列如SEQIDNo.1所示，所述 〇A基因为如下1)或2)或3)所示的核酸分子：
[0059] 1)核苷酸序列是SEQIDNo. 2的cDNA分子或DNA分子；
[0060] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述〇A蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0061] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述〇A蛋白的cDNA 分子或基因组DNA分子；
[0062] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码〇A蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 人工合成的编码〇A蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码〇A蛋白 且具有相同功能的蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列； [0063] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高， 或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性；
[0064] 所述严格条件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min;
[0065] 所述75%或75%以上同一性，可为80 %、85%、90%或95%以上的同一性。
[0066] 上述任一所述的应用中，所述禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性具体为其提高细胞内磷 酸化的蛋白激酶B(P-Akt)的表达量和/或激活细胞内PI3K/Akt信号通路的活性。
[0067] 本发明证明，与阴性细胞对照组和空载体pcAGEN组相比，转染〇A-pcAGEN或 〇NS-pcAGEN的Vero细胞的P-Akt的表达量明显升高。而转染〇A-pcAGEN或〇NS-pcAGEN 前在Vero细胞培养液中加入PI3K特异性抑制剂LY294002时所检测到的P-Akt，与阴性细 胞对照组和空载体pcAGEN组相比并没有升高，说明Akt的磷酸化依赖于PI3K的激活，本发 明首次证实了ARV的〇A蛋白、〇NS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P-Akt的表达 量升高。
[0068] 鉴于PI3K/Akt信号通路的激活可抑制宿主细胞的凋亡，以有利于病毒的复制，在 实际应用中，可将ARV的〇A蛋白和/或〇NS蛋白作为抗ARV药物的作用靶点，通过抑制感 染ARV的细胞中ARV〇A蛋白和/或〇NS蛋白的表达，来抑制PI3K/Akt信号通路的激活， 促进感染ARV的细胞的凋亡，进而抑制ARV的复制，本发明为ARV的治疗提供了新的方向和 思路。也可将表达ARV的〇A蛋白和/或〇NS蛋白的重组细胞作为筛选抑制感染ARV的 细胞中ARV〇A蛋白和/或〇NS蛋白的物质的细胞模型以筛选预防和/或治疗禽呼肠孤病 毒引起的疾病的广品。
【附图说明】
[0069] 图1为〇A基因片段1、〇NS基因片段1、yA基因片段1、yB基因片段1和yNS 基因片段1的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0070] 图2为转染6h后的各组细胞的间接免疫灰光检测结果。
[0071] 图3为转染6h后的各组细胞的目的蛋白的Westernblot检测结果。
[0072] 图4为转染6h后的各组细胞的流式细胞术检测P-Akt的表达结果。图中的百分 数为P-Akt阳性细胞的百分率。
[0073] 图5为转染6h后的Westernblot检测P-Akt的表达结果。
【具体实施方式】
[0074] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0075] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0076] 下述实施例中的实验如无特殊说明均为3次重复。
[0077] 禽呼肠孤病毒S1133标准强毒株（ARV-S1133)(Avianreovirus)为中国兽医药品 监察所产品，产品目录号为AV2311。
[0078]真核表达载体pcAGEN在文献"WengY,LuW,HarmonA,XiangX，DengQ,SongM,et al.Thecellularendosomalsortingcomplexrequiredfortransportpathwayisnot involvedinavianmetapneumovirusbuddinginavirus-like-particleexpression system.JGenVirol. 2011 ;92:1205-13"中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研宄所 获得。
[0079]Vero细胞为中国典型培养物保藏中心产品。
[0080]PMD18-T载体为宝生物工程（大连）有限公司产品。
[0081]Lipofectamine? 2000 为Invitrogen公司产品。
[0082]Alexafluor488标记的羊抗鸡IgY、Alexafluor488标记的羊抗兔IgG均为 abeam公司产品，产品目录号分别为abl50173、abl50081。
[0083]Phospho-Akt单克隆抗体为CST公司产品，产品目录号为2965。
[0084]Cytofix固定/破膜试剂盒为BD公司产品。
[0085]PI3K特异性抑制剂LY294002为CST公司产品。
[0086] 实施例1、禽呼肠孤病毒〇A蛋白和〇NS蛋白激活PI3K/Akt信号通路
[0087] 一、引物的设计与合成
[0088] 根据禽呼肠孤病毒（ARV)的〇A、〇NS、yA、yB和yNS的基因序列，设计并合成 表1的5对引物。
[0089] 表1引物序列
[0090]
【主权项】
1. 禽呼肠孤病毒的0A蛋白或其相关生物材料在制备提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B 的表达量的产品中的应用； 所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种： B1)编码所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； B9)表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞。
2. 禽呼肠孤病毒的〇A蛋白或其相关的生物材料在制备激活细胞内PI3K/Akt信号通 路产品中的应用； 所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的相关生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种： B1)编码所述禽呼肠孤病毒的〇A蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； B9)表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞。
3. 表达禽呼肠孤病毒〇A蛋白的重组细胞在制备筛选抑制感染禽呼肠孤病毒的细胞 中禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性的物质的细胞模型中的应用。
4. 抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白活性的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的 疾病的产品中的应用。
5. 抑制禽呼肠孤病毒〇八蛋白活性的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖 的产品中的应用。
6. 抑制禽呼肠孤病毒〇A蛋白表达的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的 疾病的产品中的应用。
7. 抑制禽呼肠孤病毒〇八蛋白表达的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖 的产品中的应用。
8. 抑制禽呼肠孤病毒〇A基因表达的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起的 疾病的产品中的应用。
9. 抑制禽呼肠孤病毒〇八基因表达的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增殖 的产品中的应用。
10. 以禽呼肠孤病毒〇A蛋白为作用靶点的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒 引起的疾病的产品中的应用； 或， 以禽呼肠孤病毒〇A蛋白为作用靶点的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增 殖的产品中的应用； 或， 以禽呼肠孤病毒〇A基因为作用靶点的物质在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒引起 的疾病的产品中的应用； 或， 以禽呼肠孤病毒〇A基因为作用靶点的物质在制备抑制禽呼肠孤病毒的生长和/或增 殖的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种禽呼肠孤病毒σA蛋白及其相关生物材料的应用。本发明公开禽呼肠孤病毒的σA蛋白或其相关生物材料在制备提高细胞内磷酸化的蛋白激酶B的表达量的产品中的应用。本发明首次证实了ARV的σA蛋白、σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P-Akt的表达量升高，因此，有望通过抑制ARVσA蛋白和/或σNS蛋白的表达，来抑制PI3K/Akt信号通路的激活进而抑制ARV的复制，从而发现ARV的治疗药物的新靶点。本发明为ARV的治疗提供了新的方向和思路。
【IPC分类】G01N33-68, C12N1-15, C12N9-12, C12N1-21, C12N15-46, C12N1-19, C12N5-10, C12N15-63
【公开号】CN104711240
【申请号】CN201510121667
【发明人】谢芝勋, 谢丽基, 黄莉, 谢志勤, 邓显文, 刘加波, 罗思思, 黄娇玲, 曾婷婷, 张艳芳, 王盛
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月18日