一种酸性β-葡聚糖酶NGlu及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉及一种葡聚糖酶NGlu及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 葡聚糖广泛存在于植物细胞壁中，是由0-1，3和0-1，4混合的糖苷键连接形 成的葡聚糖聚合物，为一种结构性非淀粉多糖（Non-starchpolysaccharides，NSP)，尤其 在禾谷类（如大麦、燕麦、黑麦和小麦等）的糊粉层和胚乳细胞壁中含量较高。葡聚糖 分为水溶性和水不溶性两种，水溶性的0 _葡聚糖所占的比例较大，可与水形成粘稠状物 质，而且葡聚糖浓度愈高，粘度越大。
[0003] 0-葡聚糖酶（0-Glucanase，E.C3.2. 1.73)是一种半纤维素水解酶，主要来源 于微生物，包括细菌（芽孢杆菌）、真菌（曲霉、毛霉、木霉等）和瘤胃微生物等。葡聚 糖酶能水解0 _糖苷键形成可溶性的小分子物质，可广泛应用于饲料、啤酒酿造等行业，具 有良好的市场应用前景。
[0004] 1、e-葡聚糖酶在饲料方面的应用
[0005] 随着我国的饲料工业的迅速发展，饲料原料的短缺问题日益严重，一些非常规饲 料原料如大麦、小麦、棕榈柏等也被大量应用，但这些原料中葡聚糖等抗营养因子含量 较高，一方面由于单胃动物不能分泌内源性葡聚糖酶，无法消化利用葡聚糖，另一 方面葡聚糖的存在会使动物消化道中的食糜产生较高的黏稠性，影响其它营养物质的 消化吸收，因此0-葡聚糖成为饲料中一种主要的抗营养因子，严重降低了这些原料的消 化利用。
[0006] e-葡聚糖酶作为一种饲料用酶，可有效地解决饲料原料中e-葡聚糖的抗营养 作用，其作用主要包括以下几个方面：
[0007] (1) 葡聚糖酶可以有效降解饲料原料中的葡聚糖，提高饲料的消化利用 率。
[0008] (2) 0 -葡聚糖酶可改善动物消化道的生态环境和功能。0 -葡聚糖酶水解0 -葡 聚糖后，食糜的粘性大大降低，排空速度提高，减少了肠道内发酵，尤其是厌氧微生物发酵 的可能性，从而降低了动物肠道疾病的发生。
[0009] (3)促进动物生长，提高机体免疫功能。研宄表明，麦类等高水平SNSP基础日粮中 添加以葡聚糖酶为主的NSP酶后，除了可以加强营养成分的消化吸收外，还能影响动物 神经内分泌调节，从而影响代谢，促进生长。
[0010] 2、0-葡聚糖酶在啤酒酿造方面的应用
[0011] 啤酒作为一种大众化的低度酒精饮料，消费量呈逐年上升趋势，据统计，2010年中 国啤酒产量达到4300万吨，连续9年位居世界第一。
[0012] 在啤酒生产时需要用到大麦，其中0-葡聚糖含量高达4%-8%，大麦中存在的 0 -葡聚糖在糖化时会使麦汁黏度增高，易吸附蛋白质等高分子物质，造成麦糟"板结"，从 而导致麦汁和啤酒过滤困难，降低麦汁得率；另外，大麦0 -葡聚糖不能被酵母利用或分 解，易引起啤酒混浊和凝胶沉淀，影响啤酒的稳定性，降低啤酒的品质，0 -葡聚糖的残留会 造成啤酒酒体混浊、泡沫持久力减少和挂杯力不强。
[0013] 由于大麦中葡聚糖的影响，每年对啤酒行业造成的经济损失估计在20亿元左 右，成为困扰啤酒行业发展的一个难题。最近的研宄及应用情况表明，葡聚糖酶可有效 地去除啤酒糖化过程大麦中的0 _葡聚糖，可从根本上解决这一问题。
[0014] 0 -葡聚糖酶应用于啤酒生产中，可以分解大麦及麦芽中的0 -葡聚糖凝胶，降低 啤酒的混浊度，提高啤酒产品质量，从而取得了良好的经济效益。目前，美国、日本、德国、加 拿大等国家均已采用0-葡聚糖酶作为啤酒工业的主要酶制剂。
[0015] e-葡聚糖酶作为一种啤酒酿造用酶，其作用主要包括以下几个方面：
[0016] (1)有效降解大麦胚乳细胞中的葡聚糖，增加酵母可发酵产物，提高啤酒生产 得率。葡聚糖酶可专一性地分解大麦中粘度很高的葡聚糖，能够疏松大麦胚乳细胞 壁，促进细胞内容物的外溢，提高了酵母对原料的利用率，从而提高了啤酒产量。
[0017] (2)降低麦汁粘度，改善过滤性能，提高过滤速度，使过滤后的麦汁清亮度提高。
[0018] (3)提高啤酒的胶体稳定性，清除因0 -葡聚糖引起的冷混浊。
