纳米酶、制备纳米酶的方法、以及使用纳米酶的方法

纳米酶、制备纳米酶的方法、以及使用纳米酶的方法
【专利摘要】本公开内容的实施方案提供了具有核/壳纳米颗粒的纳米酶、中空纳米酶、包含治疗剂的中空纳米酶、制备纳米酶的方法、使用纳米酶的方法等。
【专利说明】纳米酶、制备纳米酶的方法、以及使用纳米酶的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2013年8月14日提交的、具有序列号61/865，650的、标题为aNANOZYMES, METHODS OF MAKING NANOZYMES, AND METHODS OF USING NANOZYMES”的共同未决的美国临时申请的优先权，该美国临时申请通过引用并入本文。
[0003]背景
[0004]至今，酶已被广泛应用于医药中。大多数酶被细胞外使用，用于局部应用(例如，胶原酶)、毒性物质的去除(例如，硫氰酸生成酶)、以及血液循环系统内的紊乱(例如，尿激酶)。另外，酶在癌症的治疗中具有主要的潜在应用，例如，淋巴细胞性白血病的治疗中的天冬酰胺酶(asparagenase)。然而，医药中的酶应用受到很多局限性的限制并具有很多局限性。因此，存在克服与酶相关的局限性的需求。
[0005]概述
[0006]本公开内容的实施方案包括具有核/壳纳米颗粒的纳米酶(nanozyme)、中空纳米酶、包含治疗剂的中空纳米酶、制备纳米酶的方法、使用纳米酶的方法，等等。
[0007]纳米酶的一个示例性实施方案，除了其他的以外，包括:核/壳纳米颗粒、酶、和识别部分，酶和识别部分各自附着至纳米颗粒的表面，其中纳米颗粒是Fe3O4Au核/壳纳米颗粒。在一个实施方案中，酶不与附着至核/壳纳米颗粒的识别部分和保护部分发生反应。在一个实施方案中，纳米酶可包括保护部分，其中保护部分附着至核/壳纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米酶可包括治疗剂。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒的Fe3O4可起显像剂的作用。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒的金可起光热治疗剂(photothermal therapyagent)的作用。在一个实施方案中，纳米酶可包括附着至核/壳纳米颗粒的细胞间和细胞内的运输引导部分(traffic guiding moiety)。在一个实施方案中，纳米酶可包括附着至核/壳纳米颗粒的变构官能部分。
[0008]中空纳米酶的一个示例性实施方案，除了其他的以外，包括:围绕中空的核(hollow core)的聚合物层，其中聚合物层包括酶、识别部分、和保护部分，其中酶、识别部分、和保护部分各自在聚合物层的外表面上，其中中空的核具有约Inm至5000nm的直径。在一个实施方案中，聚合物层包括穿过聚合物层的多个孔。在一个实施方案中，中空纳米酶可包括配置在中空核中的治疗剂。
[0009]形成中空纳米酶的方法的一个示例性实施方案，除了其他的以外，包括:提供具有纳米颗粒核的纳米酶，其中酶、识别部分、和保护部分附着至纳米颗粒核的表面；由以下的一种或更多种的部分形成聚合物层:酶、识别部分、和保护部分，其中聚合物层在以下的一种或更多种的一端形成:酶、识别部分、和保护部分，使得聚合物层围绕纳米颗粒核；以及去除纳米颗粒核，保留围绕中空的核的聚合物层。
[0010]装载中空纳米酶的方法的一个示例性实施方案，除了其他的以外，包括:提供中空纳米酶，其中中空纳米酶包括围绕中空的核的聚合物层，其中聚合物层包括酶和识别部分，其中酶和识别部分各自在聚合物层的外表面上，其中聚合物层包括多个孔，其中中空的核具有约Inm至5000nm的直径；将治疗剂通过聚合物层的孔配置入中空纳米酶中；以及将保护部分配置在聚合物层上，其中保护部分基本上封闭孔使得治疗剂不会退出孔。
[0011]施用治疗剂的方法的一个示例性实施方案，除了其他的以外，包括:向具有状况的受试者施用中空纳米酶，其中中空纳米酶包括围绕中空的核的聚合物层，其中聚合物层包括酶、识别部分、和保护部分，其中酶、识别部分、和保护部分各自在聚合物层的外表面上，其中中空的核具有约Inm至5000nm的直径，其中将治疗剂配置在中空的核中，其中治疗剂以药学上有效量存在以治疗状况，其中中空纳米酶在聚合物层中具有孔，其中由于基本上封闭孔的聚合物层上的保护部分，治疗剂不会通过孔逃逸；其中中空纳米酶进入受试者的细胞，其中在进入细胞后，保护部分从聚合物层上释放并将治疗剂释放进入细胞。在一个实施方案中，待治疗的状况可包括病毒性疾病和癌症治疗，特别是HBV、HCV和HPV疾病，和肝癌。
