重组的弹性蛋白酶蛋白质及其制备方法和用图
【专利说明】
[0001] 本申请是2008年12月4日提交的200880124812.X号发明专利申请"重组的弹性 蛋白酶蛋白质及其制备方法和用途"的分案申请。
[0002] 本发明要求2007年12月4日提交的美国临时申请No. 60/992, 319的优先权，其 内容通过引用整体并入本文。 1.
技术领域
[0003] 本发明涉及制备和配制用于治疗和预防生物管道疾病的弹性蛋白酶蛋白质的重 组方法。本发明还涉及新的重组的弹性蛋白酶蛋白质和含所述蛋白质的药物组合物。本发 明还涉及含重组弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物用于治疗和预防生物管道疾病的用途。 2.
【背景技术】
[0004] 弹性蛋白是能够伸展后自发重卷的蛋白质。交联的弹性蛋白是弹性纤维的主要结 构成分，所述弹性纤维赋予组织弹性。可将拥有溶解成熟的、交联的弹性蛋白的能力的蛋白 酶的成为弹性蛋白酶（Bieth，JG"Elastases:catalyticandbiologicalproperties,"at pp.217-320(MechamEdition,RegulationofMatrixAccumulation,NewYork,Academic Press, 1986)。多个出版的专利申请（TO2001/21574 ;TO2004/073504 ;和TO2006/036804) 表明单独的弹性蛋白酶，或弹性蛋白酶与其他试剂的组合有利于治疗生物管道疾病，所述 生物管道包括经受或易于经受阻塞和血管痉挛的生物管道。对于人受试者的弹性蛋白酶治 疗，期望使用人弹性蛋白酶来降低针对非人弹性蛋白酶免疫应答的风险。
[0005] 然而至今无已知的商用有效的制备生物学有效的对于临床应用而言足够纯净形 式且充足量的弹性蛋白酶的手段。因为弹性蛋白酶是有力的可水解多种除弹性蛋白酶之外 的蛋白质的酶，弹性蛋白酶的蛋白水解活性对于其制备具有潜在的障碍。例如，成熟的弹 性蛋白酶活性可破坏表达其的宿主细胞，降解其本身或降解用于辅助制备或表征弹性蛋白 酶的试剂。
[0006] 弹性蛋白长表达为含信号肽、活化肽和成熟的、活性部分的前原蛋白。分泌后切割 信号序列产生几乎无或无酶活性的原蛋白，且其氨基酸序列含活化肽和成熟蛋白的氨基酸 序列。一般而言，对于重组表达，可表达无活性的前体代替成熟的活性酶，以免破坏表达其 的细胞。例如，美国专利No. 5, 212, 068描述了人胰腺弹性蛋白酶cDNA(称之为弹性蛋白酶 "1从"、"118"、"11从"和"1118"）的克隆。各种弹性蛋白酶在哺乳动物0)5-1细胞中表达 为包括天然信号序列的全长cDNA。此外，含枯草杆菌（B.subtilis)信号序列和半乳糖 甘酶信号序列的经加工形式的弹性蛋白酶也分别在枯草杆菌和大肠杆菌中表达。美国专利 No. 5, 212, 068还提示了酿酒酵母（S.cerevisiae)中表达的弹性蛋白酶。一般而言，美国专 利No. 5, 212, 068中的弹性蛋白酶表达的实施例显示回收的弹性蛋白酶的低活性，或需要 涉及用胰蛋白酶处理的活化步骤，以产生有活性的弹性蛋白酶。此外，当在大肠杆菌中表达 时，弹性蛋白酶大量存在于包含体中，且只要小部分表达的弹性蛋白酶是可溶和有活性的。 美国专利No. 5, 212, 068中描述的弹性蛋白酶制剂均未被纯化到药品级。
[0007] 由此，现有技术需要重组制备方法，所述方法能够产生治疗量的生物学上有活性 的的药品级弹性蛋白酶，且优选避免大规模制备中成本高且导致终产物的胰蛋白酶污染的 胰蛋白酶活化步骤。给患者施用含胰蛋白酶的弹性蛋白酶可导致蛋白酶活化的受体1和2 的活化，其可降低弹性蛋白酶治疗的一些有利效果。
[0008] 本申请第2部分或任何其他部分中的任何参考文献的引用或指出不能理解为承 认所述参考文献可作为相对本发明的现有技术。
[0009]3.发明概沭
[0010] 本发明提供制备重组弹性蛋白酶蛋白质的新的有效方法，及重组蛋白在治疗和预 防生物管道疾病的组合物（如药物组合物、弹性蛋白酶制剂或单元剂）中的用途。
[0011] 本发明针对自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质、编码自体活化的原弹性蛋白酶蛋 白质的核酸、含所述核酸的宿主细胞、制备自体活化的原弹性蛋白酶蛋白质的方法及自体 活化的原弹性蛋白酶蛋白质用于制备成熟的生物学上有活性的弹性蛋白酶蛋白质（例 如在药物制剂中使用的）的用途。本文中的术语"自体活化的（auto-activated)"（或 "autoactivated"）可与术语"自体活化的（auto-activating) "、"自体活化的 (self-activating) "和"自体活化的（self-activated) "互换使用，且不旨在暗示已发生 活化步骤。本文中的术语"活化"可与术语"转变"互换使用，且不旨在暗示由"活化"得到 的蛋白必需拥有酶活性。
