一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用的制作方法
【专利摘要】一种唾液中糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用，其中糖芯片至少包括NA2F、LNDFI、Lewis-Ytetrasaccharide、LNDFII、Gal、4β-Gal及Lac糖探针的组合，用该糖芯片制备检测唾液中糖结合蛋白的变化的试剂盒，以及利用该糖芯片检测唾液中糖结合蛋白的变化的应用。本发明利用糖探针的组合能非损伤，快速鉴别唾液中糖结合蛋白的变化，为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。
【专利说明】一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴别疾病的糖芯片，具体涉及一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片。
【背景技术】
[0002]国际癌症研究机构的最新资料表明，肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一，2008年全球肝癌患者74.9万，死于肝癌的患者69.5万，其中中国肝癌患者40.2万，死于肝癌的患者37.2万(http://globocan.1arc.fr/)。据中国卫生部《2012中国卫生统计年鉴》显示，2011年恶性肿瘤高居我国主要疾病死亡率的首位，而其中肝癌位居恶性肿瘤死亡率的第二位(http://www.moh.gov.cn)。肝癌死亡率高的原因之一是当前肝癌的确诊通常是在晚期，因而错过了最佳的治疗时期，而且临床诊断后患者平均生存时间不到12个月。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)是目前肝癌诊断的特异性指标,但AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约20%的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP测定仍为阴性。病理组织学检查仍是目前诊断的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测、存在取样差异等。因此寻求非损伤性检查，进行肝癌早期诊断，是防控肝癌的关键。
[0003]随着社会的进步，科学技术的发展，人们对医学检查的要求也越来越高，要求无仓1J、简便、快速的疾病检查诊断方法。与血清标本相比，唾液采集安全方便、无创伤和无血源性疾病传播的危险。而且近年来，唾液作为临床样本已被广泛应用于多种疾病诸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬变、囊性纤维病、糖尿病、心血管病、龋病等的药物水平监测、病情监控和疗效评价当中。研究发现肿瘤发生时，蛋白质和脂分子糖基化的异常导致糖链发生了结构和数量的改变，相应地和这些糖链相互作用的糖结合蛋白(glycan- bindingprotein, GBP)的表达也发生异常改变。从变化的唾液糖结合蛋白中可以找到与疾病相关的生物标志物，而基于唾液检测的新技术和新方法也会逐渐成为今后非侵袭性临床诊断发展的一个方向。随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖结合蛋白被更多的研究者所关注，糖结合蛋白通过和糖蛋白糖链或糖脂糖链的相互作用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等生物学行为。在肝细胞GBP的研究方面已发现了一些GBP，其中有代表性的是位于肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体或肝的Gal/GalNAc受体,通过该受体蛋白与糖链的相互识别和特异性结合，而使去唾液酸糖蛋白运入细胞内。
[0004]我国90% 以上的肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC), 75%?80% 的HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关。目前研究表明:在肝病的炎症、硬化、癌变的过程中患者肝组织和血清中发生了糖蛋白糖链结构和功能的改变，同时也伴随着相关糖结合蛋白数量和种类的改变。糖链因其结构复杂和功能多样，包含了巨大的信息量，当与之相关的糖结合蛋白发生改变时，翻译后的修饰过程即会出现糖链修饰紊乱等情况，就会产生严重的后果。如在病理状态下，由于糖代谢酶类活力的改变或缺陷，可使糖蛋白上的糖链表达水平发生异常，导致细胞功能失常，甚至出现恶性发展。
[0005]生物芯片现已成为快速、高效、高通量取得相关信息的重要手段。随着糖生物学及糖组学研究的进展，糖芯片正发展成为糖生物学及糖组学新兴的检测工具。糖芯片检测样品用量少、高通量、灵敏度极高，并且可以与多种检测手段整合使用，可以快速、准确检测出待测样本中糖结合蛋白数量及种类的差异，因而可大大提生物芯片结果检测、分析的速度和效率，是一种新型的快速、高效的鉴别病症的手段。
[0006]糖芯片是通过固定于芯片上的糖探针与样品中糖结合蛋白特异性结合研究糖结合蛋白与糖链相互作用的最有效的高通量分析工具，其潜在的应用范围非常广泛，例如筛选糖结合蛋白、抗体特异性分析、细菌和病毒的粘附以及酶的特性分析等方面，也能帮助研究者发展新的诊断方法和监测疾病状态以及发展治疗疾病的药物。而凝集素芯片是通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一，其有助于发展新的诊断和监测疾病的方法。两者相比，除检测的对象不同外，糖芯片具有比凝集素芯片检测灵敏度高的特性；而凝集素芯片的制备较糖芯片简单，成本较低。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片及其应用，其能非损伤，快速鉴别唾液中糖结合蛋白的变化，为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。
[0008]本发明的技术解决方案是:
一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，包括测试糖探针组，其特殊之处在于:所述测试糖探针组至少包括 NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal、
4β -Gal及Lac糖探针的组合。
[0009]一种上述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
