一种用于抗体表达的表达框、表达载体、含该载体的宿主细胞及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于抗体表达的表达框、表达载体、含该 载体的宿主细胞及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前表达和生产基因工程抗体的表达系统主要分为两类：一类是原核表达系统， 如在大肠杆菌；另一类是真核表达系统，多为哺乳动物细胞如CHO,sp2/0，NS0等。真核表 达系统表达抗体有糖基化、生物活性高、既能表达全分子抗体也能表达小分子抗体，因而用 于医学临床上治疗疾病的抗体是真核表达系统表达生产的，但现有的真核表达系统表达抗 体产量低，因而成本高，难以获得大量的抗体。
[0003] 因此，有必要提供一种增加基因工程抗体的表达量，提_表达的稳定性，并减少抗 体生产成本的真核表达系统及方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种用于抗体表达的表达框、适用于表达该表达 框的表达载体、与该表达载体配套的宿主细胞及其制备方法和应用；本发明提供的方案能 实现在同一宿主细胞内抗体轻链和重链的同步、高效以及稳定地表达，且其生产抗体的成 本较低。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种用于抗体表达的表达框，结构包括：
[0006] 第一启动子；及
[0007] 连接在第一启动子之后并由第一启动子控制表达的抗体的轻链的编码序列以及 重链的编码序列，所述轻链的编码序列和重链的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列 进行连接；及
[0008] 第二启动子；及
[0009] 由第二启动子控制表达的筛选基因。
[0010] 本发明提供的用于抗体表达的表达框利用第一启动子控制串联的轻链和重链基 因，并使用核糖体内部进入位点（IRES)，可实现轻、重链基因同时在同一阅读框架内进行转 录、2种翻译起始模式（5'端帽子依赖与不依赖帽子结构的翻译起始）共存的优势。相比采 用2个启动子分别控制抗体轻链和重链进行转录、翻译的方法，本发明提供的用于抗体表 达的表达框采用一个启动子控制轻重链的转录、2种翻译起始模式共存的设计可减少载体 的非编码序列，增强表达框与真核表达宿主的兼容性，更可控制轻重链的表达比例，并提高 抗体表达水平和质量。
[0011]IRES序列为核糖体提供不依赖帽子结构的核糖体结合位点，翻译时，不经过mRNA的5'端扫描，也不需要宿主细胞的某些关键因子的参与，具有IRES序列的病毒可逃脱宿主 通过这些关键因子的下调或失活来抑制病毒基因的表达。因此，本发明提供的用于抗体表 达的表达框除了可采用真核细胞经典的帽子依赖翻译途径，还可以采用IRES不依赖帽子 结构的的翻译途径，提高外源基因（即插入的抗体轻链和重链）在宿主细胞中的表达水平。
[0012] 另外，本发明提供的用于抗体表达的表达框利用第二启动子控制控制筛选基因， 使得GS基因由高度弱化的启动子驱动，有利于筛选去掉不表达或者弱表达的细胞，从而在 筛选基因实现其筛选功能的前提下，实现抗体高产量表达。
[0013] 优选地，所述用于抗体表达的表达框在基因水平上从上游到下游依次包括：
[0014] 第一启动子-抗体的轻链的编码序列-内部核糖体进入位点序列IRES序列-抗 体的重链的编码序列-第二启动子-第二启动子控制表达的筛选基因。
[0015] 优选地，所述用于抗体表达的表达框在基因水平上从上游到下游依次包括
[0016] 第一启动子-抗体的重链的编码序列-内部核糖体进入位点序列IRES序列-抗 体的轻链的编码序列-第二启动子-第二启动子控制表达的筛选基因。
[0017] 优选地，所述第一启动子选自巨细胞病毒启动子CMV、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、 泛素UBC启动子、延长因子EF1a启动子和猴多瘤病毒SV40启动子中的一种。
[0018] 优选地，所述第二启动子选自巨细胞病毒启动子CMV、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、 泛素UBC启动子、延长因子EF1a启动子和猴多瘤病毒SV40启动子中的一种。
[0019] 进一步优选地，所述第一启动子为巨细胞病毒启动子CMV。