[0012]附图简述
[0013]本公开内容的许多方面可参考以下附图被更好地理解。附图中的组分不一定按比例绘制，而将重点放在清楚地说明本公开内容的原理上。此外，在附图中，相似的参考数字指示贯穿数个图的相应部分。
[0014]图1A示出了用于在Fe3O4纳米颗粒上的两步生长金壳(gold shell)的方案:(1)薄金壳在氯仿中的生长，以及(2)较厚的金壳在水溶液中的生长。图1B示出了 10-nm Fe3O4纳米颗粒的典型的TEM图像。图1C示出了所得的具有2.5nm的壳厚度的Fe304/Au核/壳纳米颗粒的典型的TEM图像。
[0015]图2示出了制备包含纳米酶的Fe3O4Au的方案:(I)装载核糖核酸酶，⑵用ss-DNA寡核苷酸的混合物表面官能化，且ss-DNA寡核苷酸使用PEG间隔物与AS1411和TSLlla的DNA适体交联，以及(3)用PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)共聚物表面官能化。
[0016]图3示出了用于从核糖核酸酶官能化的金纳米颗粒合成中空纳米酶的方案:步骤1:用烧基硫醇-封端的、炔丙基修饰的ss-DNA寡核苷酸的混合物的表面官能化，且ss-DNA寡核苷酸使用PEG间隔物与AS1411和TSLlla的DNA适体交联。对于步骤I’，将血清白蛋白与ss-DNA寡核苷酸共官能化。步骤2和2’:将金纳米颗粒的表面上的炔丙基基团交联。步骤3和3’:使用KCN溶液去除金纳米颗粒支架。
[0017]图4示出了用于通过琥泊酰亚胺基-6-肼基烟酰胺(succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide)交联RNA酶和琥?白酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(succinimidyl-4-formylbenzamide) DNA 寡核苷酸的不意图。
[0018]图5示出了用PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)共聚物表面官能化DNA-RNA酶中空纳米结构，产生“成熟的”纳米酶。
[0019]图6Α和6Β示出了用乙酸双氧铀负染色的“成熟的”中空纳米酶的透射电子显微镜图像。
[0020]图7示出了用于制备装载有索拉非尼的纳米酶的方案:(I)将索拉非尼装载进纳米酶中，以及⑵用PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)共聚物表面官能化，产生“成熟的”纳米酶。
[0021]详述
[0022]在本公开内容被更详细描述之前，应当理解，本公开内容不限于描述的特定实施方案，因为此特定实施方案当然可发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本公开内容的范围将仅由所附的权利要求来限定。
[0023]在提供数值范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一(除非上下文另有明确规定)，以及任何其他所述或在所述范围内的中间值，都包括在本公开内容之内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在较小范围内并且也被包括在本公开内容内，并满足所述范围内任何特定排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值时，排除那些包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本公开内谷内。
[0024]除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。现描述优选的方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可被用于实践或测试本公开内容。
[0025]如对本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将明显的是，本文所述和所示的单个实施方案的每一个都具有离散的组分和特征，其可与任何其他数个实施方案的特征容易地分离或组合，而不偏离本公开内容的范围或精神。任何列举的方法都可以以列举的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
