半乳糖衍生物、药物载体及医药组合物的制作方法

专利名称：半乳糖衍生物、药物载体及医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及半乳糖衍生物、药物载体及医药组合物。
技术背景肝细胞的膜表面上存在识别脱唾液酸糖蛋白的受体。所述受体具有识 别脱唾液酸糖蛋白中的半乳糖残基，将脱唾液酸糖蛋白摄入肝细胞的功能 (例如参照非专利文献l)。目前，正在研究通过利用这样的底物特异性在构成脂质体的脂质上添 加半乳糖来提高脂质体对肝脏的指向性，但均未获得令人满意的结果(例如参照专利文献1和2)。另一方面，近年来利用RNA干扰(以下称为"RNAi")的被称为短干扰R NA(以下称为"siRNA")的核酸药物受到注目，开展了大量的研究(例如参 照专利文献3和4)。 siRNA即使单独对人体投与也难以进入细胞内，因此需 要例如包含于适当的载体中来给药。专利文献l:日本专利特开平6-271597号公报专利文献2:日本专利特开平9-235292号公报专利文献3:国际公开第02/055692号文本专利文献4:国际公开第02/055693号文本非专利文献l:M. Spiess， "Biochemistry", 1990年，29巻，10009-10 018页发明的揭示本发明的目的主要在于提供新型有用的半乳糖衍生物、含有其作为必需 构成成分的药物载体以及含有包含药物的该药物载体的医药组合物。本发明人反复认真研究后发现，通过将具有某种特定的化学结构的半乳糖
衍生物用作药物载体的构成成分，对肝脏的指向性和所含药物的药效发挥显著 提高，从而完成了本发明。作为本发明，例如可以例举下述1 3所述的发明。1.以下述通式(I)表示的半乳糖衍生物(以下称为"本发明衍生物")。式(I)中，W表示氢、可取代的碳数1 10的垸基或者1-(D)-脱氧乳糖-l-基(1-(D)-deoxylactito-1-yl)。R2表示碳数10 30的饱和或不饱和的脂肪酸残基。2. 含有上述1所述的半乳糖衍生物和阳离子性脂质作为必需的构成成分的 药物载体(以下称为"本发明载体")。3. 包含药物和上述2所述的药物载体的医药组合物(以下称为"本发明组 合物")。作为R'中所述的碳数1 10的烷基，可以是直链状或分支状，没有特别限 定，可以例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基。其中，较好是碳数1 4的直 链状或分支状的垸基，特别好是甲基、乙基。作为被取代的该烷基，可以例举 烷氧基烷基、卤代烷基。作为所述垸氧基烷基，可以例举例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲 基、乙氧基乙基。其中，较好是碳数1 4的垸氧基垸基，特别好是甲氧基乙基、 乙氧基乙基。卤代烷基的垸基部分与上述垸基同义。此外，作为卤代烷基的齒 素，可以例举例如氟、氯、溴。具体来说，可以例举例如氯甲基、氯乙基、氟 甲基、溴甲基、三氟甲基。作为R2中所述的碳数10 30的饱和的脂肪酸残基，可以例举例如己酰基、 十二烷酰基、十四垸酰基、十八垸酰基、二十垸酰基、二十二烷酰基、二十四 烷酰基、二十六烷酰基、二十九垸酰基、三十烷酰基。其中，较好是碳数10 20的饱和的脂肪酸残基，特别好是十八烷酰基。此外，作为碳数10 30的不饱 和的脂肪酸残基，可以例举例如油酰基、亚油酰基、花生四烯酰基、神经酰基。其中，较好是碳数10 20的不饱和的脂肪酸残基，特别好是油酰基。作为优选的本发明衍生物，可以例举例如N-[1-(D)-脱氧乳糖-l-基] 油酰胺、N,N-二[1-(D)-脱氧乳糖-l-基]油酰胺。附图
的简单说明图l表示对肝脏的指向性。纵轴表示放射活性(dpm)，横轴表示实施例l 的本发明化合物的含量(mg)。图2表示丙型肝炎病毒(以下称为"HCV")的复制子的复制抑制活性。 纵轴表示将对照的产生量设为100%时的NS5A蛋白的产生量(对照的％)。此 外，空白的柱表示siRNA的处理浓度为30nM的细胞的结果，涂黑的柱表示 siRNA的处理浓度为100nM的细胞的结果。图3表示HCV的复制子的复制抑制活性。纵轴表示将对照的产生量设为 100%时的新霉素磷酸转移酶11蛋白(以下称为"NPTII蛋白")的产生量(对 照的％)。此外，空白的柱表示siRNA的处理浓度为30nM的细胞的结果，涂 黑的柱表示siRNA的处理浓度为100nM的细胞的结果。图4表示人VEGF-A蛋白的产生抑制活性。纵轴表示将对照的产生量设为 100X时的人VEGF-A蛋白的产生量(对照的M)。此外，空白的柱表示siRNA 的处理浓度为30nM的细胞的结果，涂黑的柱表示siRNA的处理浓度为100nM 的细胞的结果。图5表示人VEGF-A蛋白的产生抑制活性。纵轴表示将对照的产生量设为 100X时的人VEGF-A蛋白的产生量(对照的X)。此外，空白的柱表示siRNA 的处理浓度为30nM的细胞的结果，涂黑的柱表示siRNA的处理浓度为100nM 的细胞的结果。图6表示细胞毒性。纵轴表示将对照的细胞数设为100%时的细胞数(对 照的％)。此外，空白的柱表示siRNA的处理浓度为30nM的细胞的结果，涂 黑的柱表示siRNA的处理浓度为100nM的细胞的结果。
