL和/或VH)的。帕妥珠单抗的一种亲和力成熟变体优选以优于鼠2C4或帕妥珠单抗亲 和力的亲和力（例如改善自约2或约4倍，至约100倍或约1000倍的亲和力，例如如使用 HER2E⑶ELISA评估的）结合HER2受体。用于替代的例示性可变重⑶R残基包括H28，H30， H34,H35,H64,H96,H99,或两个或更多个（例如这些残基中的2个，3个，4个，5个，6个，或 7个）的组合。用于改变的可变轻CDR残基的例子包括L28,L50,L53,L56,L91，L92,L93， L94,L96,L97或两个或更多个的组合（例如这些残基中的2个至3个，4个，5个或直至约 10个）。
[0146] 涵盖各种形式的人源化抗体或亲和力成熟抗体。例如，人源化抗体或亲和力成熟 抗体。或者，人源化抗体或亲和力成熟抗体可以为完整抗体，诸如完整IgGl抗体。
[0147] 优选，HER2抗体（主要种类HER2抗体及其抗体变体任一或二者）为结合HER2的 亚域II，比曲妥珠单抗更加有效地抑制HER二聚化，和/或结合HER2的异二聚体结合位点 的。本文中主要种类抗体的优选实施方案为包含SEQIDNO:3和4中的可变轻和可变重氨 基酸序列，且最优选包含SEQIDNO:11或15中的轻链氨基酸序列和SEQIDNO: 12或16 中的重链氨基酸序列的。
[0148] (ii)未配对半胱氨酸变体
[0149] 本文中的实施例1和3描述帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体。用于分离，表征， 和量化此类变体的分析性测定法包括特异性评估链内二硫键（不同于链间二硫键）的测定 法，例如抗体片段（例如Fab片段）的疏水相互作用层析（HIC)分析（如实施例1中的）， 完整抗体的HIC(如实施例1中的），带不同标签的抗体的肽作图分析（如实施例3中的）， 和/或反相高效液体层析（RP-HPLC)(如本文中的实施例3中的），和Zhang等人，Anal. Chem. 84(16) :7112-7123(2012)中的。
[0150] 通常，帕妥珠单抗的优势形式在其两个Fab域的全部两个VL域中包含Cys23和 Cys88之间的二硫键。见图6。
[0151] 本文中的一种未配对半胱氨酸变体，异二聚体变体，在其两个Fab区中仅一个的 可变轻（VL)域中缺乏Cys23/Cys88二硫键。见图20(b)。这测定为占优势的未配对半胱氨 酸变体。
[0152] 本文中的又一种未配对半胱氨酸变体，同二聚体变体，在其全部两个Fab区中缺 乏Cys23/Cys88 二硫键。见图 20(c)。
[0153] 在一个实施方案中，组合物中未配对半胱氨酸变体（包括同二聚体和异二聚体变 体）的量为<约25%，例如如通过Fab疏水相互作用层析（HIC)测定的。
[0154] 在一个实施方案中，组合物中同二聚体变体的量为< 4. 9%，如通过完整抗体的 HIC测定的。
[0155] 在一个实施方案中，组合物中异二聚体变体的量为自约13%至约18%，例如如通 过完整抗体的HIC测定的。
[0156] 组合物任选进一步包含一种或多种下文所述别的变体。
[0157] 本发明还关注分离的帕妥珠单抗的未配对半胱氨酸变体，其中未配对半胱氨酸变 体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸。此类分 离的未配对半胱氨酸变体可包含异二聚体变体和/或同二聚体变体或由异二聚体变体和/ 或同二聚体变体组成。此类变体可使用HIC或其它纯化方法来分离的，且可进行生物学测 定法，诸如效力测定法（使用HER2阳性乳腺癌细胞），如下文实施例1中的。
[0158] (iii)无岩藻糖基化变体
[0159] 本文中的实施例2和4描述帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体并演示如何基于组合 物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的百分比测定ADCC活性。
[0160] 在一个实施方案中，本发明关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基化 变体的组合物，其中无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2%。见例如下文表9中的 anti2C4907-2 和运行 1〇
