蛋白酶3抗体(PR3-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明属于临床免疫学检测【技术领域】，公开了一种蛋白酶3抗体(PR3-Ab)定量测定试剂盒，包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法。本发明还公开了上述试剂盒的检测方法。本发明制备的试剂盒精确度、灵敏度以及稳定性较好，并且成本低廉，操作简单，具备广阔的应用前景。
【专利说明】蛋白酶3抗体（PR3-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床免疫学检测【技术领域】，具体涉及一种蛋白酶3抗体（PR3-Ab)定量 测定试剂盒及其检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 蛋白酶3 (PR3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约 为29KDa的糖蛋白。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等多种组 织成分。此外，蛋白酶3通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制剂失活。PR3抗体 是韦格拉肉芽肿病（WG)的特异性抗体。尽管其发病机制不清，但是抗PR3抗体与韦格拉肉 芽肿病发病机制具有一定的相关性。另外，PR3抗体浓度与其他疾病活性密切相关，可见于 原发性系统性脉管炎、慢性炎性肠炎、感染(如HIV)和其他疾病。韦格纳肉芽肿患者经治疗 病情稳定后，该抗体浓度可下降，常被作为判断疗效、估计复发的指标，从而指导临床治疗。 PR3抗体对呼吸道有亲和性，致上下呼吸道坏死，肉芽肿形成。此外，蛋白酶3抗体(抗-PR3) 在血管炎的发病中也起着重要作用，蛋白酶3抗体(抗-PR3)的检测结果在原发性小血管炎 患者中检测中具备较高的临床价值。
[0004] 临床检测蛋白酶3抗体（PR3_Ab)的常见方法包括放射免疫分析法以及间接免疫 荧光法等。但这些方法都存在着不足之处。放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记 的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应，是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测 抗原的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异，但其却需要具备尖端复杂的设备，且 成本也不低。同时，还需要特殊的预防措施，因为其要用到放射性物质。因此，如今放射免疫 分析法在很大程度上已经被ELISA所取代。间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体 与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物，继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合，形 成抗原抗体荧光复合物。该方法在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别； 操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，只能进行定性检测，不能进行定量测定。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种具备较佳的准确度、精密度和稳定 性的试剂盒。本发明是通过如下技术方案来实现的： 一种蛋白酶3抗体（PR3-Ab)定量测定试剂盒，包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、 清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂； 所述磁分离试剂的制备步骤如下： 一、配制磁微粒缓冲液，以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌 至完全溶解； 2) 、称取BSA 5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300 0.2 mL至容器中，充分搅拌至完 全溶解； 3) 、用4M的HC1调pH，控制在pH在7. 9-8. 1之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L,用0. 2um滤器过滤,2-8°C保存待用； 二、制备磁分离试剂： 1) 、取100mg含羧基（COOH)活性基团的磁微粒，用0· 025mol/L，ρΗ4· 5-5 MES缓冲液 10mL混悬； 2) 、加入0. 5-lmL浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min ; 3) 、磁分离，去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5 MES缓冲液10mL重悬； 4) 、加入 0· 02-0. lmg 的 PR3 抗原，室温混悬 120-240min ; 5 )、磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL，完成磁分离试剂的制备。
[0006] 所述酶标记试剂的制备步骤如下： 一、 配制酶标记试剂稀释液，以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Η印es 6. 06g、NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌 至完全溶解； 2) 、称取 BSA 5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL 和 MgCl20.1g 于容器中中，充分搅拌 至完全溶解； 3) 、用4M的HC1调pH，控制pH在7. 5-8. 0之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、 碱性磷酸酶（ALP)与PR3抗体的偶联 1 )、取lmg PR3抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液2-4 μ L，室温静置20min，加入 0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 μ L，室温静置5min ;用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的PR3抗 体，2-8 °C保存备用； 2) 、取1. 5mg的碱性磷酸酶（ALP)，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 μ L，室温静置30min， 用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的ALP，2-8°C保存备用； 3) 、将上述活化的PR3抗体与活化的ALP混合，2-8 °C条件下静置12-24h，用 Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得PR3抗体-ALP连接物浓溶液，2-8°C保存备用。
[0007] 4)、将PR3抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1 μ g/mL，完 成酶标记试剂的制备。
[0008] 所述校准品的制备步骤如下： 一、校准品稀释液的配制： 1 )、量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均 匀； 2) 、称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02 mL加入容器中，充分 搅拌至完全溶解； 3) 、用4M的HC1调pH，控制pH在7. 0-7. 5之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0009] 二、校准品的配制：用校准品稀释液将PR3抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/ mL共6个浓度点。
