一种从油菜叶中提取高纯度sod的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，属于食品深加工的领域。
技术背景
[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase),简称S0D,是一种新型酶制剂,属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
[0003]从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取S0D，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取S0D，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD的主要传统工艺流程为:植物—打浆一超滤分离一有机溶剂去杂一柱层析精制一超滤浓缩一冷冻干燥一产品。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，该方法采用独有的磷酸钾缓冲液配方:50mmol/L的磷酸钾缓冲液,除含有磷酸钾外,还含有lmmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9 ；5mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有lmmol/L的巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9 ;并且优化了离子交换柱和凝胶柱分离的条件；通过该法可以获得纯度更高、成本更低的S0D。
[0005]本发明的技术方案:
A、取新鲜的油菜叶I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，搅打匀浆，用100-120目筛抽滤，将滤液以3000-5000转/分钟，离心16-25分钟获得叶绿体；
B、将A步骤所得叶绿体用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机4000-6000转/分钟，离心20-30分钟，获得上清液即为粗酶液；
C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到50-60%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心30-40分钟，取上清液；
D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为93-97%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心40-50分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ；
Ejf D步骤所得的粗制S0D，加入3-5倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/3-1/4 ；
F、将E步骤所得浓缩液经SephadexG-75凝胶柱或DEAE- Sephadex A-50离子交换柱进行提纯；凝胶柱的洗脱液为5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶；离子交换柱的洗脱液为5-300mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行梯度洗脱；
G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 SOD。
[0006]其中，50mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有lmmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9 ；5mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有lmmol/L的巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9。
[0007]本发明解决的技术问题:
1、采用了新的工艺流程，比传统工艺步骤少，设备简单，节约了成本，易于推广。
[0008]2、采用了独有的磷酸钾缓冲液配方，在提高了分离效率的同时对SOD的活性进行了很好的保护，保证了成品的质量。
[0009]3、对不同类型的柱子采用新的洗脱条件，提高了产品的活性和纯度，本发明可以将产品提纯150倍，传统工艺在100倍左右，而活性比传统工艺提高了 10倍。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:
A、取新鲜的油菜叶100公斤,加入200公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液中,搅打勻衆,用100目筛抽滤，将滤液以3000转/分钟，离心25分钟获得叶绿体；
B、将A步骤所得叶绿体用20公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机4000转/分钟，离心30分钟，获得上清液即为粗酶液；
C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到50%，静置2小时，经离心机4000转/分钟，离心40分钟，取上清液；
D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为93%，静置2小时，经离心机4000转/分钟，离心40分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ；
Ejf D步骤所得的粗制SODjaA 3倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/3 ；
F、将E步骤所得浓缩液经SephadexG-75凝胶柱，洗脱液为5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行洗脱；
G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 S0D。
[0011]所得SOD的活性为:1156.3U/mg，提纯倍数为:142.22倍。
[0012]实施例2:
A、取新鲜的油菜叶100公斤,加入300公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液中,搅打勻衆,用110目筛抽滤，将滤液以5000转/分钟,离心16分钟获得叶绿体；
B、将A步骤所得叶绿体用30公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机6000转/分钟，离心20分钟，获得上清液即为粗酶液；
C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到60%，静置4小时，经离心机6000转/分钟，离心50分钟，取上清液；
D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为97%，静置4小时，经离心机6000转/分钟，离心50分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ； Ejf D步骤所得的粗制SODjaA 5倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/4 ；
