中，并进行测序，测序结果表明，已成功将Asn771突变成Ala。图1中，泳道M为 分子量marker(条带大小依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、lkb)，泳道1为扩增得 到的pMAL-C2x-ChSaSeABCI突变体，箭头所指处为9.6kb目标片段，表明已成功PCR得到 pMAL-c2x-ChSaseABCI突变体。
[0093] 二、硫酸软骨素ABC酶突变的融合蛋白MBP-ChSaseABC的表达
[0094] 提取步骤一中含有突变的pMAL-c2x-ChSase ABC的大肠杆菌DH5a中的质粒，按 照常规方法转化大肠菌BL21 (DE3)。经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中步骤1提供的引 物进行菌落PCR鉴定，得到含有突变的pMAL-C2x-ChSaSe ABC的大肠杆菌BL21 (DE3)，即 BL21(DE3)/pMAL-ChSase ABC作为表达突变的MBP-ChSase ABC I的工程菌。
[0095]以质粒pMAL-c2x转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到空载体对照BL21 (DE3)/ pMAL-c2x〇
[0096] 将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基（NaC110g/L，酵母 提取物为5g/L，蛋白胨10g/L，含100yg/L氨苄青霉素）37摄氏度培养2. 5小时后，加入 终浓度为〇. 5mMIPTG16摄氏度诱导20小时。6000rpm，6分钟离心收集菌体并用20mM Tris-HCl(pH7.4)洗涤两次，然后重悬菌体。将重悬液进行超声破碎（输出功率为300W， 每次超声5秒和间歇6秒，处理总时间为15分钟），6000rpm，6分钟离心，超声破碎后离心 所得的上清液即为含硫酸软骨素ABC酶突变体的粗产物。
[0097]实施例2、通讨言链淀粉梓纯化硫酸软骨素ABC酶突夺体融合蛋白
[0098] 本实施例利用融合伴侣（fusionpartner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉 亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下：将终浓度为〇.5mMIPTG诱导表达20 小时的菌体100mL，6000rpm离心6分钟；同时设未诱导表达的菌体对照。接着按以下两个 方案分别操作：
[0099] 用柱平衡液Columnbuffer(20mMTris-HCl，200mMNaCl，pH7. 4)洗涤两次，重悬 在30mLColumnbuffer中，进行超声破碎（输出功率为300W，每次超声5秒和间歇6秒，处 理总时间为15分钟）。
[0100] 离心后上清液以lmL/min通过lmL预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过10mMlmL/ min麦芽糖洗脱并收集。
[0101]目标蛋白经过直链淀粉（amylose)树脂吸附后，用10mM麦芽糖在2个柱体积下 能够将目标蛋白洗脱。结果如图2所示，表明经过直链淀粉树脂一步纯化后目标蛋白可占 90%以上。图2中，泳道M为marker(由上至下分子量依次均为250kDa、150kDa、100kDa、 70kDa)，泳道1为空白对照、泳道2为E.coliBL21 (DE3) /pMAL-ChSaseABC突变体的可溶 蛋白，箭头所指处为MBP-ChSaseABCI突变体融合蛋白（140kDa)。
[0102] 酶活力（单位为IU/mL)的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活定义为37摄氏 度每分钟产生1UmoL不饱和二糖的反应效力。将硫酸软骨素A或B配制成lmg/mL的底物 溶液，取底物溶液2mL，加入直链淀粉柱纯化所得的50yL的纯化产物，最终的反应体积为 2.05mL，测单位时间内在232nm的吸光度变化AA232。消光系数e= 38001^。比酶活（单 位为IU/mg蛋白）的定义为酶活力与蛋白浓度（单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用 常规的Bradford法。
[0103] 综上，通过定点突变使MBP-ChSaseABCI的酶活提高了 ：以硫酸软骨素A为底 物，Asn771Ala的酶活和比酶活分别为 24. 96IU/mLenzyme和 31. 32IU/mgprotein，以硫 酸软骨素B为底物，酶活和比酶活分别为21.58IU/mLenzyme和27.07IU/mg。未突变的 MBP-ChSaseABCI，以硫酸软骨素A为底物，酶活和比酶活分别为20. 18IU/mLenzyme和 22. 52IU/mgprotein，以硫酸软骨素B为底物，酶活和比酶活分别为13. 08IU/mLenzyme和 14.60IU/mgprotein。