实施发明的最佳方式I .本发明衍生物的制造方法本发明衍生物(I )可以通过将以下述通式(l)表示的胺衍生物和以下述通式(2)表示的羧酸衍生物溶解于适当的溶剂中，在适当的縮合剂的存在 下使其反应来进行制造。作为适当的溶剂，只要不参与反应即可，没有特 别限定，可以例举例如卤代烃(例如二氯甲烷、三氯甲垸、四氯化碳、1，2-二氯乙烷)、乙腈、二甲基甲酰胺、它们的混合溶剂。作为縮合剂，可以例 举例如N，N，-二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、 1-羟基苯并三唑。反应温度以在0 80'C的范围内为宜。此外，反应时间根 据使用原料的种类、反应温度等而不同，通常以在1 30小时的范围内为宜。(式中，R1、 R2与前述同义)R'为氢或1- (D)-脱氧乳糖-l-基的胺衍生物(1)可以通过将D- (+)-乳糖(3) 和适当的铵盐(例如四硼酸铵四水合物、乙酸铵、碳酸铵)溶解于适当的溶剂中， 在酸性条件下使还原剂与之作用来进行制造。作为适当的溶剂，只要不参与 反应即可，没有特别限定，可以例举例如水、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙 醇)、卤代烃(例如二氯甲烷、二氯乙垸、三氯甲烷)、它们的混合溶剂。作 为酸，可以例举例如乙酸、盐酸、甲苯磺酸。作为还原剂，可以例举例如 硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢化锂铝。反应温度以在0 8(TC的范围内为宜。 此外，反应时间根据使用原料的种类、反应温度等而不同，通常以在1 100 小时的范围内为宜。另外，制造Ri为氢的胺衍生物(l)时，相对于l当量的D-(-)-乳糖，最好 使用1 10当量的范围内的铵盐。此外，制造W为1-(D)-脱氧乳糖-1-基的胺衍 生物(1)时，相对于l当量的铵盐，最好使用2当量以上的D-(+)-乳糖。R2-OH ( 2 〉缩合剂(3) (la)(式中，R3表示氢或1-(D)-脱氧乳糖-l-基)R'为可取代的碳数l 10的垸基的胺衍生物(l)可以通过在上述的Ri为氢 或1- (D)-脱氧乳糖-l-基的胺衍生物(1)的胺衍生物(1)的制造方法中，使用可 取代的碳数1 10的烷基胺代替铵盐来进行制造。作为所述的烷基胺的烷基部分，可以是直链状或分支状，没有特别限定， 可以例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁 基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基。其中，较好是碳数1 4的直链状 或分支状的垸基，特别好是甲基、乙基。作为被取代的烷基胺，可以例举垸氧 基胺。作为所述烷氧基胺，可以例举例如甲氧基甲基胺、甲氧基乙基胺、乙氧 基甲基胺、乙氧基乙基胺。(3 ) O "(式中，W表示可取代的碳数l 10的烷基)^为氢的本发明衍生物(I )也可以通过在上述的本发明衍生物(I )的制 造方法中，胺衍生物使用包含R'为氢的胺衍生物(l)和R'为l-(D)-脱氧乳糖-l-基的胺衍生物(l)的胺衍生物，反应后，用适当的溶剂萃取来进行制造。作为 使用的溶剂，没有特别限定，可以例举例如水、醇类(例如甲醇、乙醇、异 丙醇)、卤代烃(例如二氯甲垸、二氯乙垸、三氯甲垸)、它们的混合溶剂。II.本发明载体本发明载体以本发明衍生物和阳离子性脂质为必需的构成成分，具有能
够将后述的药物递送至细胞内的性质。具体来说，可以采用脂质体或脂肪乳剂 等形态。作为本发明载体的必需构成成分的阳离子性脂质，只要是医药上允许的 阳离子性脂质即可，没有特别限定，可以例举例如2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基 甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、氯化N- U- (2， 3-二油基氧基)丙基} -N， N， N-三甲 基铵、溴化二甲基二(十八烷基)铵、溴化l，2-二(十四垸基氧基丙基)-3-二甲 基-羟乙基铵、N，N'，N"，N111-四甲基-N，N'，N"，N111-四(十六垸基)精胺、2， 3-二油 基氧基-N-{2-(精胺酰胺基)乙基}-N， N-二甲基-l-丙基铵三氟乙酸盐(2， 3-dio leyloxy-N- {2- (spermine carboxamido) ethyl卜N， N-dimethyl-1-propana minium trif luoroacetate)。可以使用其中的一种或两种以上。其中，特别 好是2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1, 3-0-二油酰基甘油。本发明载体中的本发明衍生物和阳离子性脂质的配比为，相对于l重量 份阳离子性脂质，本发明衍生物以在0.01 10重量份的范围内为宜，较好 是0.05 5重量份的范围内，更好是0.5 3重量份的范围内。本发明载体中，除了作为必需构成成分的本发明衍生物和阳离子性脂 质之外，可以再加入磷脂。作为所述磷脂，只要是医药上允许的磷脂即可， 没有特别限定，可以例举例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂 酰丝氨酸、鞘磷脂、卵磷脂、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、 二棕榈酰基磷脂酰甘油。可以使用其中的一种或两种以上。其中，特别好是蛋 黄磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂。