专利名称：蛋白质水解产物稳定金属蛋白酶洗涤剂制剂的用途的制作方法
技术领域：
与在液体中储存期间(例如，使用前)维持酶稳定性相关的问题是公 知的。 一般而言，蛋白酶造成更大的稳定性问题，因为它们的催化活性降 解制剂中的其它蛋白质，以及在自溶(即，自降解)过程中降解该蛋白酶自 身。然而，由于丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)的稳定相对容易以 及为增加稳定性的工程化突变的开发，这一类蛋白已在洗涤剂制剂中广泛 应用。实际上，由于它们在洗涤剂中的应用，枯草杆菌蛋白酶是商业上最 重要的蛋白酶之一。中性金属蛋白酶仍然面临自溶降解的普遍性的蛋白酶问题，所述
用金属蛋白酶(或任意酶)的相对高成本需要最小化使用前的活性损失，以 使得它们作为洗涤剂组分具有商业利益。显然，任何用于最小化金属蛋白 酶自溶降解的组合物和/或方法必须不再通过在使用期间抑制期望的酶活 性(即，降解污斑蛋白成分)而增加太高的成本。因此，必须取得一个脆弱 的平衡，以使得最小化洗涤剂储存期间的自溶活性，而不降低使用时的期 望酶活性。因此，需要这样的方法、化合物、制剂和組合物，其能稳定中 性蛋白酶不被降解，尤其是当将它们掺入洗涤剂制剂和其它洗涤组合物中 时更时如此。
发明概述
09]本发明提供了組合物和洗涤剂制剂，其包含金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂，并且其由此展示出针对降解的增加的稳定性。本发明还提供本文所使用的术语"蛋白质水解产物"是指通过水解任何类型或种类的蛋白质所产生的水解产物。可以水解任意已知的蛋白质以产生在本申请中如何使用该术语的意思范围内的蛋白质水解产物。可通过酶以及非酶方法产生"蛋白质水解产物"，并且其可包括大小在2至100或更多个氨基酸范围内的蛋白质片段(即，多肽)。此外，本文所使用的"蛋白质水解产物"不限于单个产物化合物，而是可包括水解产物(例如，多种蛋白质片段)的异质分布或混合物。其还可包括水解产物的同质化合物或纯化的级分。蛋白质水解产物的优选实施方案包括HyPep 460仃气来自小麦谷蛋白的蛋白质水解产物)、Amisoy (大豆蛋白酸水解产物)、Amicase (来自牛奶的酪蛋白酸水解产物)、标蛋白胨(来自植物蛋白的酶水解产物)。本文中所使用的"织物，，包括任何纺织品材料。因此，该术语意在包括衣物、以及织物、纱、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织品材料。金属蛋白酶是在细菌、真菌及高等生物中发现的不同类型的蛋白酶。在金属蛋白酶活性部位结合的金属离子允许水分子的催化活性。然后水分子作为亲核试剂起作用以切割肽键的羧基。在该类中存在大量不同的
序列和结构，但是大多数金属蛋白酶包括结合在活性部位的锌离子。在一些金属蛋白酶中，锌离子可被另一金属离子，诸如钴或镍取代而不丧失活性。如当前所理解的那样，金属蛋白酶的催化机制包括通过攻击被该酶切割的键的羧基上的锌结合水分子而形成的非共价四面体中间产物。就功能和稳定性而言，最佳表征的中性金属蛋白酶可能是嗜热菌 蛋白酶和TLP。许多研究集中于工程化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)嗜 热菌蛋白酶，以增加它们的热稳定性(例如，参见Vriend等，In， Tweel等(编 辑)，Stability and Stabilization of Enzymes, Elsevier, pp. 93-99 [1993)。已
进行了许多的努力以通过改变可阻止局部解折叠过程的结构决定因素(通 过分子建模确定)来增加TLP的稳定性，所述的局部解折叠过程增强了在 高温下的自溶和变性。(例如，参见van den Burg等，在Hopsu-Havu等，(编 辑)，Proteolysis in Cell Functions Manipulating the Autolvtic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical and Health Research,巻13, IOS Press [1997p. 576.)。已报道钓离子能够帮助阻止中性金属蛋白酶自溶。已通过 添加4丐稳定了嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)中性蛋白酶对抗 自溶和蛋白酶水解降解(参见D13rrschmidt等，FEBS J.， 272:1523-1534 [2005)。在一个实施方案中，本发明预期应用位点定向诱变以工程化中性