[0026]除非另有指明，本公开内容的实施方案将采用成像、化学、合成有机化学、生物化学、生物学、分子生物学、微生物学等的技术，其在本领域的技术范围内。这些技术在文献中被充分说明。
[0027]阐述以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行本文公开和要求保护的方法以及使用本文公开和要求保护的组合物和化合物的完整的公开内容和描述。已作出努力以确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应予以考虑一些误差和偏差。除非另有指明，份数是按重量计算的份数，温度以。C计，并且压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力被定义为20°c和I个大气压。
[0028]在本公开内容的实施方案被详细描述之前，应当理解，除非另有指明，本公开内容不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造工艺等，因为这些可发生改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制。步骤可以以逻辑上可能的不同顺序被执行，这在本公开内容中也是可能的。
[0029]必须指明的是，除非上下文另有明确规定，如在说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the) ”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个支持体”包括多个支持体。除非相反意图是明显的，在本说明书和随后的权利要求中，将提及一些术语，其应被定义具有以下含义。
[0030]定义
[0031]在描述和要求保护公开的主题中，以下术语将根据下面阐述的定义来使用。
[0032]除非另有定义，本文使用的所有本领域的术语、符号和其他科学术语旨在具有本公开内容所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文被定义以为了清楚起见和/或为了及时参考，并且此类定义在本文的包括不应必然地被解释为表示实质上不同于本领域通常理解的术语的含义。本文描述或参考的技术和程序通常被本领域技术人员良好理解并由本领域技术人员使用常规方法学被通常采用。除非另有说明，如果适当的话，涉及使用商购可得的试剂盒和试剂的程序通常根据制造商确定的方案和/或参数来进行。
[0033]“施用”意指将本公开内容的纳米酶引入受试者。可使用任何施用途径，诸如静脉内、口服、局部、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻、引入脑脊液、或滴注入身体隔室(body compartment)。
[0034]如本文使用的，术语“受试者”或“患者”包括人、哺乳动物(例如猫、狗、马等)、家禽等。本公开内容的实施方案可施用至其的典型的受试者将是哺乳动物，特别是灵长类，尤其是人。对于兽医应用，各种各样的受试者将是合适的，例如家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及家养动物特别是宠物诸如狗和猫。对于诊断或研宄应用，各种各样的哺乳动物将是合适的受试者，包括啮齿类(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类和猪诸如近交的猪(inbred pig)等。此外，对于体外应用，诸如体外诊断和研宄应用，上述受试者的体液和细胞样品将是适于使用的，诸如哺乳动物(特别是灵长类诸如人)的血液、尿液或组织样品、或关于兽医应用中提到的动物的血液、尿液、或组织样品。术语“活的受试者”是指活着的以上指出的受试者。术语“活的受试者”是指整个受试者，并不仅仅是从活的受试者切除的部分(例如，肝或其他器官)。
[0035]术语“样品”可指组织样品、细胞样品、液体样品等。样品可取自受试者。组织样品可包括毛发(包括根部)、口腔拭样、血液、唾液、精液、肌肉、或来自任何内脏器官。液体可以是，但不限于，尿液、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身体组织可包括，但不限于，皮肤、肌肉、子宫内膜、子宫、和宫颈组织。在本公开内容中，样品的来源不是关键。
[0036]术语“可检测的”是指相对于背景信号检测信号的能力。