在还加入磷脂的情况下，本发明载体中的本发明衍生物和磷脂的配比 为，相对于l重量份磷脂，本发明衍生物以在0.01 100重量份的范围内为 宜，较好是O. 1 10重量份的范围内，更好是O. 3 2重量份的范围内。此外， 相对于l重量份阳离子性脂质，本发明衍生物和磷脂的总和以在0.01 10重 量份的范围内为宜，较好是0.05 5重量份的范围内，更好是0.5 3重量份 的范围内。本发明载体的分散液可以通过将本发明衍生物和阳离子性脂质或者本 发明衍生物、阳离子性脂质和磷脂混合，用常规方法将其分散于水溶液中 来调制。分散可以适当采用超声波分散装置、乳化分散装置等装置。m.本发明组合物作为可用于本发明组合物的"药物"，可以例举例如水溶性阴离子性 化合物、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗生素。具体来说，可以例举作为核酸化合物的双链RNA、双链DNA或低聚核酸，作为酸性糖的硫酸乙酰肝素或硫酸 葡聚糖等，细胞因子类，环状AMP、 ATP和IP3等第二信使类，青霉素类和头 孢菌素类，维生素C和视黄醇类等维生素类，其它具有酸性基团的已知药物， 干扰素(a、 3、 Y)，白细胞介素(IL-1、 IL-2)，集落刺激因子(CSF)，肿 瘤坏死因子(TNF)，左旋咪唑，苯丁抑制素，视黄酸，5-氟尿嘧啶(5-FU)， 阿糖胞苷(Am-C)，阿糖腺苷(Ara-A)，顺式铂氨(CDDP)，环磷酰胺，叠氮 胸苷(AZT)等。作为双链RNA，可以例举例如以下的物质。1. 均聚物 均聚物复合体 聚肌苷酸 聚胞苷酸、 聚肌苷酸 聚(5-溴胞苷酸)、 聚肌苷酸 聚(2-硫代胞苷酸)、 聚(7-脱氮肌苷酸) 聚胞苷酸、 聚(7-脱氮肌苷酸)，聚(5-溴胞苷酸)、 聚(2'-叠氮肌苷酸) 聚胞苷酸、 聚肌苷酸 聚(胞苷-5'-硫代磷酸)。2. 均聚物 共聚物复合体 聚肌苷酸 聚(胞苷酸，尿苷酸)、 聚肌苷酸 聚(胞苷酸，4-硫代尿苷酸)。3. 合成核酸和聚阳离子的复合体 聚肌苷酸 聚胞苷酸 聚-L-赖氨酸。4. 其它聚肌苷酸 聚(l-乙烯基胞苷酸)。作为低聚核酸，可以例举一分子内具有10 50、较好是15 30、更好 是18 25个核酸碱基的RNA、 DNA及它们的衍生物。例如，可以例举siRNA、 微腿(miRNA)、短发卡RNA(shRNA)、反义DNA、反义RNA、 DNA酶、核酶、适
体、非编码RNA。上述低聚核酸并不局限于天然型，为了提高核酸酶耐性等、体内的稳 定性，构成该核苷酸的糖或磷酸主链等的至少一部分可以被修饰。作为所 述修饰，可以例举例如核糖的2'位的修饰、核糖的其它部分的修饰、磷酸主链的修饰。作为核糖的2'位的修饰，可以例举例如将核糖的2'位的羟基取 代为H、 0R5、 R5、 R60R5、 SH、 SR5、 NH2、 NHR5、 N(R5)2、 N3、 CN、 F、 Cl、 Br、 I的修饰。在这里，R5表示垸基或芳基。此外，R6表示亚烷基。作为R5的垸基，可以是直链状或分支状，没有特别限定，可以例举例如碳 数1 6的烷基。具体来说，可以例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁 基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、 异己基。该烷基可以被取代，作为所述取代基，可以例举例如卤素、垸基、垸 氧基、氰基、硝基，可以被1 3个这些基团取代。作为所述卤素，可以例举氟、 氯、溴、碘。作为所述垸基，可以例举与上述垸基同样的基团。作为所述垸氧 基，可以是直链状或分支状，没有特别限定，可以例举例如碳数1 6的垸氧基。 具体来说，可以例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁 氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基。其 中，特别好是碳数1 3的垸氧基。作为R5的芳基，可以例举例如碳数6 10的芳基。具体来说，可以例举 例如苯基、a-萘基、P-萘基。其中，特别好是苯基。作为R6的亚垸基，可以是直链状或分支状，没有特别限定，可以例举例 如碳数1 6的亚垸基。具体来说，可以例举例如亚甲基、亚乙基、1，3-亚丙基、 1， 4-亚丁基、1， 5-亚戊基、1, 6-亚己基、2-(乙基)-1, 3-亚丙基、1-(甲基)-1， 4-亚丁基。作为核糖的其它部分的修饰，可以例举例如使4'位硫代的修饰。作为磷酸 主链的修饰，可以例举例如形成硫代磷酸酯体、二硫代磷酸酯体、垸基磷酸酯 体或氨基磷酸盐体的修饰。本发明组合物中所含的本发明载体和药物的重量比(本发明载体/药物)根 据药物的种类、本发明载体中的本发明衍生物和阳离子性脂质的配比等而不 同，以在O. 01 1000的范围内为宜，较好是在10 300的范围内，更好是在100 200的范围内。另外，在含有药物为低聚核酸的情况下，以在0.01 100的范围 内为宜，较好是在1 30的范围内，更好是在10 20的范围内。本发明组合物中，除上述的本发明载体和药物之外，可以任意地掺入 医药上允许的添加剂。作为所述添加剂，可以例举例如乳化助剂(例如碳数 6 22的脂肪酸或其医药上允许的盐、白蛋白、葡聚糖)、稳定剂(例如胆固 醇、磷脂酸)、等渗剂(例如氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻 糖)、pH调整剂(例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三 乙醇胺)。