金属蛋白酶活性部位，其中特定蛋白质水解产物将在该位点展示出抑制剂 结合特性，其对改善在洗涤剂制剂中的稳定性更有利。用于产生突变体的 中性金属蛋白酶"位点评价文库"(SEL)公开于2006年10月12日提交的美 国专利申请11/581,102号，其在此通过引物并入本文作为参考。按照本发明，可以应用这些SEL以产生中性金属蛋白酶的活性位点突变体文库，然 后可针对改良的蛋白质水解产物(或其它抑制剂)结合特征筛选该文库，其 改善了应用这些抑制剂以在洗涤剂制剂和清洁组合物中针对自溶降解进 行稳定的能力。
作为抑制剂和稳定剂的蛋白质水解产物因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含中性金属蛋白酶 和抑制剂的抑制剂稳定的中性金属蛋白酶制剂，其中所述的抑制剂是由所 述酶产生的蛋白质水解产物，并且制剂中的抑制剂浓度是该蛋白质水解产 物与该中性金属蛋白酶的表观Ki的至少约5倍。在一个实施方案中，表观 Kj是约5 mM至约15 mM，并且在制剂中使用的蛋白质水解产物浓度是至 少约25mM，约35mM，约50mM或更高。2006年10月12日提交的美国专利申请11/581，102(在此引入作 为参考)公开了将来自解淀粉芽孢杆的中性金属蛋白酶NprE重组克隆至质 粒载体，并引入到枯草芽孢杆菌宿主中表达和发酵的技术。在本发明的一 个实施方案中，使这一 NprE表达系统适于共表达NprE酶的蛋白质底物。 在一个优选的实施方案中，共表达蛋白质底物是酪蛋白。
洗涤剂制剂和清洁组合物除了本文公开的之外，2006年10月12日提交的美国专利申请 11/581,102号(引物本文作为参考)公开了适于与本发明的抑制剂稳定的金 属蛋白酶应用的大量洗涤剂制剂和清洁组合物。在另 一 实施方案中，这一 简单的洗涤剂制剂还可包含选自以下的各种附加物质(即，辅助材料)额外的表面活性剂、增效助剂、螯合剂、 染料转移抑制剂、沉淀助剂、分散剂、额外的酶、酶稳定剂、催化材料、 漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚 合分散剂、粘土除去/抗再沉积剂、光亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构 伸缩剂、织物柔软剂、载剂、水溶增溶剂、加工助剂和/或颜料。在一个实施方案中，本发明的HDL洗涤剂制剂包含约20%至约50%重量的表面活性剂。在一些实施方案中，该HDL制剂包含选自以下的表面活性剂的混合物C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、 HetoxolLA7、HetoxolLA4)、烷基^^酸钠(例如，Nacconol 90G)、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(例如，SteolCS-370)、和它们的任意组合物。在一些实施方案中，该HDL制剂包含选自烷基苯磺酸盐、烷基醚石克酸盐和烷基聚氧乙烯醚的一种或多种表面活性剂。
0126在一个实施方案中，本发明的HDL洗涤剂制剂包含约35%至约52%重量的水，以及约24%至约40%重量的表面活性剂，其中所述的表面活性剂包含Nacconol 90G、 Alfonic 1012-6和Steol CS-370。在另一实施方案中，HDL制剂(假设总共卯份)中水和表面活性剂的具体体积比为约30份水、17份Nacconol卯G、 13份Alfonic 1012-6和10份SteolCS-370。本领域冲支术人员将能立即认识到可应用类似量的等同表面活性剂制备本发明中有用的备选的HDL制剂。、 LUXSIL⑧和SPHERICEU [Potters Industries, Inc., Carlstadt， NJ and Valley Forge, PA)。