[0037]术语“可检测的信号”是源自非侵入性成像技术，诸如，但不限于，磁共振成像(MRI)或基于纳米酶的结构的其他适当的设备的信号。可检测的信号是可检测的并与可由受试者产生的其他背景信号是可区分的。换言之，在可检测信号和背景之间存在可测量的且统计学上显著的差异(例如，统计学上显著的差异是足够区分可检测的信号和背景的差异，诸如，视情况而定，可检测的信号和背景之间的约1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、或40%、或更多的差异)。标准和/或校准曲线可被用于确定声学可检测的信号和/或背景的相对强度。
[0038]如本文使用的，术语“单位剂型”是指适合作为用于人和/或动物受试者的单一剂量的物理上不连续的单位，每一单位都包含计算的以足够产生期望的效果的量的预定量的化合物(例如，纳米酶中使用的治疗剂，如本文所述)与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物的联合。用于单位剂型的规格取决于采用的特定化合物、施用的途径和频率、和待实现的效果、以及与受试者中每一化合物相关的药效学。
[0039]术语“治疗有效量”和“有效量”在本文可互换使用并且是指待施用的足以产生预期的应用，包括但不限于状况或疾病治疗的治疗剂或包含治疗剂的纳米酶的量。例如，有效量的治疗剂在某种程度上将减轻疾病的一个或更多个症状，即，在某种程度上，减轻状况或疾病的一个或更多个症状。治疗有效量可取决于预期的应用(体外或体内)、或待治疗的受试者和状况例如受试者的体重和年龄、状况的严重程度、施用的方式等而不同，其可由本领域普通技术人员容易地确定。术语还适用于将引起靶细胞或组织中特定反应的剂量。具体剂量将取决于所选的特定治疗剂、遵循的给药方案、其是否与其他剂组合施用、施用的时间选择、所施用的细胞或组织、以及其中其携带的物理递送系统而不同。
[0040]总体讨论
[0041]本公开内容的实施方案提供了具有核/壳纳米颗粒的纳米酶、中空纳米酶、包含治疗剂的中空纳米酶、制备纳米酶的方法、使用纳米酶的方法等。本公开内容的一个或更多个实施方案可以是有利的，因为其相对于基于其他酶的产品，可被设计为是选择性的、可不产生引起免疫应答、可具有延长的寿命、可持续更长的时间段是稳定的、和/或可递送治疗剂。本公开内容的实施方案可被用于成像、检测、研宄、监测(例如，存活)、评价和/或使用纳米酶或中空纳米酶的实施方案治疗状况诸如疾病。本公开内容的实施方案可被用于治疗病毒性疾病以及用于癌症治疗，特别是HBV、HCV和HPV疾病，和肝癌。另外的详细内容在实施例中描述。
[0042]一般而言，本文描述了纳米酶的三个实施方案，其中每个都可包括许多变化。示例性实施方案包括具有核/壳纳米颗粒诸如Fe3O4Au纳米颗粒支架的核/壳纳米酶。在一个实施方案中，Fe304/Au纳米颗粒的超顺磁特性使得使用磁共振成像(MRI)体内追踪相应纳米酶成为可能。此外，本公开内容的实施方案连同纳米酶的其他性能可被用于光热治疗(例如，通过金壳)和磁共振成像(例如，铁核(iron core))。
[0043]另一个示例性实施方案包括不包含无机纳米颗粒(例如，其中纳米颗粒本来将被定位的中空的区域或核)的中空纳米酶。在一个实施方案中，中空纳米酶可包括用于成像的标记物(例如，染料标记物)。没有无机纳米颗粒的中空纳米酶显示出中空的核(其中纳米颗粒是先前存在的)，其中纳米颗粒的去除消除了可由无机纳米颗粒诱导的潜在的长期毒性。另外，标记有染料诸如荧光素的中空纳米酶，可使用荧光显微术进行追踪。
[0044]另一个示例性实施方案包括包含配置在中空纳米酶的中空区域内的治疗剂(例如，小分子药物)的中空纳米酶。装载了小分子药物的中空纳米酶预期具有增强的抗癌效力。
[0045]在一个实施方案中，核/壳纳米酶或中空纳米酶可包括两种或更多种类型的ss-DNA寡核苷酸，并且该设计允许纳米酶具有在不同位置处降解生存素的mRNA(或bcl2mRNA或其他mRNA)或这两种蛋白的mRNA的多靶向能力。
[0046]由于纳米酶(和中空纳米酶)的结构，其酶促活性和靶序列特异性可通过以下参数的一个或更多个的优化被最大化:纳米颗粒支架的尺寸、RNA核酸内切酶的密度和组成、ssDNA寡核苷酸的密度和/或序列和长度。本文描述的纳米酶的各种实施方案的细胞类型靶向特异性可通过基于DNA-适体的引导组分的密度和基于PEG的保护组分的密度来确定。纳米酶的内涵体逃逸能力(endosomal escape capability)取决于内涵体逃逸增强组分的密度和组成。另外，这些参数还在纳米酶细胞进入、稳定性和/或毒性的效力中起作用。