可以使用其中的一种或两种以上。本发明组合物中的该添加剂的含 量以90重量％以下为宜，较好是70重量％以下，更好是50重量％以下。本发明组合物可以通过在本发明载体的分散液中加入药物并适当搅拌来 调制。此外，也可以通过在本发明载体的制造过程中加入药物来调制。上述添 加剂可以在分散前或分散后在适当的工序中添加。本发明组合物例如可以制成液体制剂或其冷冻干燥制剂。制成液体制剂的 情况下，本发明组合物中所含的本发明载体的浓度以在O. 001 25Xw/v的范围 内为宜，较好是在0.01 5^w/v的范围内，更好是在O. 1 2Xw/v的范围内。上述冷冻干燥制剂可以通过用常规方法将具有液体制剂形态的本发明组 合物进行冷冻干燥处理来调制。例如，将具有液体制剂形态的本发明组合物进 行适当的灭菌后，将规定量分注到玻璃瓶中，在约-40 -2(TC的条件下进行约 2小时的预冷冻，在约0 1(TC下于减压下进行第一次干燥，然后在约15 25'C 下于减压下进行第二次干燥，从而将其冷冻干燥。接着， 一般将玻璃瓶内部用 氮气置换，加塞后即可获得本发明组合物的冷冻干燥制剂。本发明组合物的冷冻干燥制剂一般可以通过添加任意的适当溶液(再溶解 液)进行再溶解来使用。作为这样的再溶解液，可以例举注射用水、生理盐水、 其它一般输液用液。该再溶解液的液量根据用途等而不同，没有特别限定，以 冷冻干燥前的液量的O. 5 2倍的量或500mL以下为宜。本发明组合物可以用于例如癌症、病毒性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、 神经疾病的治疗。本发明组合物的给药形式只要是医药上允许的给药形式即可，没有特别限 定，可以根据治疗方法进行选择。例如，可以例举静脉内给药、动脉内给药、口服给药、经肺给药、组织内给药、经皮给药、粘膜给药、直肠内给药、膀胱 内给药、腹腔内给药、眼内给药、脑内给药、胸腔内给药。其中，特别好是静 脉内给药、经皮给药、粘膜给药。此外，作为本发明组合物可采用的剂型，没 有特别限定，例如可以制成各种注射剂、口服剂、滴剂、吸入剂、滴眼剂、软 膏剂、洗剂、栓剂来给药。例如，本发明组合物作为药物时的用量最好根据药物的种类、剂型、 年龄和体重等患者的状态、给药形式、疾病的性质和程度来进行调整，成人的药量一般每天在O. 01mg 10g/人的范围内，较好是在O. lrag 5g/人的 范围内。另外，本发明组合物所含的药物为低聚核酸的情况下，给与成人 的低聚核酸量一般每天在O. lmg 10g/人的范围内，较好是在lmg 5g/人的 范围内。该数值会根据目标疾病的种类、给药形式、靶分子而不同。因此， 有时在该值以下就已足够，或者有时反而需要该值以上的用量。此外，可 以1天给药1次 数次，或者以1天 数天的间隔进行给药。 实施例以下，列举参考例、实施例、比较例和试验例，对本发明进行更详细 的说明，但本发明并不限定在实施例所示的范围内。实施例l N-[l-(D)-脱氧乳糖-l-基]油酰胺的合成工序l 1-(D)-脱氧乳糖-l-基胺、二[l-(D)-脱氧乳糖-l-基]胺的混合 物的合成将20g乳糖一水合物和22g四硼酸铵四水合物悬浮于300mL甲醇、80mL H20和100mL乙酸的混合液中，滴加100mL7X氰基硼氢化钠/甲醇溶液，在室 温下搅拌一整夜。将该反应液在7(TC下再搅拌3小时后，将该反应液在减压 下浓縮。向其残渣加入甲醇，滤取不溶物，将该滤取的不溶物在减压下干 燥。将所得的粉末溶解于少量的&0，使该溶液通过填充有500mL阳离子交换 树脂[D0WEX(注册商标)50WX2(吡啶型)]的柱，将柱充分水洗。接着，使3 %氨水通过柱，将所得的洗脱液在减压下浓縮，获得12g目标混合物。工序2 N-[1-(D)-脱氧乳糖-l-基]油酰胺的合成将4.9g油酸、4. 36g二环己基碳二亚胺溶解于100mL二甲基甲酰胺，在 室温下搅拌15分钟。在该反应液中加入上述工序1中得到的5. 5g混合物，再
加入50mL二甲基甲酰胺。将该溶液在室温下搅拌3小时后，在减压下浓縮。 向残渣加入二氯甲垸/甲醇(2/l)的混合液，进行离心分离，回收上清的二 氯甲烷/甲醇(2/l)的混合液。再进行3次该操作，将回收的二氯甲垸/甲醇 (2/1)的混合液在减压下浓縮。向残渣加入24mL H20、 60mL甲醇和30mL二氯 甲垸并溶解，再加入30mL二氯甲垸和30mLH20，充分混合。然后，离心分离， 回收水层，进行冷冻干燥。将残渣通过硅胶柱色谱法进行纯化，获得13g目 标物(本发明衍生物)。MALDI-TOF Mass (m/z) =608. 287([M+H]+)MALDI-TOF Mass (m/z) =630. 448 ([M+Na] +)实施例2本发明载体的分散液的调制(l)将60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、20mg 实施例l的本发明化合物和80mg蛋黄卵磷脂(和光纯药工业株式会社(和光純薬 工業社)制，下同)在玻璃瓶中溶解于2mL三氯甲烷，向其中通入氮气而除去三 氯甲垸，在玻璃瓶的壁面形成薄膜。将其再在减压下放置一晚后，加入4. 920mL 10X麦芽糖和80"L1N盐酸，用旋涡混合器使薄膜分散。然后，在4'C放置3小 时后，使用微探针，进行l分钟的超声波处理，制成32mg/mL的本发明载体的分 散液。实施例3本发明载体的分散液的调制(2)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、40mg 实施例l的本发明化合物和60mg蛋黄卵磷脂，与实施例2同样地制成本发明载体 的分散液。实施例4本发明载体的分散液的调制(3)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 实施例l的本发明化合物和40mg蛋黄卵磷脂，与实施例2同样地制成本发明载体 的分散液。实施例5本发明载体的分散液的调制(4)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1, 3-0-二油酰基甘油、80mg 实施例l的本发明化合物和20mg蛋黄卵磷脂，与实施例2同样地制成本发明载体 的分散液。
