附加唾液酸化糖链的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供附加有高均一性的唾液酸化糖链且具有干扰素β活性的多肽。所述附加糖链的多肽是在选自下述(1)至(4)：(1)由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，(2)在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽中，删除、置换或附加1个或多个氨基酸而成的多肽，(3)为干扰素β的类似物的多肽，以及(4)相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽具有80％以上同源性的多肽，所构成的组中的任一多肽中，有4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换，且该糖链的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的多肽。
【专利说明】附加唾液酸化糖链的多肽
【技术领域】
[0001] 本发明是关于附加唾液酸化糖链的多肽。更具体而言，是关于附加有高均一性的 唾液酸化糖链且具有干扰素 β活性的多肽。
【背景技术】
[0002] 天然的人类干扰素 β (IFN-β)是由166个氨基酸残基所构成的糖蛋白质。已知 干扰素 β属于细胞激素（cytokine)家族，参与免疫调节作用、抗病毒活性、细胞增殖抑制 作用。此外，人类干扰素 β，于天然的氨基酸序列中的第17位、31位、141位具有3个Cys， 于第80位的Asn具有1个复合型之N连接型寡糖。此外，已知于第31位及第141位的Cys 处具有二硫键。
[0003] 作为药物的干扰素 β利用细胞表达系统来制造，依使其表达的宿主的不同而分 类为IFN-P-Ia或IFN-β-lb。IFN-β-la，在使用中国仓鼠的卵巢（CHO)细胞的表达系统 中表达，与天然干扰素 β同样，为具有糖链的糖蛋白质。另一方面，IFN-P-Ib在大肠杆菌 中表达，为不具有糖链的蛋白质。
[0004] 已知IFN-β -la，与IFN-β -Ib相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗肿瘤特性方面， 具有更强的效能。而且，已知在糖蛋白质中所含的糖链结构对于药物动力学具有强影响力。
[0005] 此外，已知若使聚乙二醇（PEG)等水溶性聚合物结合于蛋白质，则将带来蛋白质 的物理稳定性、热稳定性、血浆中稳定性的提高等效果。目前存在有关以PEG修饰的IFN- β 的报道，这些效果受到期待。例如，有关于对IFN-β -Ib的N末端施行PEG修饰而得到的 IFN- β复合物的报道（专利文献1、2)。此外，也存在有关对IFN- β -Ia的N末端施行PEG 修饰而得到的IFN-β复合物的报道（专利文献3)。这些修饰，虽然也许确实可赋予蛋白质 上述稳定性等，但另一方面担心会使作为药物的IFN-β的活性降低。例如，据报道在PEG 的分子量为2万以上的情况，活性急剧地降低（非专利文献1)。
[0006] 考虑PEG修饰的上述担心，而选择纵使结合高分子量的PEG亦可维持IFN- β的活 性的位置，施行部位特异性PEG修饰的报道（专利文献4)亦存在。但是，PEG是不存在于 活体内的化合物，有关长期施用PEG修饰IFN-β的情况的蓄积性、安全性、有效性尚未被充 分研究而未被确立。
[0007] 同时，亦存在有关部位特异性地施行糖链修饰而得到的IFN-β复合物的报道 (专利文献5)。在专利文献5中，对于天然型IFN-β的氨基酸序列，以使其具有共有序列 (Asn-X-Ser/Thr)的方式导入氨基酸突变，并使用CHO细胞来表达，其中该共有序列为N连 接型糖链的识别部位。但是，在该方法中，为了导入共有序列，在附加糖链的氨基酸以外之 处亦发生氨基酸突变。此外，已知在CHO细胞中表达时，一般会发生糖链的不均一性。
[0008] [先前技术文献]
[0009] [专利文献]
[0010] [专利文献1]美国专利申请案公开第2009/0214472号说明书
[0011] [专利文献2]美国专利第7829659号说明书
[0012] [专利文献3]美国专利第7446173号说明书
[0013] [专利文献4]国际公开第2005/019260号
[0014] [专利文献5]国际公开第02/074806号 [0015][非专利文献]
[0016][非专利文献 1]J. Control. Rel.第 88 卷，第 35-42 页（2003)
【发明内容】
[0017][发明所要解决的问题]
[0018] 为了使干扰素 β的物理的稳定性、热稳定性、血浆中稳定性等提高，如上述，存在 以PEG修饰干扰素 β的多肽的例子。但是，在以PEG修饰的情况中，如上述，干扰素 β作 为药物的活性有时会降低。此外，由于PEG不是存在于活体内的物质，所以有在活体内蓄积 而造成药害的担心。
[0019] 另一方面，亦存在以糖链修饰干扰素 β的多肽的例子。但是，例如，通过在CHO细 胞中的表达而制造附加糖链的干扰素 β的情况，如上述，已知在所附加的糖链的种类或附 加的位置方面发生不均一性。在糖链为不均一的情况中，作为医药品时，亦有可能造成各批 次间药效上有所差异；此外，就天然型附加糖链的干扰素 β而言，有所谓血中滞留时间短 的缺点。
[0020] [用于解决问题的手段]
[0021] 本发明的发明人等为了解决上述问题而反复深入研究的结果，发现对于干扰素 β 的多肽，通过以其中的糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的氨基酸，置换4 至6处的氨基酸，可得到与天然人类干扰素 β相比血中滞留性更为优异，且抗肿瘤活性更 为优异的附加糖链的多肽。
[0022] 亦即，在本发明的一方面中，是关于具有干扰素 β活性的附加糖链的多肽，其特 征为该附加糖链的多肽是在选自下述（1)至（4):
[0023] (1)由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0024] (2)在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽中，删除、置换或附加1个或多 个氨基酸而成的多肽，
[0025] (3)为干扰素 β的类似物的多肽，以及
[0026] (4)相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性 (homology)的多肽，
[0027] 所构成的组中的任一多肽中，有4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换，且该 糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的多肽。