清洁添加物制剂在一些低pH清洁组合物实施方案(例如，具有约3至约5净pH 的组合物)中，该组合物一般不含有烷基乙氧基化物硫酸盐，因为据信在此 类酸性条件下，这一类表面活性剂可被该组合物水解。在以下的实验公开中，应用了以下简写。C(摄氏度)；rpm或 RPM(每分钟转速)；Da(道尔顿)，kDa(千道尔顿)；g(克)；ng和ug(微克)； mg(毫克)；ng(纳克);nl和ul(微升);ml(毫升)；mm(毫米);nm(纳米)； Hm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；nM和uM(孩傳尔)；U(单位)； MW(分子量)；sec(秒);min(分钟)；hr(小时);OD280 (在280 nm的光密 度)；OD4()5 (在405 nm的光密度)；OD咖(在600 nm的光密度);PAGE(聚丙 烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸緩冲盐水[150 mM NaCl， 10 mM 磷酸钠緩冲液，pH 7.2)；SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris (三(羟甲基)氨基甲 烷)；TAED (N，N，N，N'-四乙酰乙二胺)；MES(2-吗啉代曱磺酸； 一水合物; f.w. 195.24; Sigma # M画3671)); CaCl2 (氯化钾，无水；f.w. 110.99; Sigma #C画4卯l); DMF (N，N-二曱基甲酰胺，f.w. 73.09， d = 0.95); w/v (重量比体积); v/v (体积比体积)；NprE (中性金属蛋白酶)；PMN (纯化的MULTIFECT 金属蛋白酶)。
在下述实施例中使用了以下测试法。A. 用于NprE浓度确定的应用96孔微量滴定板(MTP)的布来得福特 观'J试法(Bradford assay)。
酶储存溶液用酶稀释緩沖液将纯化的NprE酶稀释至约1 ppm (1 fig/mL)的浓度。将MULTIFECT⑧中性金属(野生型NprE)稀释至低于6 ppm(6jig/mL)的浓度。优选系列稀释。溶液在室温下稳定l小时，但对于 更长时间的储存，在冰上维持该溶液。[0177底物储存溶液-在DMF中48 mM Abz-AGLA-Nba:将约28 mg 的Abz-AGLA-Nba置于小管中。将其溶解于约1 mL DMF中(根据 Abz-AGLA-Nba质量，体积将不同)并且漩涡震荡若干分钟。将该溶液避 光储存于室温。将Abz-AGLA-Nba溶解于DMF中并且在其制备当天使用。[0178底物稀释緩沖液画50 mMMES、 2.5 mM CaCl2、 5% DMF、 pH 6.5:将5 mL纯DMF加入到95 mL储存MES緩沖液中。应用这一緩冲 液以确定动力学参数。[0179测试溶液-50 mM MES， 2.5 mM CaCl2, 5% DMF， 2.4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6.5:将1 mL底物储存溶液加入到19 mL底物稀释緩 沖液中并蜗旋震荡。避光室温保存溶液。测试法过程[0180制备所有的緩冲液、储存液和工作溶液。除非另外指出， 一式 三份地测试每一酶稀释液。当不完全满时，*的左边开始以满竖列排列 酶工作溶液储存孩i板(以适应板读数器)。类似地设置相应的测试板。如之 前描述的那样设置孩史板荧光分光计。[0181首先，将200 nL等分测试溶液置于96孔微量板的孔中。在控 制温度的微量板混合器中避光在25。C温育该板10分钟。通过将10nL工作 酶溶液从储存微板转移至混合器中的测试微量板中开始该测试。最佳地使 用96孔移液或使用8孔多通道移液管从最左边一列开始转移。使溶液剧烈 混合15秒(在Eppendorf Thermomixer中卯0 rpm)。马上将测试微量板转 移至^L量板荧光分光计上并开始在350 nm激发和415 nm的发射的荧光测 量的记录。荧光分光计软件对毫RFU/分钟的线性回归线计算每一孔荧光 增加的反应比率。在一些实施方案中，当读取第一块板时，将第二块板置 于微量板混合器中用于温度平衡。0182初始速率就直至0.3 mM产物的产物浓度(即，释i文的2-氨基苯 曱酰荧光)而言是线性的，其相应于约22,000 RFU的背景荧光下的以2.3 mM Abz-AGLA-Nba开始的溶液中的约50,000 RFU。