实施例6本发明载体的分散液的调制(5)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油、 100mg实施例l的本发明化合物，与实施例2同样地制成本发明载体的分散液。 实施例7本发明载体的分散液的调制(6)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、20mg 实施例1的本发明化合物和80mg二棕榈酰基磷脂酰胆碱(日本油脂株式会社(曰 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 10%麦芽糖和80u L 1N盐酸，用旋涡混 合器使其分散。然后，使用微探针，进行l分钟的超声波处理，制成32mg/mL的 本发明载体的分散液。实施例8本发明载体的分散液的调制(7)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 实施例l的本发明化合物和40mg二棕榈酰基磷脂酰胆碱，与实施例7同样地制成 本发明载体的分散液。实施例9本发明载体的分散液的调制(8)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、20mg 实施例l的本发明化合物和80mg大豆卵磷脂(和光纯药工业株式会社(和光純薬 工業社)制，下同)中，加入4.920mL 0. 9XNaCl溶液和80 y L 1N盐酸，用旋涡 混合器使其分散。然后，在4'C放置3小时后，使用微探针，进行l分钟的超声 波处理，制成32mg/mL的本发明载体的分散液。实施例IO本发明载体的分散液的调制(9)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 实施例l的本发明化合物和40mg大豆卵磷脂，与实施例9同样地制成本发明载体 的分散液。实施例ll本发明载体的分散液的调制(10)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、20mg 实施例1的本发明化合物和80mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱(日本油脂株式会社(日 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 5%D-甘露糖醇和80 u L 1N盐酸，用旋 涡混合器使薄膜分散。然后，在4t:放置3小时后，使用微探针，进行l分钟的 超声波处理，制成32mg/mL的本发明载体的分散液。
实施例12本发明载体的分散液的调制(ll)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 实施例l的本发明化合物和40mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱，与实施例ll同样地制成本发明载体的分散液。实施例13本发明载体的分散液的调制(12)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、20mg 实施例l的本发明化合物和80mg二棕榈酰基磷脂酰甘油(日本油脂株式会社(曰 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 5X葡萄糖和80pL 1N盐酸，用旋涡混 合器使薄膜分散。然后，在4'C放置3小时后，使用微探针，进行l分钟的超声 波处理，制成32mg/mL的本发明载体的分散液。实施例14本发明载体的分散液的调制(13)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 实施例l的本发明化合物和40mg二棕榈酰基磷脂酰甘油，与实施例13同样地制 成本发明载体的分散液。比较例l比较对照用载体的分散液的调制(1)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1, 3-0-二油酰基甘油、 100mg蛋黄卵磷脂，与实施例2同样地制成比较对照用载体的分散液。 比较例2比较对照用载体的分散液的调制(2)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、 100mg二棕榈酰基磷脂酰胆碱，与实施例7同样地制成比较对照用载体的分散 液。比较例3比较对照用载体的分散液的调制(3)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1, 3-0-二油酰基甘油、 100mg大豆卵磷脂，与实施例9同样地制成比较对照用载体的分散液。 比较例4比较对照用载体的分散液的调制(4)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1,3-0-二油酰基甘油、 100mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱，与实施例ll同样地制成比较对照用载体的分散液。比较例5比较对照用载体的分散液的调制(5)