[0047]现在提及核/壳纳米颗粒，核/壳纳米颗粒纳米酶可包括纳米颗粒、酶、和识别部分。酶和识别部分各自附着(例如，直接地、通过接头(例如，化合物或蛋白)等间接地)至核/壳纳米颗粒纳米酶的表面的聚合物层或纳米颗粒。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒纳米酶可包括两种或更多种类型(例如，具有不同功能)的酶和/或识别部分。在一个实施方案中，纳米酶还可包括保护部分、细胞间和细胞内的运输引导部分、和/或变构官能部分。
[0048]在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒可作为用于其他组分附着的支架起作用。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒还可作为可检测的纳米颗粒(例如，具有或能够产生可检测的信号)起作用，该可检测的纳米颗粒可使用成像方法诸如MRI被检测，或作为用于疾病(例如，癌症)治疗的光热治疗剂起作用。在一个实施方案中，纳米颗粒包括核和配置在核上的壳。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒可包括Fe304/Au核/壳纳米颗粒、Fe2Mn04/Au核/壳纳米颗粒、Fe2ZnO4Au核/壳纳米颗粒、或FePt/Au核/壳纳米颗粒。
[0049]在一个实施方案中，可使纳米颗粒成各向同性形状，诸如球形、立方体、四面体、多面体，或成各向异性形状诸如纳米片、纳米棒、纳米线(nanowire)以及纳米棱柱(nanoprism)。在一个实施方案中，核/壳纳米颗粒的尺寸可为约Inm至510nmJt Inm至lOOOnm、或约Inm至500nm，以球形或近球形纳米颗粒的直径(或沿纳米颗粒的横截面的最长距离)计。在一个实施方案中，核可具有约1.0]11]1至20111]1或约20nm至5000nm的直径。在一个实施方案中，壳可具有约1.0nm至5.0nm或约5.0nm至10nm的厚度。
[0050]在一个实施方案中，酶可行使功能以对核苷酸(例如，DNA、RNA、或更小的核苷酸)或肽(例如，蛋白质)起作用。在一个实施方案中，酶功能包括水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、氧化、还原、核酸编辑、缩合，或用于DNA、RNA、蛋白、肽、寡糖、多糖、或小分子诸如神经元递质的其他类似的酶促修饰。在一个实施方案中，当附着至纳米颗粒(或中空纳米酶的聚合物层)时，酶不与识别部分和保护部分发生反应，或当附着至纳米颗粒(或中空纳米酶的聚合物层)时，基本上不与识别部分和保护部分发生反应(例如，可以以一定的速率与识别部分和/或保护部分发生反应，使得纳米酶可被用于实现期望的目标和/或执行纳米酶的期望的功能)。
[0051]在一个实施方案中，酶可包括核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、蛋白内切酶、或其组合。在一个实施方案中，核糖核酸内切酶可包括:RNA酶A、RNA酶II1、RNA酶H、RNA酶P、或RNA酶Tl。在一个实施方案中，脱氧核糖核酸内切酶可包括:脱氧核糖核酸酶11、脱氧核糖核酸酶IV、限制性内切酶和UvrABC核酸内切酶。在一个实施方案中，蛋白内切酶可包括:蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、和内肽酶V8。在一个实施方案中，纳米酶可包括附着至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层的I至200种酶。
[0052]在一个实施方案中，识别部分可起作用以使纳米酶(本文描述的任何纳米酶)与分子相互作用。在一个实施方案中，识别部分可具有对可与状况、疾病、或感兴趣的相关的生物事件相关的细胞、组织、蛋白、DNA、RNA、抗体、抗原等的亲和力。特别地，识别部分可起作用以靶向感兴趣的特定的DNA、RNA和/或蛋白。识别部分可包括，但不限于具有对以下的亲和力的多肽(例如，蛋白，诸如但不限于，抗体(单克隆或多克隆))、抗原、核酸(单体和寡聚的两者)、多糖、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、配体、适体、小分子、配体、或其组合:状况，疾病，或状况、疾病的相关的生物事件或其他化学、生物化学、和/或生物事件，或生物事件。在一个实施方案中，识别部分可包括:序列特异性DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、和肽核酸(PM)、抗体、和小分子蛋白受体。在一个实施方案中，纳米酶(本文描述的任何实施方案)可包括附着至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层的I至2000种识别部分。在一个实施方案中，识别部分还可包括保护部分、和/或细胞间和细胞内的运输引导部分的功能，使得识别部分具有多重(例如，三重)功能。本文描述了保护部分的功能。
