禽呼肠孤病毒σA蛋白及其相关生物材料的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种禽呼肠孤病毒〇A蛋白及其相关生物材料的应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 真核细胞内存在多条信号转导通路，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)信号通路在众多 信号通路中发挥十分重要的作用，可通过其下游效应分子蛋白激酶B(Akt)来调控多种细 胞功能，如细胞增殖与分化、抑制细胞凋亡等，病毒感染通常会干扰该信号通路。PI3K是 由催化亚基pll〇和调节亚基P85所组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重 活性。研宄表明，病毒蛋白或细胞蛋白通过PXXP(P为脯氨酸，X为任意氨基酸）或YXXXM/ YXXM(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，M为蛋氨酸）基序与P85结合，从而激活PI3K/Akt信号 通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高，实现抑制细胞凋亡的发生。
[0003] 大量的研宄资料表明，当病毒侵入宿主细胞后，被感染的细胞能被宿主的免疫系 统识别，并通过诱导细胞凋亡而对感染了病毒的细胞加以清除，从而限制病毒在细胞内的 复制及传播。但是在选择压力的作用下，许多病毒已经进化出某些可以逃避细胞凋亡的机 制，使得病毒在宿主细胞死亡之前能完成其复制周期，这些对抗措施通常是由病毒蛋白来 介导的。许多病毒通过自身的某些蛋白与PI3K的P85调节亚基结合，进而激活PI3K/Akt 信号通路，促进P-Akt的转录表达。P-Akt表达量的升高，可磷酸化许多信号蛋白，并通过这 些蛋白调节与细胞生存、增殖、迀移、分化和凋亡有关的多条下游信号转导通路，如通过抑 制促凋亡蛋白的活性，从而抑制凋亡刺激信号诱发的细胞凋亡，还可通过控制凋亡调苄基 因的表达而抑制细胞调亡。
[0004]Labrada和Shih等的研宄表明，禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV)引起感染细 胞出现细胞凋亡是发生在其感染的中后期。Lin等使用ARV感染Vero细胞后，通过Western blot检测P-Akt的表达量，从病毒的角度证实了ARV感染的早期激活了PI3K/Akt信号通 路，从而抑制了感染细胞的凋亡，以有利于ARV完成其复制周期。ARV怎样来启动PI3K/Akt 信号通路，实现抑制感染细胞的凋亡，目前还不清楚，找出能激活PI3K/Akt信号通路的ARV 物质，从细胞信号转导的角度揭示ARV的分子致病机制，可以为寻找抗ARV药物作用靶点提 供新的思路。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是确定激活PI3K/Akt信号通路的ARV蛋白，进而可将 其作为抗ARV药物的作用靶点。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供禽呼肠孤病毒的〇A蛋白或其相关生物材料 在制备提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表达量的产品中的应用；
[0007] 所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
[0008] B1)编码所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的核酸分子；
[0009] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0010]B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0011]B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0012]B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0013] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0014]B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0015]B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0016]B9)表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞。
[0017] 为了解决以上技术问题，本发明还提供禽呼肠孤病毒的〇A蛋白或其相关的生物 材料在制备激活细胞内PI3K/Akt信号通路产品中的应用；
[0018] 所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：
[0019]B1)编码所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的核酸分子；
[0020] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0021]B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0022] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0023]B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0024]B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0025] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0026]B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0027]B9)表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞。
[0028] 上述任一所述的生物材料中，B1)所述的核酸分子为如下1)或2)或3)所示的核 酸分子，即〇A基因：
[0029] 1)核苷酸序列是SEQIDNo. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0030] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述〇A蛋白的 cDNA分子或基因组DNA分子；
[0031] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述〇A蛋白的cDNA 分子或基因组DNA分子；
[0032] 其中，SEQIDNo. 2由1251个核苷酸组成，SEQIDNo. 2的核苷酸编码SEQIDNo. 1 所示的氨基酸序列；
[0033] 所述〇A蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
[0034] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码〇A蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 人工合成的编码〇A蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码〇A蛋白 且具有相同功能的蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列；
[0035] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0036] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次 15min;
[0037] 上述75%或75%以上同一性，可为80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0038] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的核酸分子的表 达盒（〇A基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达〇A蛋白的DNA，该DNA不但可包括启 动〇A基因转录的启动子，还可包括终止〇A基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可 包括增强子序列。
[0039] 上述生物材料中，可用现有的表达载体构建含有所述〇A基因表达盒的重组载 体。
[0040] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0041] 上述生物材料中，所述的微生物可为原核微生物或真核微生物；所述原核微生物 可为细菌；所述细菌可为埃希氏菌属细菌；所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌；所述真核 微生物可为藻类、真菌、原生动物；所述真菌可为单细胞真菌；所述单细胞真菌可为酵母 菌。
[0042] 上述生物材料中，所述重组载体为将pcAGEN的XhoI和NotI位点间的DNA替换 为SEQIDNo. 2所示的DNA，保持pcAGEN的其余序列不变，得到的表达所述禽呼肠孤病毒的 〇A蛋白的重组表达载体。
[0043] 为了解决以上技术问题，本发明还提供表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞在 制备筛选抑制感染禽呼肠孤病毒的细胞中禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性的物质的细胞模型 中的应用；
[0044] 本文中所述表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞可为表达禽呼肠孤病毒〇A蛋 白的重组哺乳动物细胞，如表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组Vero细胞。
[0045] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性的物质在 制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
[0046] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性的物质在 制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
[0047] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白表达的物质在 制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
[0048] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白表达的物质在 制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
[0049] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A基因表达的物质在 制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用。
[0050] 为了解决以上技术问题，本发明还提供抑制禽呼肠孤病毒〇A基因表达的物质在 制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
[0051] 为了解决以上技术问题，本发明还提供以禽呼肠孤病毒〇A蛋白为作用靶点的物 质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用；
[0052]或，
[0053] 为了解决以上技术问题，本发明还提供以禽呼肠孤病毒〇A蛋白为作用靶点的物 质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用；
[0054]或，
[0055] 为了解决以上技术问题，本发明还提供以禽呼肠孤病毒〇A基因为作用靶点的物 质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的疾病的产品中的应用；
[0056]或，
[0057] 为了解决以上技术问题，本发明还提供以禽呼肠孤病毒〇A基因为作用靶点的物 质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖的产品中的应用。
[0058] 上述任一所述的应用中，所述〇A蛋白的氨基酸序