青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶 及其在烟草薄片加工过程中的应用。
【背景技术】
[0002] 果胶酶是一种由多种组分组成的复合酶，各组分能够协同完成果胶的降解，在食 品加工、饲料加工、纺织、造纸、环境保护等方面具有较为广泛的用途。果胶酶的生产已有 40多年的历史，主要有固态发酵法和液体发酵法两种生产方式。许多微生物都具有产生果 胶酶的能力，现有技术中，果胶酶生产产酶菌株主要是真菌，并且以曲霉属菌种应用较为广 泛。一般而言，固态发酵法所产果胶酶酶活较高，但是存在设备放大困难，自动化程度偏低， 工艺参数不易控制等缺陷；而液体发酵虽然酶活存在一定程度的降低，但是由于能够连续 自动化生产，且容易扩大生产规模，而且发酵过程易控制，因而已成为果胶酶生产的主要生 产方式。
[0003] 果胶酶的工业化生产始于二十世纪五十年代，主要生产国有德国、法国、意大利、 丹麦、荷兰、日本等。我国对于果胶酶的研宄起始于上世纪八十年代早期，近年虽然在发酵 菌株选育、发酵工艺、应用工艺改良等方面取得了长足的进步，但是随着对于高产量、高质 量的果胶酶需求，现有的果胶酶生产工艺仍需进一步优化完善。
[0004] 近年来，多菌混合发酵技术得到了长足进步。一般而言，多菌种作为一个生物混合 体系，各菌种之间具有生长代谢协调的作用，因而多菌种混合发酵比单菌种发酵产酶具有 更多优势。但是由于微生物代谢产物的复杂性、多样性，加上不同微生物发酵之间的竞争、 抑制作用也错综复杂，因而针对不同的微生物组合常需探讨不同的最优发酵条件组合。
[0005] 造纸法烟草薄片（Paper-ProcessReconstitutedTobacco)是一种烟草资源再生 利用的产品。它是利用一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸 提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成烟叶薄片，用作卷烟填充物。造 纸法烟草薄片，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量 等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近年最重要的 成果之一。而近年来，生物技术与造纸法烟草薄片技术在生产中的结合应用，不仅发挥了造 纸法烟草薄片的工艺优势，而且利用生物技术有选择地改变烟草化学成分，明显改善了烟 草薄片的品质。
[0006] 研宄表明，烟草原料中的纤维素、木质素、果胶和蛋白质在高温下均会产生芳烃类 化合物。其中果胶是一种胶体性物质，沉积在初生细胞壁和胞间层，并与纤维素、半纤维素、 木质素以及一些蛋白质相互交联。果胶在热解过程中主要生成甲醇等有害物质。果胶的去 除不仅能够减少这类物质的生成，而且还能够改变烟草细胞结构，让细胞变的更松散透气， 有利于提高烟草燃烧能力，减少热解的发生。
[0007] 现有技术中，针对烟草薄片中果胶类物质的降解主要是采用传统的果胶酶进行 的。但是由于烟草薄片中果胶结构的复杂性和多样性，而现有技术中的果胶酶普遍存在对 于烟草薄片中果胶降解针对性不强、降解不够充分、降解过程难以控制的缺陷，因而急需探 讨新的果胶酶及其在烟草薄片加工中的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于提供一种采用特定菌株混菌发酵生产的果胶酶，同时该果胶酶可 以用于烟草薄片加工过程中用于降解烟草薄片中的果胶，从而改善烟草品质。
[0009] 本发明的技术方案具体如下。
[0010] 青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，采用如下步骤获得： (1) 菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养； 所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心（CICC)保藏的保藏号为CICC 40923的微紫青霉腫腫)，简称青霉，和中国工业微生物菌种保藏中 心（CICC)保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母afloffia/a)，简称毕赤酵母； 所述青霉的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养4d; 所述毕赤酵母的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养3d; (2) 制备种子液，将步骤（1)中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子液； 制备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeS04 0.lg/ L，MgS04 0.5g/L，KH2P04lg/L，pH自然，装液量 100/ 250mL锥形瓶，30°C、160r/min摇床培 养 48h; 制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，即20g/L葡萄糖， 10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，pH自然，30°C、160r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即 可作为种子液接种使用； (3) 发酵培养，将步骤（2)中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将青霉 种子液接种到发酵培养基中，30°C、160r/min摇床培养24~72h，优选培养48h;然后接种进 入毕赤酵母种子液，30°C、160r/min摇床培养48h; 所述发酵培养基配方为：橘皮粉30~50g/L、蛋白胨3~5g/L，KH2P04 0. 5~1. 5g/L，pH5;优选配方为橘皮粉40g/L、蛋白胨5.Og/L，KH2P04lg/L，pH5; 青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算； 毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算； (4) 粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为 本发明所提供的果胶酶成品。
[0011] 所述青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶用于烟草薄片加工过程中，将所得粗酶 液，按料液比，烟草薄片：果胶酶=1 :1~1〇比例，40~50°c，酶解2~6h处理，优选处理条件为， 烟草薄片：果胶酶=1 :5比例，45°C，酶解6h处理。
[0012] 本发明的总体技术路线是：将特定菌种首先混合发酵，筛选优化最佳发酵条件， 获得最高果胶酶酶活的粗酶液，然后将粗酶液直接用于处理烟草薄片处理降低其果胶酶含 量，通过优化处理工艺，获得最佳降解效果，从而改善烟草品质。
[0013] 在一系列工作基础上，本发明采用特定菌种混合发酵所得粗酶液的酶活最高可达 3880U/mL，具有较好的应用潜力。进一步用于烟草薄片处理后，可将烟草薄片中果胶酶含量 由2. 07%降低到1. 48%，降解率达到28. 49%，将处理后烟草薄片用于卷烟后，进一步的感官 抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟的香气质更 好，香气量充足，刺激性减轻且余味纯净舒适，卷烟的吸食品质得到了较好的改善和提升。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0015] 实施例1 本实施例主要对于青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶过程及相关培养基的优化过程 简要介绍如下。
[0016] 青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，采用如下步骤获得： (1)菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养； 所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心（CICC)保藏的保藏号为CI