一种硫酸软骨素abc酶突变体融合蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因重组方法制备的定点突变的硫酸软骨素酶ABC融合蛋白。其 关键是硫酸软骨素酶ABC基因的定点改造、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。
【背景技术】
[0002] 硫酸软骨素裂解酶（chondroitinase或chondroitinsulfateyase，简称为 "ChSase"）是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖（ADi 及寡糖）的裂解酶。
[0003] 随着对ChSase的深入研宄，发现硫酸软骨素酶ABC(简称为"ChSaseABC"）有 着广泛的应用价值。科研人员利用ChSaseABC检测硫酸软骨素和生产低分子量硫酸软 骨素。鲍伦军，杨建成等用ChSaseABC酶解-高效液相色谱的方法检测鱼翅中的透明 质酸，采用Z0RBAX糖分析柱，紫外检测波长为226nm，检测到鱼翅中透明质酸的质量分 数为0.86-1. 96 % (鲍伦军等.鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定.色 谱，2002, 20(6) :557-559)。朱昱宁，敖雷等同样用酶解高效液相色谱的方法检测CS的含 量，采用UltimateXB-NH2柱，紫外检测波长为232nm，流动相为醋酸钠缓冲液（pH5. 6)-乙 腈（950:50)，流速为1.OmL/min，此色谱条件可将CSA，B，C分开（朱昱宁等.酶解高效液 相色谱法测定硫酸软骨素的含量.中国生化药物杂志，2012, 33(6) :827-829)。
[0004] 另外ChSaseABC在临床应用方面也有很大的作用。在缓解视网膜变性方面，可降 解硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs)，CSPGs是中枢神经系统（CNS)损伤后胶质瘢痕的重要组 分，可抑制神经轴突再生。CSPGs主要通过糖氨多糖链抑制神经再生，因此去除GAG或者干 扰其合成均可使轴突再生。黄玉苗，高朋芬等通过玻璃体腔注射ChSaseABC酶，免疫荧光 法观察CSPGs的表达，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR)法检测多功能蛋白聚糖mRNA的表 达，检测光感受器凋亡情况，结果表明ChaseABC能通过降解变性大鼠视网膜异常沉积的 CSPGs，抑制光感受器细胞的凋亡，从而促进损伤网膜的修复（黄玉苗等.硫酸软骨素酶缓 解视网膜变性大鼠光感受器细胞凋亡.扬州大学学报，2012, 33 (4) : 19-23.)。
[0005] 在提高后肢运动能力方面，ChSaseABC可以修复脊柱损伤。脊髓损伤是脊柱骨折 的常见并发症，可致肢体瘫痪，大小便失禁及呼吸肌瘫痪等一系列严重并发症，脊髓损伤后 神经再生和功能修复，是当今医学领域中的一大难题，ChSaseABC可以降解CSPGs。孙永 新，刘宁等利用ChSaseABC联合高压氧预处理对成年大鼠脊髓损伤后不同时期后肢运动功 能及腓肠肌运动终板内乙酰胆碱酯酶（AChE)含量的影响，来检测ChSaseABC的作用。结 果表明高压氧预处理可以改善大鼠患肢的运动功能和提高AChE的活性，联合ChSaseABC 作用更强（孙永新华等.硫酸软骨素酶ABC联合高压氧预处理对脊髓损伤大鼠后肢运动 功能的影响?解剖科学进展，2012, 18 (6): 526-529.)。NicoleJ.Tester等用ChSaseABC 来治疗受伤的猫，ChSaseABC修复了猫的脊柱损伤，提高了猫的运动能力（参见：Nic〇le J.etal.ChondroitinaseABCimprovesbasicandskilledlocomotioninspinalcord injuredcats.ExperimentalNeurology, 2008, 209(2):483-496)〇
[0006] 近年来，MarkRBrown等经研宄发现，突出椎间盘内的主要组分为蛋白聚糖， 而用ChSaseABC及ChSaseAC则可特异性降解掉突出的椎管内的糖胺聚糖、降低椎管 内压，同时对椎管外周组织无损害（Brown，MD.Methodfortreatingintervertebral discdisplacementwithenzymes[P]:US，4696816, 1987-09-29)。 2001 年Denholm EM等发现ChSaseAC、ChSaseB能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤细胞的转移与增生等 (DenholmEM,LinYQ,SilverPJ.Anti-tumoractivitiesofchondroitinaseAC andchondroitinaseB:inhibitionofangiogenesis,proliferationandinvasion. EuropeanJournalofPharmacology,2001，416(3):213-221)。LeeMC等发现当软骨 用ChSaseABC处理后，移植的软骨细胞与软骨创面的黏附能力大大增强；（LeeMC，Sung KL,KurtisMS,etal.Adhesiveforceofchondrocytestocartilageeffectsof chondroitinaseABC.ClinOrthop, 2000, 370(1):286-294)〇