实施例1在较高储存浓度下升高的NprE稳定性[0183这一实施例证实当在较高浓度下和/或10。/。丙二醇(PPG)和 CaCl2的存在下维持中性金属蛋白酶时，发生了该酶稳定性的升高。[0184以在pH8.0的10 mM HEPES(N-(2-羟乙基)哌唤-N'-(2-乙磺酸)) 緩冲液中625至10000ppm的浓度范围，制备含有中性金属蛋白酶NprE 的样本。除了 6MppmNprE浓度的一个对照之外，所有的样本包括10% PPG和0.5 mM CaCl2。在32。C的温度温育所有的样本超过6小时。在不 同的时间点应用AGLA活性测试法测量样本的NprE活性。结果[0185如
图1所示，具有625 ppm NprE且没有添加PPG和CaCl2的 对照样本在开始的2小时内几乎丧失了其全部活性。相反，其它样本的 NprE活性维持了多数与较高蛋白质浓度相关的活性。在10,000 jig/mL (或 ppm) NprE的浓度下，在丧失活性前，该酶几乎维持完全活性达1.5小时。 与之相比，625、 1250和2500 ppm的蛋白质样本显示出降低的活性(在1.5 hr时约60。/。)。与对照样本相比，高浓度样本显示出储存稳定性的显著升高。从Sigma Chemical (St. Louis, MO)获得以下蛋白质水解产物， 并且不经过进一步纯化即使用来自小麦谷蛋白的HyPep 4601^蛋白质水 解产物(目录号弁H6784》Amisoy，大豆蛋白酸水解产物(目录号# S l674); Amicase，牛奶酪蛋白酸水解产物(目录号# A 2427)，以及脉蛋白胨，来自 植物蛋白的酶水解产物(目录号# P 0431)。来自牛奶的酪蛋白(目录号# C7078; Sigma Chemical, St. Louis, MO)用于通过NprE水解。
蛋白质水解产物储存溶液—般而言，用10 fiL 50 mg/mL NprE储存溶液与20 fiL抑制剂 储存溶液预混合。然后，将220 fiL在10 mM HEPES中的10% DW-CT 洗涤剂制剂加入到每一样本中，使得终NprE浓度为2 mg/mL。在32。C在 Thermomixer (Eppendorf)中的微量滴定板中温育样本。在稳定性测试法温育期间的终点(t = 200 min),取10 pL每一样 本并用200 nL 1 N HC1淬灭。马上加入200 jiL 5% TCA。在冰上进行TCA 沉淀20分钟。通过离心收集沉淀并且进一步用水冷的卯％丙酮洗涤。然 后将该沉淀重悬于1.5x样本上样緩冲液中，并在95。C加热5分钟。然后将 样本上样至4-12% SDS-PAGE凝胶。应用本领域公知的SDS-PAGE标准 方案进行电泳以及用考马斯蓝染料进行的凝胶可视化。
结果本发明已在本文中进行了广泛和一般性地描述。落在该上位描 述中的每一个较窄的下位和次上位概念也形成本发明的一部分。这包括带 有从中去除任何主题的条件或负面限制的本发明的上位描述，无论该去除 的主题是否在本文中曾有过具体述及。
权利要求
1.液体洗涤剂制剂，其包含(a)约1％至约75％重量的表面活性剂；(b)约10％至约95％重量的水；(c)约0.01％至约5％重量的中性金属蛋白酶；以及(d)一定量的中性金属蛋白酶抑制剂，使得在使用前该抑制剂与至少约90％的中性金属蛋白酶分子结合，并且其中该洗涤剂制剂的合适稀释导致该抑制剂从至少约25％的结合的中性金属蛋白酶分子解离。
2. 权利要求l的制剂，其中所述洗涤剂制剂的合适稀释导致所述抑制剂从至少约45%的结合的中性金属蛋白酶分子解离。
3. 权利要求1的制剂，其中抑制剂的量为约0.01%至约15%重量之间。
4. 权利要求1的制剂，其中所述的抑制剂在约pH 7.5至约pH 9.5之间以约5 mM至约15 mM的表观Kj竟争性地抑制所述中性金属蛋白酶。
5. 权利要求l的制剂，其中所述的中性金属蛋白酶分离自芽孢杆菌属(5"C/〃M51 5/7. )o
6. 权利要求5的制剂，其中所述的中性金属蛋白酶是NprE。
7. 权利要求l的制剂，其中所述的抑制剂是蛋白质水解产物。
8. 权利要求7的制剂，其中所述的蛋白质水解产物选自小麦谷蛋白水解产物、大豆蛋白酸水解产物、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物、来自植物蛋白的酶水解产物、和它们的任意组合。