使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油、 lOOmg二棕榈酰基磷脂酰甘油，与实施例13同样地制成比较对照用载体的分散 液。试验例l对肝脏的指向性的评价(1) 核酸溶液的调制含有由具有序列编号1的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号2的碱基 序列的低聚RNA构成的氚标记了的siRNA的核酸溶液通过使用体外转录T7试 剂盒(宝生物技术株式会社(夕力，才社)制)，使其含有氚标记了的 [25，8-3H]腺苷5，-三磷酸铵盐(安玛西亚生物科技公司(77、>亇厶 才 廿^工y7社)制)来调制。另外，所述核酸溶液中的siRNA的浓度为20uM。 此外，比活性为6. 4X105dpm/u g。向8. 75u L上述工序中制成的核酸溶液中，添加341. 25w L以20u M的浓 度含有由具有序列编号1的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号2的碱基序 列的低聚RNA构成的未标记氚的siRNA的核酸溶液，制成比活性为1.6X 104dpm/u g的核酸溶液。(2) 组合物的调制向10u L上述(l)中制成的比活性为1.6X10Mpm/u g的核酸溶液中添 加90uL10X麦芽糖，制成以2uM的浓度含有siRNA的核酸溶液。此外，向 实施例2 6或比较例1的载体的分散液中加入10%麦芽糖进行稀释，制成 429p g/mL的载体分散液。向各载体分散液(429 n g/mL)添加等量的核酸溶液(2 u M)，使用旋涡混 合器混合。然后，在室温下静置15分钟，进行15秒的超声波处理，制成以l u M的浓度含有siRNA的组合物。(3) 实验方法在6孔板中以2. 5X105细胞/孔接种作为来源于人肝细胞癌的细胞株的 HuH-7细胞，在37'C、 5%0)2的条件下培养18小时。更换培养基后，每孔添 加100ixL上述(2)中制成的组合物，使siRNA的最终浓度达到100nM，再进行 培养。添加组合物8小时后，用lmL磷酸缓冲盐溶液(以下称为"PBS")将细 胞清洗2次，用400 " L胰蛋白酶/EDTA(西格马公司(SIGMA社)帝lj)使细胞剥
离，回收至微量离心管中。为了不残留细胞，在回收后的孔中再加入800u LPBS，回收至与上述同一管中。将其以3000rpm离心2分钟后，除去800uL 上清，将剩下的全部移至闪烁用玻璃瓶中。各玻璃瓶中加入4mL液体闪烁剂 混合物(Emulsifier Scintillator Plus,珀金埃尔默公司(Perkin Elmer 社)制)，充分混合，通过液体闪烁计数器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer 社)帝'J)测定放射活性。 (4)试验结果其结果如图l所示，证实对肝脏的指向性随实施例l的本发明化合物的 含量而提高。试验例2药理活性的评价(l)以作为HCV的非结构蛋白的NS5A蛋白的产生量为指标，评价含有实施例 7或8的本发明载体和具有抑制HCV复制的活性的siRNA的本发明组合物的药 理活性。(1) 核酸溶液的调制使具有序列编号3的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号4的碱基序列 的低聚RNA分别溶解于注射用水，使浓度达到100uM，制成低聚RNA的原液。 然后，将各20nL在试管内混合，再向其中添加60iiL注射用水，制成以20 u M的浓度含有siRNA的核酸溶液。另外，上述2种低聚RNA的合成委托日本生物服务株式会社(日本/《,才 寸一匕、、只)。(2) 组合物的调制向10u L上述(l)中制成的核酸溶液(20y M)中添加90u L 10%麦芽糖， 制成以2uM的浓度含有siRNA的核酸溶液。此外，向1.3uL实施例7、 8或比 较例2的载体的分散液中添加98. 7uL 10%麦芽糖，制成428. 8mg/mL的载体 分散液。将100 " L核酸溶液(2 u M)和100 u L载体分散液(428. 8mg/mL)在试管内 混合，在4t:静置15分钟后，进行超声波处理，制成以lwM的浓度含有siRNA 的组合物。将该组合物用10%麦芽糖进行适当稀释后用于以下的实验。(3) 实验方法