[0020] 进一步优选地，所述第二启动子为猴多瘤病毒SV40启动子。
[0021] 优选地，所述筛选基因为二氢叶酸还原酶（DHFR)基因或谷氨酰胺合成酶（GS)基 因。
[0022] 优选地，控制所述二氢叶酸还原酶基因的第二启动子为巨细胞病毒启动子CMV启 动子。
[0023] 优选地，控制所述谷氨酰胺合成酶基因的第二启动子为猴多瘤病毒SV40启动子。
[0024] 优选地，所述第一启动子-抗体的轻链的编码序列-内部核糖体进入位点序列 IRES序列-抗体的重链的编码序列-第二启动子-第二启动子控制表达的筛选基因结构 中，所述启动子和抗体的轻链的编码序列之间还包括珠蛋白基因的内含子。
[0025] 优选地，所述第一启动子-抗体的重链的编码序列-内部核糖体进入位点序列 IRES序列-抗体的轻链的编码序列-第二启动子-第二启动子控制表达的筛选基因结构 中，所述启动子和抗体的重链的编码序列之间还包括珠蛋白基因的内含子。
[0026] 优选地，所述3 -珠蛋白基因的内含子的核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0027] 优选地，所述抗体的轻链的编码序列包括轻链的可变区编码序列和轻链的恒定区 编码序列。
[0028] 进一步优选地，所述轻链的可变区编码序列是如SEQIDN0 :2所示的核苷酸序列。
[0029] 进一步优选地，所述轻链的恒定区编码序列是如SEQIDN0 :3所示的核苷酸序列。
[0030] 优选地，所述抗体的重链的编码序列包括重链的可变区编码序列和重链的恒定区 编码序列。
[0031] 进一步优选地，所述重链的可变区编码序列是如SEQIDN0 :4所示的核苷酸序列。
[0032] 进一步优选地，所述重链的恒定区编码序列是如SEQIDN0 :5所示的核苷酸序列。
[0033] 优选地，所述内部核糖体进入位点序列IRES序列是如下1)或2)的核苷酸序列：
[0034] 1)如SEQIDN0 :6所示的核苷酸序列；
[0035] 2)与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的核 苷酸序列。
[0036] 优选地，所述第一启动子后可操作的连接的抗体的轻链的编码序列以及重链的编 码序列后还包括牛生长素多聚BGH腺苷酸序列（BGHpolyA)。
[0037] 优选地，所述第一启动子后可操作的连接的抗体的轻链的编码序列以及重链的编 码序列后还猴多瘤病毒SV40多聚腺苷酸序列（SV40polyA)。
[0038] 优选地，所述第二启动子控制表达的筛选基因后还包括牛生长素BGH多聚腺苷酸 序列（BGHpolyA)。
[0039] 优选地，所述第二启动子控制表达的筛选基因后还包括猴多瘤病毒SV40多聚腺 苷酸序列（SV40polyA)。
[0040] 第二方面，本发明提供了一种真核重组表达载体，包含如第一方面所述的用于抗 体表达的表达框。
[0041] 第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含如第二方面所述的真核重组表达载。
[0042] 优选地，所述宿主细胞为CH0-S细胞。
[0043] 第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的含有用于抗体表达的表达框的真 核重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：
[0044] 骨架载体为p⑶NA3. 1质粒，及
[0045] 所述谷氨酰胺合成酶基因插入在p⑶NA3. 1质粒的BstBI位点和Xmal位点之间， 及
[0046] 所述内部核糖体进入位点序列IRES序列插入到所述p⑶NA3. 1质粒的Nhel位点 和Bell位点之间，及
[0047] 所述抗体的轻链的编码序列插入在p⑶NA3. 1质粒Notl位点和Xhol位点之间，及
[0048] 所述抗体的重链的恒定区编码序列插入在p⑶NA3. 1质粒的Nhel位点和Bell位 点之间，及
[0049] 所述抗体的重链的可变区编码序列插入在p⑶NA3. 1质粒的BamHI位点和Nhel位 点位点之间，及
[0050] 所述3 -珠蛋白基因的内含子插入在p⑶NA3. 1质粒的Alflll位点和Xhol位点 之间，得到所述含有用于抗体表达的表达框的真核重组表达载体。
[0051] 第五方面，本发明提供了如第一方面所述的用于抗体表达的表