[0010] 所述清洗浓缩液的配置步骤如下：以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g于容器中，充分搅拌至 完全溶解； 2) 、称取Tween-20 5g、Triton X-100 5g，充分搅拌，直至完全混匀； 3) 、用4M的HC1调pH，控制pH在7. 5-8. 0之间； 4) 、最后定容1000mL，2-8°C保存。
[0011] 所述底物溶液的配置步骤如下：以配制1L为例： 1) 、称取 NaCl 8.87g、Tris 3.72g、Na2S03 0 . 00 3g 和 Proclin-300 0.4ml 于 1L烧杯中； 2) 、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间； 3) 、加入250ml Lumi-Phos 530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。 所述稳定剂的配置步骤如下：以配制1L为例： 1) 、称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中； 2) 、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间； 3) 、加入50ml甘油后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。 本发明的主要创新之处主要在于： 1、本发明试剂盒提供了一种接近均相的反应体系，与该试剂盒现有间接法ELISA技术 相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和线性范围，并且样本不需要稀释，反应过程只 需要一步清洗，在出结果时间上大大缩短，实验操作简便可靠，并达到了较佳的性能参数。 并且竞争法相对间接法试剂工作浓度要低很多，大大降低了试剂成本。
[0012] 2、本发明公开了一种测定蛋白酶3抗体（PR3_Ab)的新技术，使得反应过程更加快 速可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本； 3、试剂盒中的磁分离试剂，酶标记物，校准品、清洗液浓缩液等组份均是该反应体系下 的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
[0013] 4、本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品，并且成本低 廉，操作简单，应用前景广阔。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本 发明创新精神的限制。
[0016] 实施例1、磁分离试剂的制备： 一、磁微粒缓冲液配制过程，以配制1L为例： 1、 量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌 至完全溶解； 2、 称取BSA 5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300 0. 2 mL至容器中，充分搅拌至完全 溶解； 3、 用4M的HC1调pH，控制在pH在L 9-8. 1之间； 4、 最后用纯化水定容至1L,用0. 2um滤器过滤,2-8°C保存待用； 二、磁分离试剂的制备过程 1、 取含羧基（COOH)活性集团的磁微粒，每克（g)磁微粒(干重）羧基含量不低于0. 3毫 摩尔（mmoL)，具有超顺磁性，直径在0. 5-2 μ m之间； 2、 PR3抗原：可以为天然抗原或重组抗原，纯度应超过95% ; 3、 2_吗啉乙磺酸（MES)、碳二亚胺（EDC)、TRIS、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes)和其他试 剂应达到化学纯； 4、 取 100mg 磁微粒，用 0· 025mol/L，ρΗ4· 5-5 MES 缓冲液 10mL 混悬； 5、 加入0. 5-lmL新鲜配制的浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min ; 6、 磁分离，去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5 MES缓冲液10mL重悬； 7、 加入0· 02-0. lmg的PR3抗原，室温混悬120-240min ; 8、 磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL，完成磁分离试剂的制备。
[0017] 实施例2 :酶标记试剂的制备： 一、 酶标记试剂稀释液配制过程，以配制1L为例： 1、 量取800mL纯化水于容器中，称取Η印es 6. 06g、NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌至 完全溶解； 2、 称取 BSA 5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL 和 MgCl20.1g 于容器中中，充分搅拌 至完全溶解； 3、 用4M的HC1调pH，控制pH在L 5-8. 0之间； 4、 最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、 碱性磷酸酶（ALP)与PR3抗体的偶联 1、 PR3抗体，购自北京久峰润达生物技术有限公司，纯度超过95% ; 2、 碱性磷酸酶纯度应超过95%，比活性应超过1000U/mg，浓度超过5mg/mL ; 3、 取lmg PR3抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT (2-亚胺四氢噻吩）溶液2-4μ L，室 温静置20min，加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 μ L，室温静置5min ;用G-25凝胶柱除盐，收 集活化后抗体，2-8°C保存备用； 4、 取1. 5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 μ L，室温静置30min，用G-25 凝胶柱除盐，收集活化后ALP，2-8°C保存备用； 5、 将上述活化的PR3抗体与活化的ALP混合，2-8 °C条件下静置12-24h，用 Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得PR3抗体-ALP连接物浓溶液，2-8°C保存备用。
[0018] 6、将PR3抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1 μ g/mL，完成 酶标记试剂的制备。
[0019] 实施例3、校准品的制备： 一、校准品稀释液的配制： 1、 量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均 匀； 2、 称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02 mL加入容器中，充分搅 拌至完全溶解； 3、 用4M的HC1调pH，控制pH在L 0-7. 5之间； 4、 最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用。
[0020] 二、校准品的配制： 1、用校准品稀释液将PR3抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6个浓度点。
[0021] 实施例4 :清洗浓缩液的制备： 清洗浓缩液配制过程，以配制1L为例： 1、 量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8.5g于容器中，充分搅拌至 完全溶解； 2、 称取Tween-20 5g、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）5g，充分搅拌，直至完 全混勻； 3、 用4M的HC1调pH，控制pH在L 5-8. 0之间； 4、 最后定容1000mL，2-8°C保存。