[0010]上述测试糖探针组还包括Man、Man_9 Glycan、NeuAc、Lewis_b tetrasaccharide、2' -Fucosyl-D-lac>3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl及GlcNAc糖探针的组合
一种上述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
[0011]上述测试糖探针组还包括Lewis-b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDFI及GalNAc糖探针的组合。
[0012]一种利用上述糖芯片制备检测唾液中糖结合蛋白的变化的试剂盒。
[0013]一种上述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
[0014]一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，包括测试糖探针组和对照探针，其特征在于:所述测试糖探针组包括1、II及III组，所述1、II及III组分别是NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal>4 β -Gal 及 Lac 糖探针的组 合，Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide>2 ' -Fucosyl-D-lac、3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl 及 GlcNAc 糖探针的组合，以及:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDF I 及 GalNAc 糖探针的组合。
[0015]一种利用上述糖芯片制备检测唾液中糖结合蛋白的变化的试剂盒。
[0016]一种上述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。[0017]本发明的有益效果是:能非损伤，高通量，快速鉴别唾液中糖结合蛋白的变化，为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为糖芯片上糖探针布局图；
图2为健康人(H)，乙肝(HB)，肝 硬化(HC)和肝癌(HCC)患者唾液糖结合蛋白荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0019]1、实验部分
1.1试剂与材料
甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温-20和蛋白酶抑制剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白(BSA)购自德国Merck公司。Cy3突光均购自美国Amerhsma公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经Mill1-Q50纯水系统(美国Millipore公司)处理的超纯水。S^)hadex G-25柱脱盐购自美国GE Healthcare公司。芯片杂交盒购自美国Bio-Rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。41种糖(具体名称见表1)分别购自Sigma-Aldrich公司、德国Merck公司。
[0020]表1糖探针名称及结构
【权利要求】
1.一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，包括测试糖探针组，其特征在于:所述测试糖探针组至少包括 NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal、4 β -Gal及Lac糖探针的组合。
2.根据权利要求1所述基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，其特征在于:所述测试糖探针组还包括 Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide、2' -Fucosyl-D-1ac>3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N-Acetyl-D_lactosamine、Xyl及GlcNAc糖探针的组合。
3.根据权利要求1所述基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，其特征在于:所述测试糖探针组还包括:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc>4 β -Gal> NA2F、LNDF I 及GalNAc糖探针的组合。
4.一种基于唾液糖结合蛋白鉴别肝系列病的糖芯片，包括测试糖探针组和对照探针，其特征在于:所述测试糖探针组包括1、II及III组，所述1、II及III组分别是NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF II> Gal>4 β -Gal 及 Lac 糖探针的组合，Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide>2 ' -Fucosyl-D-lac、3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl 及 GlcNAc 糖探针的组合，以及:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDF I 及 GalNAc 糖探针的组合。
5.一种权利要求1所述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
6.一种权利要求2所述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
7.—种权利要求3所述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
8.—种权利要求4所述糖芯片的应用，其特征在于:用于检测唾液中糖结合蛋白的变化。
9.一种利用权利要求2所述糖芯片制备检测唾液中糖结合蛋白的变化的试剂盒。
10.一种利用权利要求4所述糖芯片制备检测唾液中糖结合蛋白的变化的试剂盒。
【文档编号】G01N33/68GK103901212SQ201410122367
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】李铮, 吴昊翔, 钟耀刚, 于汉杰, 陈琳 申请人:西北大学