在6孔板中以lX105细胞/孔接种保持有HCV的复制子的HuH-7细胞[关 于所述细胞的详细内容，请参照文献(Biochemical and Biophysical Res earch Communications, 2000年，293巻，993-999页)]，在37。C、 5%C02 的条件下培养20小时。然后，每孔添加100uL上述(2)中制成的组合物，使 siRNA的最终浓度达到30nM或100nM，再在同样的条件下培养96小时。将培 养后的细胞用PBS清洗后，回收细胞，制成细胞溶解液。使蛋白质总量为5ug的细胞溶解液热变性后，通过SDS-PAGE分离，电 转印至聚偏二氟乙烯膜(以下称为"PVDF膜")(密理博公司(3 y求7社) 制)。将转印后的PVDF膜用抗NS5A多克隆抗体(维络金公司(Viro Gen社)帝U) 和辣根过氧化物酶(以下称为"HRP")标记抗兔IgG抗体(细胞信号技术公司 (Cell signaling technologies社)制)染色。将染色后的PVDF膜用Chemilu minescence Reagent Plus (珀金埃尔默公司(Perkin Elmer社)制)使其化 学发光，将对应于NS5A蛋白的条带的发光强度通过图像分析仪(伯乐公司(B ioRad社)制)定量而数值化。此外，用抗ci-肌动蛋白单克隆抗体(西格马公 司(SIGMA社)制)和服P标记抗小鼠IgG抗体(细胞信号技术公司(Cell signa ling technologies社)制)，也同样地算出对应于a -肌动蛋白的条带强度。将对应于NS5A蛋白的条带的定量值除以对应于a-肌动蛋白的条带的 定量值所得的数值作为单位蛋白质量的NS5A蛋白的产生量。(4) 评价方法通过将添加10X麦芽糖的细胞的单位蛋白质量的NS5A蛋白的产生量设 为100%，比较添加各本发明组合物的细胞的NS5A蛋白的产生量来进行评 价。另外，NS5A蛋白的产生量越少，则表示HCV的复制子的复制越受到抑制。(5) 试验结果其结果如图2所示，可知使用实施例7和8的本发明载体的情况与使用比 较例2的载体的情况相比，更强地抑制HCV的复制子的复制。 试验例3药理活性的评价(2)以作为新霉素耐性基因的产物的NPTII蛋白的产生量为指标，评价含有 实施例9或10的本发明载体和具有抑制HCV的复制的活性的siRNA的本发明 组合物的药理活性。(1) 组合物的调制使用实施例9、 10或比较例3的载体的分散液和上述试验例2中制成的核酸溶液(2uM)，与试验例2同样地操作，制成以l&M的浓度含有siRNA的组 合物。将该组合物用10%麦芽糖进行适当稀释后用于以下的实验。(2) 实验方法在12孔板中以5X104细胞/孔接种保持有HCV的复制子的HuH-7细胞[关 于所述细胞的详细内容，请参照文献(Biochemical and Biophysical Res earch Communications, 2000年，293巻，993-999页)]，在37。C、 5%C02 的条件下培养一晚。翌日，从培养板吸去培养基，加入0.9mL培养基来进行 培养基更换。每孔添加100pL上述(l)中制成的组合物，使siRNA的最终浓 度达到30nM或100nM，再在同样的条件下培养96小时。将培养后的细胞用PB S清洗后，回收细胞，制成蛋白质提取液。使用市售的测定试剂盒(PathoSc reen Kit for NPTII，阿戈地亚公司(Agdia社)帝1」)测定该蛋白质提取液中 的NPTII蛋白的量。蛋白质提取液的调制使用试剂盒附带的提取用缓冲液。 此外，使用市售的试剂盒(BCA Protein Assay Kit，皮尔斯公司(Pierce社)制)测定提取的蛋白质中的蛋白质总量。(3) 评价方法通过将添加10^麦芽糖的细胞的单位蛋白质量的NPTII蛋白的产生量 设为100%，比较添加各本发明组合物的细胞的NPTII蛋白的产生量来进行 评价。另外，NPTII蛋白的产生量越少，则表示HCV的复制子的复制越受到 抑制。(4) 试验结果其结果如图3所示，可知使用实施例9和10的本发明载体的情况与使用 比较例3的载体的情况相比，更强地抑制HCV的复制子的复制。 试验例4药理活性的评价(3)以人VEGF-A蛋白的产生量为指标，评价含有实施例11或12的本发明载 体和针对人VEGF-A基因的siRNA的本发明组合物的药理活性。 (l)组合物的调制将由具有序列编号5的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号6的碱基序
列的低聚RNA构成的针对人VEGF-A基因的s i RNA (安比昂公司(Amb i on社)帝lj) 用注射用水稀释，制成以20uM的浓度含有siRNA的核酸溶液。向10uL核酸 溶液(20pM)中添加90uL 10%麦芽糖，制成以2uM的浓度含有siRNA的核 酸溶液。此外，向l. 3 u L实施例ll、 12或比较例4的载体的分散液中添加98. 7 uL 10%麦芽糖，制成428. 8mg/mL的载体分散液。将100 " L核酸溶液(2 u M)和100 u L载体分散液(428. 8mg/mL)在试管内 混合，在4X:静置15分钟后，进行超声波处理，制成以lpM的浓度含有siMA 的组合物。将该组合物用10%麦芽糖进行适当稀释后用于以下的实验。(2) 实验方法在12孔板中以lX10s细胞/孔接种HuH-7细胞，在37。C、 5%(:02的条件下 培养18小时。翌日，从培养板吸去培养基，加入0.9mL培养基来进行培养基 更换。每孔添加100uL上述(l)中制成的组合物，使siRNA的最终浓度达到3 OnM或100nM，再在同样的条件下培养24小时。然后，从培养板吸去培养基， 加入0.9mL培养基来进行培养基更换，再在同样的条件下培养24小时。培养 后，使用市售的试剂盒(Human VEGF Immunoassay Kit,安迪系统公司(R& D systems社)制)测定培养上清中的人VEGF-A蛋白的量。(3) 评价方法通过将添加10X麦芽糖的细胞的人VEGF-A蛋白的产生量设为100X，比 较添加各本发明组合物的细胞的人VEGF-A蛋白的产生量来进行评价。