[0104] 本发明还可通过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。与现有技术中 使用的鱼精蛋白沉淀（参考ANA LYDIA TKALEC, DOMINIQUE FINK等人，Isolation and Expression in Escherichia coli of cslA and cs IB,Genes Coding for the Chondroitin Sulfate-Degrading Enzymes Chondroitinase AC and Chondroitinase B, Respectively, from Flavobacterium heparinum. APPL. ENVIRON. MICROBIOL.2000, 66(1) : 29-35)和一步柱纯化法相比（参见表1)，可以大大缩短纯化需要 的时间，并且纯化所用的设备明显减少，降低了纯化硫酸软骨素酶的生产成本。利用直链淀 粉树脂的纯化仅需要进行2个小时左右，即可获得能够用于工业生产的硫酸软骨素ABC酶 突变体融合蛋白。纯度达到可以应用的95%以上。
[0105] 表1鱼精蛋白沉淀和本发明一步柱纯化法相比
【主权项】
1. 一种硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白，其中，所述硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋 白包括硫酸软骨素ABC酶突变体和麦芽糖结合蛋白，其中，所述硫酸软骨素ABC酶突变体具 有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，所述麦芽糖结合蛋白通过肽段连接部分与所述硫酸软 骨素ABC酶N端连接。
2. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白，其中，所述麦芽糖结合蛋 白具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白，其中，所述硫酸软骨素 ABC酶突变体融合蛋白具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白，其中，以硫酸软骨素 A为底物，所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白的酶活和比酶活分别为24. 96IU/mL enzyme和31. 32IU/mgprotein，以硫酸软骨素B为底物，所述的硫酸软骨素ABC酶突变体 融合蛋白酶活和比酶活分别为21. 58IU/mLenzyme和27. 07IU/mgprotein。
5. -种DNA，所述DNA序列编码权利要求1~4任一项中所述的硫酸软骨素ABC酶突 变体融合蛋白。
6. -种重组载体，所述重组载体包括载体和权利要求5所述的编码硫酸软骨素ABC酶 突变体融合蛋白DNA，其中所述载体包括pMAL-c2x。
7. -种转化体，所述转化体是将权利要求6所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转 化体，其中，所述宿主细胞包括E.coliBL21 (DE3)。
8. -种制备权利要求1~4任一项所述硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白的方法，所 述制备方法包括： (1) 使用PCR通过带有突变位点的引物获得所述的的pMAL-c2x-ChSaseABCI突变体 的重组载体； (2) 转化所述步骤（1)中的所述重组载体到所述宿主细胞，表达所述硫酸软骨素ABC酶 突变体融合蛋白；以及 (3) 破碎所述转化体，使用麦芽糖结合蛋白亲和层析分离所述表达的硫酸软骨素ABC 酶突变体融合蛋白。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述步骤（3)中麦芽糖结合蛋白亲和层析包 括使用直链淀粉树脂、马铃薯淀粉柱分离。
10. -种生产低分子量硫酸软骨素的方法，所述生产方法包括：使用权利要求1~4任 一项所述的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白生产低分子量硫酸软骨素。
【专利摘要】本发明提供了一种突变的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白、其编码基因以及其制备方法。本发明的硫酸软骨素ABC酶突变体融合蛋白采用一步纯化的方法，纯化方法简单，并且得到高纯度、高活性的ChSase ABC突变体。得到的ChSase ABC具有高酶活，能够用于生产硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。
【IPC分类】C12N9-88, C12N15-62, C12P19-26, C12N1-21, C12N15-70, C07K14-245
【公开号】CN104711245
【申请号】CN201510125696
【发明人】李晔, 陈振娅, 陈亮, 辛秀兰
【申请人】北京电子科技职业学院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月20日