[0161] 在一个备选实施方案中，本发明关注包含帕妥珠单抗和帕妥珠单抗的无岩藻糖基 化变体的组合物，其中无岩藻糖基化变的量为组合物的自〇. 9至4. 1 %。例如，无岩藻糖基 化变体的这种量可使用实施例4中经过验证的CE-LIF测定法来量化。
[0162] 任选地，组合物进一步包含未配对半胱氨酸变体（先前部分中描述的异二聚体和 /或同二聚体）和/或下文要描述的别的变体。
[0163] (iv)LMffS和HMffS
[0164] 本发明进一步关注帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)和/或帕妥珠单抗的高分 子量种类（HMffS)，或是分离的形式或是在包含变体和主要种类抗体的组合物中。可使用多 种技术来分离，表征，和量化LMffS和HMWS，包括但不限于大小排阻高效液体层析（SE-HPLC) 和/或毛细管电泳十二烷基硫酸钠（CE-SDS)。
[0165] 使用SE-HPLC测定法（例如如实施例5中的），组合物中主要种类帕妥珠单抗和 HMffS或LMffS的量可以为：
[0166] 主峰：彡约96%，例如彡约96. 7%，彡约97. 3%，例如彡约97. 4%。
[0167] HMffS:彡约2 %，例如彡约1. 7 %，例如彡约1. 5 %，例如彡约1. 4 %，例如彡约 0? 8%〇
[0168] LMffS:彡约2%，例如彡约1. 6%，例如彡约1. 2%，例如彡约0. 6%。
[0169] 使用NR-CE-SDS测定法（例如如实施例5中的），组合物中主要种类帕妥珠单抗和 HMffS或LMffS的量可以为：
[0170] 主峰：彡约95%，例如彡约96. 0%，例如彡约97. 8%。
[0171] HMffS:彡约 1%，例如彡约 0? 6%。
[0172] LMffS:彡约 4%，例如彡约 3. 4%。
[0173] 例如，如通过CE-SDS测定的，主峰或主要种类帕妥珠单抗（排除LMffS和HMWS)的 量可以为约95%至约99%，例如自约96. 0%至约97. 8%，例如自约95. 3%至约97. 3%主 峰。
[0174] 任选地，LMffS包含通过NR-CE-SDS(见例如实施例5)获得的"峰6"或由通过 NR-CE-SDS(见例如实施例5)获得的"峰6"组成。此类峰6可测定为组合物的约0. 9%至 约2. 3%，例如约2%至约2. 3%。
[0175] (V)帕妥珠单抗的峰1和峰2片段
[0176] 本发明进一步关注帕妥珠单抗的峰1片段和/或峰2片段，或是分开的或分离的 形式，或是在包含片段和主要种类抗体的组合物中。可使用多种技术来分离，表征，和量化 峰1和峰2,包括但不限于大小排阻高效液体层析（SE-HPLC)和/或毛细管电泳十二烷基硫 酸钠（CE-SDS)，包括R-CE-SDS和NR-CE-SDS。在一个实施方案中，通过R-CE-SDS来分开和 /或分析峰1和峰2,例如如实施例5和6中描述的，而且校正峰面积（CPA)提供组合物中 的％峰1或峰2。
[0177] 使用R-CE-SDS测定法（例如如实施例5和6中的），组合物中峰1的量为彡5% (例如自〇? 13%至0.41 %CPA)且组合物中峰2的量为彡1.0% (例如自0.47%至0.74% CPA) 〇
[0178] (vi)别的变体
[0179] 本文中的组合物任选包含帕妥珠单抗的别的变体，诸如美国专利7, 560, 111(Kao 等人）和/或WO2009/099829 (Harris等人）中记载的那些。
[0180] 此类别的变体的例子包括但不限于下述任一项或多项：糖化变体，二硫化物还原 变体，不可还原变体，脱酰胺变体，唾液酸化变体，VHS-变体，C末端赖氨酸变体，甲硫氨酸 氧化变体，无岩藻糖基化变体，Gl糖基化变体，G2糖基化变体，和非糖基化重链变体。
[0181] 例如，组合物可包含酸性变体（见WO2009/099829,Harris等人），其中组合物 中的酸性变体可包括糖化变体，脱酰胺变体，二硫化物还原变体，唾液酸化变体，和不可还 原变体中的一项，两项，三项，四项，或五项。优选，组合物中所有酸性变体的总量为小于约 25 %。在一个实施方案中，糖化变体，脱酰胺变体，二硫化物还原变体，唾液酸化变体，和不 可还原变体占组合物中的酸性变体的至少约75-80%。