[0019] 除了以上应用之外，葡聚糖酶还可用于制糖、环保及资源处理等方面，应用前 景非常广阔。
[0020] 本发明提供了一种新型葡聚糖酶，并可在毕赤酵母这一真核系统中高效表 达，具有重要的工业应用价值。
【发明内容】
[0021] 本发明的目的是提供一种新型e-葡聚糖酶NGlu。
[0022] 本发明的另一目的是提供编码上述新型0 _葡聚糖酶的基因GNGlu。
[0023] 本发明的另一目的是提供包含上述新型0 _葡聚糖酶NGlu的重组载体。
[0024] 本发明的另一目的是提供包含上述新型0 -葡聚糖酶基因GNGlu的重组菌株。
[0025] 本发明的另一目的是提供制备上述新型0-葡聚糖酶NGlu的方法。
[0026] 本发明的另一目的是提供上述新型0 _葡聚糖酶NGlu的应用。
[0027] 本发明从黑曲霉（Aspergillusniger)中获得新型|3 -葡聚糖酶NGlu，其氨基酸 序列如SEQIDNO. 1所示：
[0028]
【主权项】
1. 一种0 -葡聚糖酶NGlu，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. -种葡聚糖酶基因GNGlu，其特征在于，编码权利要求1所述的葡聚糖酶。
3. 根据权利要求1所述的0 -葡聚糖酶基因GNGlu，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。
4. 包含权利要求2所述0 -葡聚糖酶基因GNGlu的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPICzaA-GNGlu。
6. 含有权利要求2所述-葡聚糖酶基因GNGlu的重组菌株。
7. -种发酵制备0 -葡聚糖酶NGlu的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求4所述的重组载体pPICzaA-GNGlu转化宿主细胞X33,得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导新型0 -葡聚糖酶NGlu的表达；以及 3) 回收并纯化所表达的新型葡聚糖酶NGlu。
8. 根据权利要求7所述的发酵制备葡聚糖酶NGlu的方法，其特征在于，步骤2)分 为二个阶段： 第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的2L50 %的甘油或葡萄糖，培养20-24小时， 流加甘油或葡萄糖完后结束； 第二阶段为饥饿阶段，甘油或葡萄糖流加完之后，当溶氧上升至80%以上、pH上升即 表明该阶段结束； 第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，整个发酵培养 时间约190小时左右。
9. 权利要求1所述0 -葡聚糖酶NGlu的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉及一种β-葡聚糖酶NGlu及其基因和应用。本发明提供了一种新型β-葡聚糖酶NGlu，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述新型β-葡聚糖酶的基因GNGlu，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还提供了包含上述基因的重组载体、重组菌株及其应用。本发明的新型β-葡聚糖酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可较大程度地降低生产成本，使其在饲料、啤酒酿造等工业中具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15-56, C12N15-81, C12R1-84, C12N9-42
【公开号】CN104711241
【申请号】CN201510145668
【发明人】张慧君, 王俊峰, 张鹏鹏, 林海晶
【申请人】江苏奕农生物工程有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月30日