[0022] 实施例5:底物溶液的制备： 底物溶液配制步骤，配制1L: 1、 称取 NaCl 8.87g、Tris 3.72g、Na2S03 0 . 00 3g 和 Proclin-300 0.4ml 于 1L 烧杯中； 2、 用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间； 3、 加入250ml Lumi-Phos 530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。 实施例6稳定剂的制备： 1、 称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中； 2、 用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间； 3、 加入50ml甘油后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。 实施例7 本发明试剂盒的测试方法如下： 1、 检测管内依次加入20 μ L样本(或标准品)、50 μ L磁分离试剂、50 μ L酶标记试剂以 及稳定剂2 μ L，混合均匀，37 ±0. 5°C条件下反应10 min ; 2、 检测管放至磁分离器上，静置2分钟；倒出上清液； 3、 清洗浓缩液用纯化水稀释15倍后（即为清洗液)使用，加300 μ L清洗液至检测管中， 置混匀器上振荡混匀30s。
[0023] 4、再重复步骤2、3、2两遍。
[0024] 5、加150 μ L底物溶液至检测管中混匀后进行检测。
[0025] 实施例8 本发明实施例1-6制备的试剂盒的分析性能评价： (1)灵敏度评价 检测"0"浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU)的平均值(Μ)和标准差 (SD)，并计算M-2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟 合得出一次方程，将M-2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方 法的灵敏度不大于0. 5U/mL。其中，Α点发光值参见表1 : 表1
【权利要求】
1. 一种蛋白酶3抗体（PR3-Ab)定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括磁分离 试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂的制备步骤如下： 一、 配制磁微粒缓冲液，以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌 至完全溶解； 2) 、称取BSA 5g，量取新生牛血清50mL，Proclin300 0. 2m至容器中，充分搅拌至完全 溶解； 3) 、调pH，控制在pH在7. 9-8. 1之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L,用0. 2um滤器过滤,2-8°C保存待用； 二、 制备磁分离试剂： 1) 、取100mg含羧基（COOH)活性基团的磁微粒，用0· 025mol/L，ρΗ4· 5-5 MES缓冲液 10mL混悬； 2) 、加入0. 5-lmL浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min ; 3) 、磁分离，去上清，用0. 025mol/L，pH4. 5-5 MES缓冲液10mL重悬； 4) 、加入 0· 02-0. lmg 的 PR3 抗原，室温混悬 120-240min ; 5 )、磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液重悬到lmg/mL，完成磁分离试剂的制备。
3. 如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记试剂的制备步骤如 下： 一、 配制酶标记试剂稀释液，以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Η印es 6. 06g、NaCl 8. 5g加入容器中，充分搅拌 至完全溶解； 2) 、称取 BSA 5g，Zncl20.1g、Proclin-300 0.2mL 和 MgCl20.1g 于容器中中，充分搅拌 至完全溶解； 3) 、调pH，控制pH在7.5-8. 0之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、 碱性磷酸酶（ALP)与PR3抗体的偶联 1 )、取lmg PR3抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液2-4 μ L，室温静置20min，加入 0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 μ L，室温静置5min ;用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的PR3抗 体，2-8 °C保存备用； 2) 、取1. 5mg的ALP，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20 μ L，室温静置30min，用G-25凝胶 柱除盐，收集活化后的ALP，2-8°C保存备用； 3) 、将上述活化的PR3抗体与活化的ALP混合，2-8 °C条件下静置12-24h，用 Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得PR3抗体-ALP连接物浓溶液，2-8°C保存备 用； 4) 、将PR3抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记物稀释液稀释到0. 02-0. 1 μ g/mL，完成酶 标记试剂的制备。
4. 如权利要求1-3任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品的制备步骤如下： 一、校准品稀释液的配制： 1 )、量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均 匀； 2) 、称取磷酸氢二钾3. 4g、磷酸二氢钾0. 36g、Proclin300 0. 02 mL加入容器中，充分 搅拌至完全溶解； 3) 、调pH，控制pH在7. 0-7. 5之间； 4) 、最后用纯化水定容至1L，2-8°C保存待用； 二、校准品的配制：用校准品稀释液将PR3抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共 6个浓度点。
5. 如权利要求1-4任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗浓缩液的配置步骤如 下：以配制1L为例： 1) 、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris 12. lg和NaCl 8. 5g于容器中，充分搅拌至 完全溶解； 2) 、称取Tween-20 5g、Triton X-100 5g，充分搅拌，直至完全混匀； 3) 、调pH，控制pH在7.5-8. 0之间； 4) 、最后定容1000mL，2-8°C保存。
6. 如权利要求1-5任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述底物溶液的配置步骤如下： 以配制1L为例： 1) 、称取 NaCl 8.87g、Tris 3.72g、Na2S03 0 . 00 3g 和 Proclin-300 0.4ml 于 1L烧杯中； 2) 、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围 在7. 5 - 8. 0之间； 3) 、加入250ml Lumi-Phos530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
7. 如权利要求1-6任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂的配置步骤如下：以 配制1L为例： 1) 、称取乙二胺四乙酸二钠2. 3g和氯化镁1. 4g于1L烧杯中； 2) 、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围 在7. 2 - 7. 8之间； 3) 、加入50ml甘油后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
【文档编号】G01N33/531GK104090111SQ201410122408
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年3月30日 优先权日:2014年3月30日
【发明者】于大为, 杨晓勇 申请人:北京中航赛维生物科技有限公司