[0182] 可通过各种方法来评估酸性变体，但优选的此类方法包括下述一项，两项，三项， 四项，或五项：离子交换层析（IEC)，其中在IEC(例如用于评估唾液酸化变体）之前，之后， 和/或期间用唾液酸酶处理组合物，还原CE-SDS(例如用于评估二硫化物还原变体），非还 原CE-SDS(例如用于评估不可还原变体），硼酸盐层析（例如用于评估糖化变体），和肽作 图（例如用于评估脱酰胺变体）。
[0183] 组合物任选包括氨基末端前导延伸变体。优选，氨基末端前导延伸在抗体变体的 轻链上（例如在抗体变体的一条或两条轻链上）。本文中的抗体变体可在任一条或多条其 重或轻链上包含氨基末端前导延伸。优选地，氨基末端前导延伸在抗体的一条或两条轻链 上。氨基末端前导延伸优选包含VHS-或由VHS-组成（即VHS-变体）。可通过各种分析技 术检测组合物中氨基末端前导延伸的存在，包括但不限于N末端序列分析，用于电荷异质 性的测定法（例如阳离子交换层析或毛细管区带电泳），质谱术，等。组合物中抗体变体的 量通常范围为自构成用于检测变体的任何测定法（优选阳离子交换分析）的下检测限度的 量至小于主要种类抗体的量的量。通常，组合物中约20%或更少（例如自约1%至约15%， 例如自5%至约15%，和优选自约8%至约12% )的抗体分子包含氨基末端前导延伸。优 选使用阳离子交换分析测定此类百分比量。
[0184] 涵盖主要种类抗体和/或变体的别的氨基酸序列改变，包括但不限于在一条或全 部两条其重链上包含C末端赖氨酸残基的抗体（此类抗体变体可以自约1 %至约20 %的量 存在），具有一个或多个氧化的甲硫氨酸残基的抗体（例如包含氧化的Met-254的帕妥珠单 抗），等。
[0185] 此外，除上文讨论的无岩藻糖基化变体和唾液酸化变体之外，主要种类抗体或变 体可包含别的糖基化变异，其非限制性例子包括包含附着于其Fc区的Gl或G2寡糖结构的 抗体，包含一条或两条非糖基化重链的抗体，等。
[0186] III.制造和分析方法
[0187] 依照本发明的一个实施方案，提供用于评估帕妥珠单抗组合物的方法，其包括下 述一项，两项，三项，或四项：（1)测量组合物中未配对半胱氨酸变体的量，其中未配对半胱 氨酸变体在帕妥珠单抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸， 和/或（2)测量组合物中无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量，和/或（3)测量组合物中帕妥珠 单抗的低分子量种类（LMffS)的量，和/或（4)测量组合物中帕妥珠单抗的高分子量种类 (HMWS)的量。任选地，对包含帕妥珠单抗及其变体的组合物实施所有四种分析性测定法。
[0188] 本发明还关注用于生成组合物的方法，其包括：（1)生成包含帕妥珠单抗及一种 或多种其变体的组合物，并（2)对如此生成的组合物进行一种或多种分析性测定法以评估 本文中的变体的量。分析性测定法可评估及量化下述任一项或多项的量：（i)在帕妥珠单 抗的一个或全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的未配对半胱氨酸变 体和/或（ii)在帕妥珠单抗的仅一个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半胱氨酸的异 二聚体变体和/或（iii)在帕妥珠单抗的全部两个可变轻域中包含Cys23/Cys88未配对半 胱氨酸的同二聚体变体和/或（iv)帕妥珠单抗的无岩藻糖基化变体和/或（V)帕妥珠单 抗的高分子量种类（HMffS)和/或（vi)帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)，和/或（vii) 帕妥珠单抗的峰1片段和/或（viii)帕妥珠单抗的峰2片段。如此，可分析这些变体中的 一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种或八种。
[0189] 任选地，分析性测定法评估，量化，或分离未配对半胱氨酸变体，包括异二聚体和/ 或同二聚体变体。例如，分析性测定法可包括抗体片段（例如Fab片段）或完整抗体（见 例如实施例1)的疏水相互作用层析（HIC)，肽作图分析（见例如实施例3)，或反相高效液 体层析（HPLC)(见例如实施例3)。