9. 权利要求l的制剂，其中所述的抑制剂包含通过用至少一种中性金属蛋白酶消化蛋白质产生的水解产物。
10. 权利要求9的制剂，其中所述的水解产物包含少于约5000 Da的蛋白质片段。
11，权利要求9的制剂，其中所述的蛋白质是酪蛋白。
12. 权利要求1的制剂，其中所述的洗涤剂制剂包含重垢洗涤液体(HDL)制剂。
13. 权利要求1的制剂，其中所述液体洗涤剂制剂还包含约5%至约10%的聚丙二醇。
14. 权利要求1的制剂，其中所述的液体洗涤剂制剂还包含约0.5 mM至约5mM4丐离子。
15. 权利要求1的制剂，其中所述的液体洗涤剂制剂不包含硼。
16. 抑制剂稳定的中性金属蛋白酶组合物，其包含(a)约0.00iy。至约10%重量的中性金属蛋白酶；以及(b)竟争性抑制剂，其中该竟争性抑制剂与至少约卯％的所述中性金属蛋白酶分子结合。
17. 权利要求16的组合物，其中所述的竟争性抑制剂是蛋白质水解产物。
18. 权利要求17的组合物，其中所述的蛋白质水解产物选自小麦谷蛋白水解产物、大豆蛋白酸水解产物、来自牛奶的酪蛋白酸水解产物、来自植物蛋白的酶水解产物、和它们的任意组合。
19. 权利要求17的组合物，其中所述的蛋白质水解产物是通过用至少一种中性金属蛋白酶消化蛋白质产生的水解产物。
20. 权利要求19的组合物，其中所述的水解产物包含少于约5000 Da的蛋白质片段。
21. 权利要求19的组合物，其中所述的蛋白质是酪蛋白。
22. 权利要求16的组合物，其中所述的组合物在包封的颗粒中。
23. 权利要求16的组合物，其中所述的抑制剂在约pH 7.5至约pH 9.5之间以约5 mM至约15 mM的表观Kj竟争性地抑制所述中性金属蛋白酶。
24. 权利要求16的组合物，其中所述的中性金属蛋白酶分离自芽孢杆菌属。
25. 权利要求16的组合物，其中所述的中性金属蛋白酶是NprE。
26. 用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括(a)在约pH 6.5至约pH 11的含水緩沖液中、在约22。C至约37。C的温度温育包含至少 一种中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过所述中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物；(b)分离分子量少于约5000 Da的水解产物；和(c)将步骤(b)的水解产物与包含约0.001。/。至约10%重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并。
27. 权利要求26的方法，其中所述的温育混合物包含约0.001%至约10%重量的中性金属蛋白酶和约5%至约20%重量的蛋白质底物。
28. 权利要求26的方法，其中所述中性金属蛋白酶是NprE且蛋白质底物是酪蛋白o
29. 权利要求26的方法，其中所述洗涤剂制剂包含HDL洗涤剂制剂。
30. 用于制备抑制剂稳定的液体洗涤剂制剂的方法，其包括将蛋白质水解产物与包含约0.001%至约10%重量的中性金属蛋白酶的液体洗涤剂制剂合并，其中如下制备所述的蛋白质水解产物在约pH6.5至约pH11的含水緩冲液中、在约22。C至约37。C的温度温育包含至少一种中性金属蛋白酶和蛋白质底物的混合物，由此通过所述至少 一种中性金属蛋白酶消化该底物蛋白质产生水解产物，并且其中在与所述中性金属蛋白酶合并前分离分子量少于约5000 Da的水解产物。
全文摘要
本发明提供了包含金属蛋白酶和蛋白质水解产物抑制剂的组合物和制剂，其展示出升高的储存稳定性。在一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种金属蛋白酶(例如，芽孢杆菌属中性金属蛋白酶)的液体洗涤剂制剂，其中所述至少一种金属蛋白酶通过在该洗涤剂制剂中包含的蛋白质水解产物来稳定。本发明也提供了通过用金属蛋白酶消化蛋白质底物来制备用于稳定洗涤剂制剂的蛋白质水解产物的方法。
文档编号C12P21/06GK101675160SQ200880014264
公开日2010年3月17日 申请日期2008年4月23日 优先权日2007年4月30日
发明者D·S·温特茨基, S-K·李 申请人:丹尼斯科美国公司