[0007] 此外硫酸软骨素酶ABC还可用于酶解生产硫酸软骨素。对低分子量硫酸软骨素 的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方法需要较复杂的实验设备并且会 污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高、方法简便且容易控制。酶解法的关键在于获 得大量的硫酸软骨素裂解酶。分离纯化硫酸软骨素裂解酶的方法非常复杂，通常需要经 过多步的色谱纯化，收率很低。异源重组表达ChSaseABC是常用来提高ChSaseABC产 量的手段之一。然而对ChSaseABC的异源重组表达研宄非常有限，到目前为止国内还没 有这方面的报道。只有Pojasek等在E.coil中表达了硫酸软骨素酶AC酶和B酶的基因 (chsase基因），并分离纯化到活性蛋白，在其研宄中所用的载体为pET15b和pCRT7/NT，这 两个载体中的融合标签均为His-tag。但是His-tag存在明显的缺点，即跟亲和载体的亲 和力不强，不能增加与之结合蛋白质的可溶性，难以提高纯化效果和蛋白质可溶性比例等 (参见：KevinPojasek,ZacharyShriver,PatrickKiley,GaneshVenkataramanandRam Sasisekharan.RecombinantExpression,PurificationandKineticCharacterization ofChondroitinaseACandChondroitinaseBfromFlavobacteriumhparinum. BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications, 2001，286:343-351)〇
[0008] 专利申请CN103305496A公开了 一种从微生物提取硫酸软骨素酶的方法，但是该 方法提取步骤繁琐，成本较高。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明采用融合表达和定点突变的方法，获得了大量可 溶性的ChSaseABC突变体的融合蛋白，进一步地提高了ChSaseABC酶活；且采用一步纯化 的方法，纯化方法简单，并且得到高纯度的ChSaseABC突变体。
[0010] 本发明的主要目的在于提供一种硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白，其中，所述 硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白包括硫酸软骨素ABC酶突变体和麦芽糖结合蛋白，其中， 所述硫酸软骨素ABC酶突变体具有SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，所述麦芽糖结合蛋白 通过肽段连接部分与所述硫酸软骨素ABC酶N端连接。本发明提供了一种定点突变的硫酸 软骨素ABC酶融合蛋白，其特征是将Asn771位的氨基酸突变为Ala。
[0011] 优选地，本发明所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白中，所述麦芽糖结合蛋 白具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[0012] 优选地，本发明所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白中，所述硫酸软骨素ABC 酶突变体融合蛋白具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。
[0013] 优选地，本发明所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白中，以硫酸软骨素A为底 物，所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白的酶活和比酶活分别为24. 96IU/mLenzyme 和31. 32IU/mgprotein，以硫酸软骨素B为底物，所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白 酶活和比酶活分别为 21. 58IU/mLenzyme和 27. 07IU/mgprotein。
[0014] 优选地，本发明所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白中，所述的硫酸软骨素 ABC酶突变体融合蛋白的Vmax和kMt/Km，以硫酸软骨素A为底物时，分别为22. 52ymol/ L?s和50. 25L/ymol?s;以硫酸软骨素B为底物时，其分别为4. 59ymol/L?s和12. 22L/ Umol?s〇
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种DNA，所述DNA序列编码所述的硫酸软骨素AB