[0190] 在一个实施方案中，组合物中未配对半胱氨酸变体（异二聚体和/或同二聚体变 体）的量为<约25%，如通过Fab疏水相互作用层析（HIC)测定的。
[0191] 在一个实施方案中，组合物中同二聚体变体的量为< 4. 9%，如通过完整抗体的疏 水相互作用层析（HIC)测定的。
[0192] 在一个实施方案中，组合物中异二聚体变体的量为自约13%至约18%，如通过完 整抗体的疏水相互作用层析（HIC)测定的。
[0193] 任选地，分析性测定法评估，量化，或分离无岩藻糖基化变体。无岩藻糖基化的量 可用于测定或量化组合物的生物学活性，例如ADCC。
[0194] 另外，方法包括评估帕妥珠单抗组合物的生物学活性，其包括测量组合物中无岩 藻糖基化帕妥珠单抗变体的量以测定组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)活 性，并确认无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量在自约0. 9%至约4. 1%的范围中。例如，方法包 括使用毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF)测量无岩藻糖基化帕妥珠单抗的量。
[0195]任选地，用于评估无岩藻糖基化的分析性测定法为毛细管电泳（CE)，包括毛细管 电泳-激光诱导荧光（CE-LIF)，见下文实施例2和4。无岩藻糖基化变体的量任选为组合物 的自约0. 9至约4. 1% (例如如通过实施例4中的CE-LIF测量的）。在一个实施方案中， 无岩藻糖基化变体的量为大于组合物的2% (例如如通过实施例4中的CE-LIF测量的）。
[0196] 任选地，分析性测定法评估，量化，或分离帕妥珠单抗的低分子量种类（LMffS)和/ 或高分子量种类（HMffS)。例示性测定法包括SE-HPLC和/或CE-SDS(见例如下文实施例 5) 〇
[0197] 在一个实施方案中，分析性测定法包括SE-HPLC(例如实施例5中的），而且如此分 析的组合物中主要种类帕妥珠单抗，HMffS或LMffS的量测定为：
[0198] 主要峰：彡约96%，例如彡约96. 7%，彡约97. 3%，例如彡约97. 4%。
[0199] HMffS:彡约2 %，例如彡约1. 7 %，例如彡约1. 5 %，例如彡约1. 4 %，例如彡约 0? 8%〇
[0200] LMffS:彡约2%，例如彡约L6%，例如彡约L2%，例如彡约0? 6%。
[0201] 在一个实施方案中，分析性测定法包括CE-SDS(例如实施例5中的），而且如此分 析的组合物中主要种类帕妥珠单抗和HMWS或LMffS帕妥珠单抗的量测定为：
[0202] 主要峰：彡约95%，例如彡约96. 0%，例如彡约97. 8%。
[0203] HMffS:彡约 1%，例如彡约 0? 6%。
[0204] LMffS:彡约 4%，例如彡约 3. 4%。
[0205] 在一个实施方案中，通过NR-CE-SDS评估组合物，而且发现主峰或主要种类帕妥 珠单抗（排除LMffS和HMWS)的量为如此分析的组合物的自约95%至约99%，例如自约 96. 0%至约97. 8%，例如自约95. 3%至约97. 3%。
[0206] 在一个实施方案中，通过CE_SDS(见例如实施例5)评估组合物中"峰6"的量，而 且峰6LMWS的量测定为如此分析的组合物的约0. 9%至约2. 3%，例如约2%至约2. 3%。
[0207] 在一个实施方案中，通过R-CE-SDS(见例如实施例5和6)评估组合物中峰1和/ 或峰2的量，而且峰1的量测定为彡5% (例如自0. 13%至0. 41%CPA)而且峰2的量测定 为彡 1.0% (例如自 0.47%至 0.74%CPA)。
[0208] 方法任选进一步包括将纯化的组合物与一种或多种药学可接受赋形剂组合以生 成药物组合物。另外，药物组合物可放置入容器中，与包装插页（例如印有指导其使用者使 用药物组合物来治疗癌症的处方信息）一起包装以生成制品。
[0209] IV?药物组合物
[0210] 通过混合具有期望纯度的组合物与任选的药学可接受赋形剂（Remington's Pharm