[0028] 在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸，可各自独立地为附加糖链的Cys 或附加糖链的Asn。
[0029] 在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸中的糖链，皆可各自独立地选自二 唾液酸糖链、三唾液酸糖链、及四唾液酸糖链所构成的组。
[0030] 在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸中的糖链，皆可各自独立地选自下 述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所构成的组：
[0031]
【权利要求】
1. 附加糖链的多肽，所述附加糖链的多肽具有干扰素0活性，其特征为所述附加糖链 的多肽是在选自由下述（1)至（4)所构成的组中的任一多肽中，有4至6处的氨基酸以附 加糖链的氨基酸置换，且所述糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的多肽： (1) 由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽， (2) 在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽中，删除、置换或附加1个或多个氨 基酸而成的多肽， ⑶为干扰素@的类似物的多肽，以及 ⑷相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽。
2. 如权利要求1所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸各自独立地 为附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
3. 如权利要求1或2所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸中的糖 链，皆各自独立地选自二唾液酸糖链、三唾液酸糖链及四唾液酸糖链所构成的组。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸 中的糖链，皆各自独立地选自下述式（1)、式（2)、式（3)及式（4)所构成的组：
5. 如权利要求1至4中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸 中的糖链皆相同。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基 酸中的至少一个存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、 25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、 70 位、75 位、79 位、99 位、103 位、106 位、107 位、109 位、112 位、115 位、123 位、130 位、136 位、139位及164位所构成的组中的位置相当的位置。
7. 如权利要求6所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸中的至少一 个存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、 107位、112位、123位、及第136位所构成的组中的位置相当的位置。
8. 如权利要求6所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸中的至少3个 存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107 位、112位、123位及136位所构成的组中的位置相当的位置。
9. 如权利要求6所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸皆不存在于 序列编号1所示的氨基酸序列中，与第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、 23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、 64 位、65 位、68 位、69 位、73 位、78 位、83 位、86 位、87 位、90 位、93 位、94 位、100 位、124 位、 125 位、128 位、131 位、132 位、138 位、141 位、142 位、145 位、148 位、149 位、152 位、153 位、 156位、159位、160位或163位的位置相当的位置。
10. 如权利要求6所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸皆存在于序 列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、 35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、 103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位及164位所构成 的组中的位置相当的位置。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述附加糖链的多肽是 化学合成的。
12. 医药组合物，其特征为所述医药组合物包含： (1) 如权利要求1至11中任一项所述的附加糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐； 以及 (2) 药理学上可接受的载体。
13. 如权利要求12所述的医药组合物，其中，所述医药组合物用于与干扰素 P相关的 疾病的治疗或预防。
14. 如权利要求13所述的医药组合物，其中，所述与干扰素 P相关的疾病选自脑肿瘤、 皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性 肝硬化及多发性硬化症所构成的组。
【文档编号】A61K38/00GK104334574SQ201480001384
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】大内政辉, 西原三佳, 手塚克成, 前田政敏, 梶原康宏, 坂本泉 申请人:株式会社糖锁工学研究所