[0012] 下文中除非另有规定，术语"弹性蛋白酶"一般指具有弹性蛋白酶活性的成熟的弹 性蛋白酶蛋白质及不成熟的弹性蛋白酶蛋白质（包括不成熟的原弹性蛋白酶蛋白质（在本 文中也称为弹性蛋白酶原蛋白）和不成熟的前原弹性蛋白酶蛋白质（在本文中也称为弹性 蛋白酶前原蛋白））。
[0013] 本发明优选的弹性蛋白酶是I型胰腺弹性蛋白酶，如人I型胰腺弹性蛋白酶和猪I 型胰腺弹性蛋白酶。I型胰腺弹性蛋白酶有时也被称为"弹性蛋白酶-1"、"弹性蛋白酶I"、 "1 型弹性蛋白酶（elastasetypel)"、"l型弹性蛋白酶（type1elastase)"或"ELA-1"。 人I型胰腺弹性蛋白酶在本文中也被称为hELA-1或人ELA-1 ;猪I型胰腺弹性蛋白酶在本 文中也被称为pELA-1或猪ELA-1。
[0014] 本发明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质一般具有天然弹性蛋白酶基因编码的氨基酸 序列或该序列的变体。本文描述了优选的序列变体（包括含氨基酸取代的变体）。原弹性 蛋白酶蛋白质是成熟的弹性蛋白酶蛋白质的大多无活性的前体，且前原弹性蛋白酶还含蛋 白质分泌的信号序列。本发明的弹性蛋白酶蛋白质的前序列和原序列一般非源于编码本发 明的成熟的弹性蛋白酶蛋白质的弹性蛋白酶基因。因此，某种意义上，本发明的成熟的弹性 蛋白酶蛋白质是具有其由天然弹性蛋白酶基因编码的成熟部分和其由非弹性蛋白酶基因 序列编码的不成熟部分的"嵌合"蛋白。
[0015] 为易于引用，本发明的弹性蛋白酶蛋白质及其核心序列成分示于图2。如图2所 示，原弹性蛋白酶序列中切割键（即被切割而产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质的键）N-端侧 的氨基酸残基在本文中被标为PX、"十5、P4、P3、P2和P1，其中P1是从切割键数起N-端 侧的第一个氨基酸残基，而位于成熟的弹性蛋白酶切割键C-端侧（且向N-端侧）的氨基 酸残基被标为？1'、？2'、？3'、~？乂'，其中？1'是从切割键数起(：-端侧的第一个氨基酸残 基，且代表成熟的蛋白质的N-端氨基酸残基。图2还显示下列成分：
[0016] (1)信号序列：增加由细胞分泌的表达出的分子的比例的序列。例示序列是SEQ IDNO:50或51的氨基酸1~22。
[0017] (2)原肽+间隔子：任选地，优选为非弹性蛋白酶，还任选包括一个或多个间隔子 序列（酵母a因子原肽序列与Kex2和STE13间隔子序列示于图1B)的原肽序列（如酵母a因子前原肽）。在特定实施方式中，原肽序列不包括间隔子。
[0018] (3)弹性蛋白酶原肽：存在于弹性蛋白酶N-端时使分子无活性或相比相应的成熟 的弹性蛋白酶蛋白质少活性的肽。弹性蛋白酶原肽可与活化肽连续，或可相对活化肽含附 加的氨基酸。例示弹性蛋白酶原肽序列是SEQIDN0 :64和69的氨基酸1~10。
[0019] (4)活化肽：可与"活化序列"互换使用，活化肽是弹性蛋白酶原肽的成分，且可与 弹性蛋白酶原肽连续。如图2所示，活化肽含氨基酸残基P10~P1。例示活化肽共有序列 是SEQIDN0 :80,其他活化肽序列例是SEQIDN0 :23、72和73。
[0020] (5)识别序列：识别序列是弹性蛋白酶原肽的成分。如图2所示，识别序列含氨基 酸残基P3~P1。例示识别序列共有序列是SEQIDN0 :11~13和93,且例示识别序列是 SEQIDNO：20〇
[0021] (6)切割结构域：原弹性蛋白酶蛋白质中跨切割键的区域。如图2所示，切割结构 域含氨基酸残基P5~P3'。例示切割结构域序列是SEQID勵：42、43、48、49、53、53、54和 55〇
[0022] (7)切割位点：原弹性蛋白酶蛋白质中跨切割键的另一区域。如图2所示，切割位 点含氨基酸残基P4~P4'。例示切割位点序列是SEQIDN0 :27。
[0023] (8)前原弹性蛋白酶蛋白质：可含全部组成部分的蛋白质。例示前原弹性蛋白酶 蛋白质可含SEQIDN0 :50、51、96或97的肽，随后是可操作连接的SEQIDN0 :64或69的 蛋白质。
[0024] (9)原弹性蛋白酶蛋白质：含成熟的弹性蛋白酶蛋白质、弹性蛋白酶原肽和任选 的原肤和间隔子序列的蛋白质。例不原弹性蛋白酶序列是SEQIDN0 :64和69。
[0025] (10)成熟的弹性蛋白酶蛋白质：适当加工时表现出弹性蛋白酶活性的蛋白质。例 示成熟的序列是SEQIDN0 :1 (人）和SEQIDN0 :39 (猪）。
[0026] 弹性蛋白酶蛋白质成分可被认为是弹性蛋白酶蛋白质、原弹性蛋白酶蛋白质和前 原弹性蛋白酶蛋白质的模块构建。例如，本发明提供含弹性蛋白酶原肽和成熟的弹性蛋白 酶蛋白质的序列的原弹性蛋白酶蛋白质。弹性蛋白酶原肽可含活化肽。弹性蛋白酶原肽还 可含弹性蛋白酶识别序列。本发明还提