专利名称：一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp.B-6及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高浓度造纸黑液的生物处理技术，特别涉及一株用于直接处理高浓 度、高碱度、高色度的碱法草浆造纸黑液的细菌及其应用。
背景技术：
造纸工业废水约占全国工业总废水量的10%，对我国的水资源环境造成的污染日 趋严重。制浆过程中产生的造纸黑液是造纸工业的重要污染源。草浆是中国造纸厂的主要 浆种，草浆碱法蒸煮黑液是造纸国内造纸厂的主要污染物。碱回收法是现阶段最成熟的造 纸黑液处理方法，但并不适用于草浆黑液的治理，且投资大、运行成本高，造成大多数造纸 企业将蒸煮黑液不治理或不完全治理排放，导致了严重的环境污染，成为制约造纸行业发 展的重大问题。目前对于造纸黑液的处理方法主要还有碱回收法、酸析法、碱析法、膜分离法、 絮凝沉淀法，它们各具优缺点，但是都不能达到很好的效果，限制了在造纸黑液治理中的应 用。生物处理法是利用自然界大量存在的、依靠有机物生活的微生物氧化、分解黑液中的有 机物，同时采取一定的人工措施，创造有利于微生物生长、繁殖的环境，提高微生物氧化、分 解有机物的效率。近年来，国内对草浆黑液生物处理技术进行了不少研究，也取得了一定的 成绩，某些技术已经通过中试。但这些传统生物处理工艺应用于黑液治理普遍存在以下一 些缺陷1、黑液PH高，需要先调节PH后才能进入生物处理单元；2、黑液中一些高浓度的盐 离子对细菌有毒害作用如Na+ ；3、黑液中含有单宁等对微生物有毒性的物质，传统生物法只 能处理稀释或脱毒后的黑液；4、碱法蒸煮溶解的木质素难以生物降解，大多数微生物不能 降解和利用木质素；5、黑液可生化性差，污泥增长差。所以说常规的生物技术处理方法并不 能很好地进行黑液治理。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp. B_6及 应用。一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp. B-6，所述菌株的保藏编号为 CGMCC No. 4239。所述的菌株的培养基组成为碱木质素3g，(NH4)2S042g, K2HPO4Ig, MgSO4O. 2g， CaCl2O. lg, FeSO4O. 05，MnSO4O. 02g, KH2PO4Ig,琼脂 15g,蒸馏水 IOOOmL, pH 为 7· 0 7· 4。所述菌株直接用于碱法草浆造纸黑液处理。本发明从造纸黑液微生物处理技术角度出发，通过采集、分离、驯化，得到一株能 直接用于处理高COD、高色度以及高pH造纸黑液的细菌。结合菌落菌体形态特征和基于细菌16S rDNA基因序列的系统发育分析，将该菌鉴 定为Pandoraea菌，命名为Pandoraea sp. B_6。该菌株已于2010年10月22日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提交生物保藏，保藏号为CGMCC No. 4239。 该菌可直接用于处理未经任何物化预处理的高浓度碱法草浆造纸黑液，能有效降低黑液的 COD、色度以及pH。发明人根据湖南长沙简牍博物馆收藏的一批走马楼出土的三国时期吴国竹简，在 出土后保存过程中，暴发了竹简蚀斑病，竹简竹体被微生物侵蚀，其中的木质素、纤维素被 某种或者某群微生物所降解，蚀斑中的竹简竹体变为半透明膜状物质，并且容易破裂脱落 的情况，从该批竹简的浸泡液中分离，筛选出本发明菌株。本发明菌株的分离、纯化和筛选过程为将长沙简牍博物馆密封保藏的竹简浸泡液分别接种丰富培养基进行富集培养。培 养物以稀释平板法结合划线分离法在相应的固体平板上进行分离，直至获得各种微生物的 纯培养。培养温度为30°C。将分离得到的菌株纯培养接种到以木质素为唯一碳源的固体平 板筛选培养基上，放入生化培养箱中在30°C下恒温静置培养，每天观察，根据平板上菌株的 生长情况，再划线分离得到最终的纯培养菌株。所述丰富培养基组成为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂15_20g，蒸 馏水lOOOmL，pH值为7. 0 7. 4。