F、将E步骤所得浓缩液经SephadexG-75凝胶柱，洗脱液为5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行洗脱；
G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 S0D。
[0013]所得SOD的活性为:1048.3U/mg，提纯倍数为:148.13倍。
[0014]实施例3:
A、取新鲜的油菜叶100公斤,加入250公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液中,搅打勻衆,用100目筛抽滤,将滤液以4500转/分钟,离心20分钟获得叶绿体；
B、将A步骤所得叶绿体用25公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机5000转/分钟，离心25分钟，获得上清液即为粗酶液；
C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到55%，静置3小时，经离心机5000转/分钟，离心45分钟，取上清液；
D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为95%，静置3小时，经离心机5000转/分钟，离心45分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ；
Ejf D步骤所得的粗制SODjaA 4倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/4 ；
F、将E步骤所得浓缩液经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱进行提纯；离子交换柱的洗脱液为5-300mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行梯度洗脱；
G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 S0D。
[0015]所得SOD的活性为:1279.lU/mg，提纯倍数为:156.23倍
实施例4:
A、取新鲜的油菜叶100公斤,加入240公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液中,搅打勻衆,用110目筛抽滤，将滤液以4000转/分钟,离心25分钟获得叶绿体；
B、将A步骤所得叶绿体用20公斤50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机5000转/分钟，离心25分钟，获得上清液即为粗酶液；
C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到56%，静置3小时，经离心机5000转/分钟，离心40分钟，取上清液；
D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为96%，静置2.5小时，经离心机5000转/分钟，离心45分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ；
Ejf D步骤所得的粗制S0D，W；V 3倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/4 ；
F、将E步骤所得浓缩液经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱进行提纯；离子交换柱的洗脱液为5-300mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行梯度洗脱；
G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 SOD。
[0016] 所得SOD的活性为:1215.6U/mg，提纯倍数为:151.74倍。
【主权项】
1.一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，其特征在于，该方法通过以下工艺步骤: A、取新鲜的油菜叶I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，搅打匀浆，用100-120目筛抽滤，将滤液以3000-5000转/分钟，离心16-25分钟获得叶绿体； B、将A步骤所得叶绿体用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸钾缓冲液冲洗两次；放入5mmol/L的磷酸钾缓冲液中，一边搅拌一边用超声波进行粉碎处理，经离心机4000-6000转/分钟，离心20-30分钟，获得上清液即为粗酶液； C、向B步骤所得粗酶液中加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度达到50-60%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心30-40分钟，取上清液； D、向C步骤所得上清液中加入硫酸铵至饱和浓度为93-97%，静置2-4小时，经离心机4000-6000转/分钟，离心40-50分钟，所得沉淀物即为粗制的SOD ； Ejf D步骤所得的粗制S0D，加入3-5倍体积的5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶解并透析，将透析过的溶液通过低温真空浓缩至原体积的1/3-1/4 ； F、将E步骤所得浓缩液经SephadexG-75凝胶柱或DEAE- Sephadex A-50离子交换柱进行提纯；凝胶柱的洗脱液为5mmol/L的磷酸钾缓冲液溶；离子交换柱的洗脱液为5-300mmol/L的磷酸钾缓冲液溶，进行梯度洗脱； G、将F步骤所得洗脱液经低温真空浓缩，然后冷冻干燥后即可获得高纯度的油菜叶绿体 S0D。
2.如权利要求1所述的一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，其特征在于，所述50mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有lmmol/L的EDTA、0.4mmol/L的鹿糖、0.01%巯基乙醇，且缓冲液的pH值为7.9。
3.如权利要求1所述的一种从油菜叶中提取高纯度SOD的方法，其特征在于，所述5mmol/L的磷酸钾缓冲液，除含有磷酸钾外，还含有lmmol/L的巯基乙醇，且缓冲液的pH值为 7.9。
【专利摘要】本发明涉及一种从油菜叶中提取高纯度SOD（超氧化物歧化酶）的方法。取新鲜的油菜叶1重量份，加入2-3重量份的磷酸钾缓冲液中，匀浆、离心获得叶绿体；再将叶绿体放入磷酸钾缓冲液中，结合超声波处理，离心获得粗酶液；加硫酸铵沉淀获得粗SOD，净离子交换柱分离、浓缩、冷冻干燥获得高纯度的SOD制品。该方法生产SOD具有纯度高、成本低、易推广应用等优点。
【IPC分类】C12N9-02
【公开号】CN104711233
【申请号】CN201310679110
【发明人】张涛
【申请人】张涛
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月14日