CC 40923的微紫青霉腫腫)，简称青霉，和中国工业微生物菌种保藏中 心（CICC)保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母afloffia/a)，简称毕赤酵母； 这两种菌种均从相应的保藏单位购买获得； 所述青霉的活化培养基为PDA培养基(马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自 然，121°C灭菌)，，菌种活化时采用划线法接种，培养4d; 所述毕赤酵母的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养3d。
[0017] (2)制备种子液，将步骤（1)中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子 液； 制备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeS04 0.lg/L，MgS04 0.5g/L，KH2P04lg/L，pH自然，装液量 100/ 250mL锥形瓶，30°C、160r/min摇床培 养 48h; 具体步骤为：用打孔器在活化培养基平板上靠近菌株生长边缘的位置取两块〇. 5cm2 的、长满新生菌丝的接种块，接种于青霉种子培养基中；摇床发酵培养结束后，加入灭菌的 磁珠和适量的玻璃珠，使用磁力搅拌器搅拌2h，以使将培养物打碎，便于作为种子液接种用 于进一步发酵培养扩增使用； 制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，即20g/L葡萄糖， 10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，pH自然，30°C、160r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即 可作为种子液接种使用；具体操作参考青霉种子液制备过程，亦可按照常规接种操作即可， 即用接种环从活化培养基平板上刮一环新鲜毕赤酵母接种于毕赤酵母液体种子培养基中 即可。
[0018] (3)发酵培养，将步骤（2)中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将 青霉种子液接种到发酵培养基中，30°C、160r/min摇床培养24~72h，优选培养48h;然后接 种进入毕赤酵母种子液，30°C、160r/min摇床培养48h; 所述发酵培养基配方为：橘皮粉30~50g/L、蛋白胨3~5g/L，KH2P04 0. 5~1. 5g/L，pH5 ; 优选配方为橘皮粉40g/L、蛋白胨5.Og/L，KH2P04lg/L，pH5 ; 青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算； 毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算； (4)粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为 本发明所提供的果胶酶成品。
[0019] 发酵培养条件优化介绍 由于菌种混合发酵过程中培养基的配方及不同菌种接入时间对于发酵效果均有较大 影响，以菌种接入时间为例，如果在发酵的初始阶段即接入毕赤酵母，此时青霉菌体浓度尚 较低，加上营养物质的竞争消耗，青霉在与毕赤酵母的竞争中不占优势，从而使得青霉的生 长受到抑制，不利于果胶酶的产生，因而对于菌种的接入时间需要详细优化。下面对于发酵 培养过程中部分优化因子的获得过程简要介绍如下。
[0020] 首先根据初步的单因素试验结果确定影响青霉素果胶酶产量的主要因素有碳源、 氮源、无机盐、接入毕赤酵母时间4个影响因素，然后对这4个影响因素设计3水平进行正 交实验，以果胶酶活力为指标，具体的影响因素及相应水平设计表如下所示。
【主权项】
1. 青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，其特征在于，该果胶酶采用如下步骤获得： (1) 菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养； 所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC40923的 微紫青霉，和中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母； (2) 制备种子液，将步骤（1)中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子液； (3) 发酵培养，将步骤（2)中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将青霉 种子液接种到发酵培养基中，30°C、160r/min摇床培养24~72h;然后接种进入毕赤酵母种 子液，30°C、160r/min摇床培养48h; (4) 粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为 本发明所提供的果胶酶成品。
2. 如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，步骤（1)中所 述活化培养基为PDA培养基，青霉菌种活化时采用划线法接种，培养4d;毕赤酵母菌种活化 时采用划线法接种，培养3d。
3. 如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，步骤（2)中制 备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeS04 0.lg/L，MgS04 0? 5g/L，KH2P04lg/L，pH自然，装液量 100/ 250mL锥形瓶，30°C、160r/min摇床培养 48h; 制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，30°C、160r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即可作为种子液接种使用。
4. 如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，所述发酵培 养基配方为：橘皮粉 30~50g/L、蛋白胨 3~5g/L，KH2P04 0. 5~1. 5g/L，pH5。
5. 如权利要求4所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，所述发酵培 养基配方为：橘皮粉40g/L、蛋白胨5.Og/L，KH2P04lg/L，pH5 ; 青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算； 毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算。
6. 权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用， 其特征在于，将所得粗酶液，按料液比，即烟草薄片：果胶酶=1 :1~1〇的比例，40~50°C，酶解 2~6h〇
7. 如权利要求6所述果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，粗酶液按料 液比，即烟草薄片：果胶酶=1 :5的比例，45°C，酶解6h处理。
【专利摘要】本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。该果胶酶经过菌种活化、制备种子液、发酵培养、粗提酶液等步骤获得。将该粗酶液按烟草薄片：果胶酶=1：1~10的比例，40~50℃，酶解2~6h用于处理烟草薄片。本发明的总体技术路线是：将特定菌种首先混合发酵，筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，将粗酶液用于处理烟草薄片降低其果胶酶含量，获得最佳降解效果。本发明所得粗酶液的酶活最高可达3880U/mL，用于烟草薄片处理后，可将烟草薄片中果胶酶含量由2.07%降低到1.48%，能较好的改善烟草的吸食品质。
【IPC分类】C12N9-88, A24B15-20, C12N9-18, C12R1-84, C12R1-80, C12N9-26
【公开号】CN104711246
【申请号】CN201510159928
【发明人】郝辉, 马宇平, 许春平, 孙斯文, 聂聪, 王文领
【申请人】河南中烟工业有限责任公司, 郑州轻工业学院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月7日