所述木质素为唯一碳源的培养基组成为碱木质素3g， (NH4) 2S042g, K2HPO4Ig, MgSO4O. 2g, CaCl2O. lg，FeSO4O. 05，MnSO4O. 02g，KH2PO4Ig,琼脂 15g，蒸 馏水 IOOOmL, pH 为 7. 0 7. 4。本发明弥补了常规微生物不能直接用于处理高浓度造纸黑液的不足。本发明所述 菌株Pandoraea sp. B-6可直接投入pH = 11，COD高达30000mg/L，色度为8500的高浓度 造纸黑液中进行处理，经过5天的生物处理，可使黑液的COD下降39. 1 %。目前为止，国内 外尚未有关于Pandoraea属的菌株应用于造纸黑液处理的报道，本发明为造纸黑液的生物 处理技术提供了一种新的微生物资源。
图1 本发明菌株的菌落形态图；图2 本发明菌株的菌体扫描电镜图；图3 本发明菌株处理高浓度造纸黑液的COD去除率及菌体生长情况。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1 菌株的生物学鉴定1.菌株形态特征(1)菌落形态特征菌落呈浅绿色，表面扁平而光滑、边缘为波状，见图1。(2)菌体形态特征对菌株进行革兰氏染色，利用光学显微镜观测，显示该菌株为 短杆状革兰氏阴性菌；并利用扫描电子显微镜观察菌株，菌株扫描电镜照片见图2。2.菌株 16S rDNA 分析采用细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模 板，引物为细菌16S rDNA通用引物(27F，1492R)，扩增菌株的16SrDNA片段，将得到的细菌 16S rDNA序列与NCBI中的核酸数据库进行Blast同源性比对(www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)，与数据库中已知细菌Pandoraea sp. JBl的16S rDNA序列的相似性达到了 100%, ^ ^ Pandoraea MPandoraea sp. B-60实施例2 菌株对高浓度造纸黑液的处理效果将细菌在液体的丰富培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，蒸馏水 1000mL，pH值为7. O 7. 4)中培养至对数期，按(V/V)的接种量接种到初始pH = 11， COD为30000mg/L，色度为8500的高浓度碱法草浆造纸黑液中，在30°C，120r/mm下振荡培 养5天，每天取样一次，样品经12000r/min离心6min，沉淀用无菌水洗涤两次后，重复离心 操作，80°C烘干，称重，得到菌体干重，用于测定菌株生长情况；测定上清液C0D，用于检测 菌株对造纸黑液的COD去除率，结果见图3。
权利要求
1.一株用于处理高浓度造纸黑液的菌株Pandoraea sp. B-6，其特征在于，所述菌株的 保藏编号为CGMCC No. 4239。
2.一种培养权利要求1所述的菌株的培养基，其特征在于，组成为碱木质素3g， (NH4) 2S042g, K2HPO4Ig, MgSO4O. 2g, CaCl2O. lg，FeSO4O. 05，MnSO4O. 02g，KH2PO4Ig,琼脂 15g，蒸 馏水 IOOOmL, pH 为 7. 0 7. 4。
3.权利要求1所述的菌株应用于处理造纸黑液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述菌株直接接种到碱法草浆造纸黑 液中进行处理。
全文摘要
本发明公开了一株直接用于高浓度造纸黑液处理的细菌Pandoraea sp.B-6，保藏号为CGMCC No.4239。发明人采集长沙简牍博物馆收藏的爆发了蚀斑病的三国时期吴国竹简浸泡液为原料，经过富集培养、分离纯化和筛选，得到一株能够在碱木质素为唯一碳源的培养基上生长的菌株。该菌可直接用于处理未经任何物化预处理的高浓度碱法草浆造纸黑液，能使初始pH＝11，COD为30000mg/L，色度为8500的高浓度碱法草浆造纸黑液在五天时间内COD降低39.1％。
文档编号C12N1/20GK102093973SQ20101057869
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者张欢, 彭兵, 杨卫春, 杨志辉, 柴立元, 王海鹰, 郑玉, 闵小波, 陈跃辉 申请人:中南大学