(4) 试验结果其结果如图4所示，可知使用实施例11和12的本发明载体的情况与使用 比较例4的载体的情况相比，同等或更强地抑制人VEGF-A蛋白的产生。 试验例5药理活性的评价(4)以人VEGF-A蛋白的产生量为指标，评价含有实施例13或14的本发明载 体和针对人VEGF-A基因的siRNA的本发明组合物的药理活性。 (l)组合物的调制使用实施例13、 14或比较例5的载体的分散液和上述试验例4中制成的 核酸溶液(2uM)，与试验例4同样地操作，制成以l"M的浓度含有siRNA的 组合物。将该组合物用10%麦芽糖进行适当稀释后用于以下的实验。 (2) 实验方法在12孔板中以2 X 105细胞/孔接种作为来源于人肝癌的细胞株的H印G2 细胞，在37。C、 5%0)2的条件下培养18小时。翌日，从培养板吸去培养基， 加入0.9mL培养基来进行培养基更换。每孔添加100"L上述(1)中制成的组 合物，使siRNA的最终浓度达到30nM或100nM，再在同样的条件下培养24小 时。然后，从培养板吸去培养基，加入0.9mL培养基来进行培养基更换，再 在同样的条件下培养24小时。培养后，使用市售的试剂盒(Human VEGF Imm unoassay Kit,安迪系统公司(R&D systems社)制)测定培养上清中的人VEG F-A蛋白的量。(3) 评价方法通过将添加10X麦芽糖的细胞的人VEGF-A蛋白的产生量设为100X，比 较添加各本发明组合物的细胞的人VEGF-A蛋白的产生量来进行评价。(4) 试验结果其结果如图5所示，可知使用实施例13和14的本发明载体的情况与使用 比较例5的载体的情况相比，更强地抑制人VEGF-A蛋白的产生。 试验例6细胞毒性的评价(1) 组合物的调制使用实施例2、 4、 6或比较例1的载体的分散液和上述试验例2中制成的 核酸溶液(2nM)，与试验例2同样地操作，制成以luM的浓度含有siRNA的 组合物。将该组合物用10%麦芽糖进行适当稀释后用于以下的实验。(2) 实验方法在96孔板中以3X10，胞/孔接种HuH-7细胞，在37。C、 5%(^02的条件下 培养18小时。然后，每孔添加ll. 1PL上述(1)中制成的组合物，使siRNA的 最终浓度达到30nM或100nM。然后，在同样的条件下培养96小时后，使用市 售的试剂盒(Cell Proliferation Kit II，罗氏公司(Roche社)制)测定细 胞数。(3) 评价方法通过将添加10%麦芽糖的细胞的细胞数设为100%，比较添加各本发明 组合物的细胞的细胞数来进行评价。 (4)试验结果其结果如图6所示，可知使用实施例2、 4、 6的本发明载体对细胞的毒性与比较例l的载体同等程度。
权利要求
1. 以下述通式(I)表示的半乳糖衍生物；式(I)中，R1表示氢、可取代的碳数1～10的烷基或者1-(D)-脱氧乳糖-1-基，R2表示碳数10～30的饱和或不饱和的脂肪酸残基。
2. 如权利要求l所述的半乳糖衍生物，其特征在于，半乳糖衍生物为N-[1 - (D)-脱氧乳糖-l-基]油酰胺或N， N-二 [1- (D)-脱氧乳糖-1-基]油酰胺。
3. 药物载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的半乳糖衍生物和阳 离子性脂质作为必需的构成成分。4. 如权利要求3所述的药物载体，其特征在于，阳离子性脂质为2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油酰基甘油。5. 如权利要求3或4所述的药物载体，其特征在于，还将磷脂作为构成成分。6. 医药组合物，其特征在于，包含药物和权利要求3 5中的任一项所述 的药物载体。7. 如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，药物为双链RNA、双 链DNA、低聚核酸或水溶性阴离子化合物。8. 如权利要求7所述的医药组合物，其特征在于，低聚核酸为短干扰RNA、 微脂A、短发卡RNA、反义DNA、反义RNA、 DNA酶、核酶、适体、非编码RNA。9. 如权利要求6 8中的任一项所述的医药组合物，其特征在于，用于 癌症的治疗和/或预防。10. 如权利要求6 8中的任一项所述的医药组合物，其特征在于，用于 病毒性疾病的治疗和/或预防。
11. 如权利要求6 8中的任一项所述的医药组合物，其特征在于，用于炎症性疾病的治疗和/或预防。12. 如权利要求6 8中的任一项所述的医药组合物，其特征在于，用于 代谢性疾病的治疗和/或预防。13. 如权利要求6 8中的任一项所述的医药组合物，其特征在于，用于 神经疾病的治疗和/或预防。全文摘要
本发明的目的在于提供可以实现对肝脏的指向性的提高和高效的药效发挥作为药物载体的构成成分的新型有用的半乳糖衍生物、含有该衍生物的药物载体以及包含该载体和药物的医药组合物。本发明涉及以上述通式(I)表示的半乳糖衍生物、含有该衍生物和阳离子性脂质的药物载体以及包含该载体和优选双链RNA、双链DNA、低聚核酸的药物的医药组合物。式(I)中，R¹表示氢、可取代的碳数1～10的烷基或者1-(D)-脱氧乳糖-1-基。R²表示碳数10～30的饱和或不饱和的脂肪酸残基。
文档编号A61K47/26GK101395168SQ20078000734
公开日2009年3月25日 申请日期2007年2月28日 优先权日2006年3月1日
发明者上田稔浩, 园家晓, 大木忠明 申请人:日本新药株式会社