[0053]在一个实施方案中，纳米酶(本文描述的任何实施方案)还可包括保护部分。保护部分可附着(例如，直接地、通过接头(例如，化合物或蛋白)、或纳米酶的聚合物层等间接地)至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层。在一个实施方案中，保护部分可起作用以控制细胞内的稳定性、分散性、细胞摄取效率和/或选择性细胞进入效率。可选地或另外地，保护部分可实质上减少(例如，相对于不包括保护基团，减少约70%或更多、约80%或更多、约90%或更多、约95%或更多、或约99%或更多)或消除纳米酶的毒性和/或实质上减少(例如，相对于不包括保护基团，减少约70 %或更多、约80 %或更多、约90 %或更多、约95 %或更多、或约99%或更多)或消除纳米酶的免疫原性，或其组合。在一个实施方案中，保护部分可减少(例如，相对于不包括保护基团，减少约70%或更多、约80%或更多、约90%或更多、约95%或更多、或约99%或更多)或消除非靶分子靠近纳米酶的酶，并且可保护纳米酶的酶部分免于酶(例如，蛋白酶)的降解。
[0054]在一个实施方案中，保护部分可包括:DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、聚丙烯酰胺、多肽、聚-N-取代的甘氨酸寡聚物(类多肽(polypeptoid))、透明质酸(HA)、藻酸盐/醋、壳聚糖、琼脂糖、胶原、纤维蛋白、明胶、葡聚糖、及其任何组合，以及这些配体各自的衍生物等。在一个实施方案中，纳米酶(本文描述的任何纳米酶)可包括附着至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层的I至2000种保护部分。在一个实施方案中，纳米酶可包括两种或更多种类型(例如，具有不同功能)的酶、保护部分、和/或识别部分。
[0055]在一个实施方案中，细胞间和细胞内的运输引导部分可将纳米酶(本文描述的任何纳米酶)引导进入特定器官(诸如肝)、细胞类型(诸如肝细胞)、亚细胞细胞器、和细胞核。细胞间和细胞内的运输引导部分可附着(例如，直接地、通过接头(例如，化合物或蛋白)或纳米酶的聚合物层等间接地)至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层。在一个实施方案中，细胞间和细胞内的运输引导部分可包括DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、环糊精、聚合物、TransFectin，及其任何组合，以及这些配体各自的衍生物等。在一个实施方案中，纳米酶可包括附着至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层的I至2000种细胞间和细胞内的运输引导部分。在一个实施方案中，纳米酶可包括两种或更多种类型(例如，具有不同功能)的酶、保护部分、和/或识别部分、和/或细胞间和细胞内的运输引导部分。
[0056]另外，变构官能部分也可附着至纳米酶。变构官能部分可附着(例如，直接地、通过接头(例如，化合物或蛋白)或纳米酶的聚合物层等间接地)至纳米颗粒或中空纳米酶的聚合物层。变构官能部分使纳米酶具有响应于选择的变构效应物诸如疾病相关的代谢通路中的特定产物或副产物(例如，葡萄糖)的开启/关闭转换成为可能。在一个实施方案中，变构官能部分可包括DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、肽、蛋白、糖、脂质、小分子受体诸如生物素、环糊精、聚合物、TransFectin、及其组合，以及这些部分各自的衍生物等。
[0057]除了酶、识别部分、保护部分、和/或细胞间和细胞内的运输引导部分之外，纳米酶可包括可被用于治疗感兴趣的疾病或状况的治疗剂诸如药物，所述治疗剂附着至纳米酶的表面。
[0058]在一个实施方案中，中空纳米酶可包括围绕中空的核的聚合物层。聚合物层的一个实施方案可包括和/或其上附着(例如，直接地或间接地)酶和识别部分。在一个实施方案中，酶和识别部分各自附着(例如，直接地、通过接头(例如，化合物或蛋白)等间接地)至聚合物层。在一个实施方案中，中空纳米酶可包括两种或更多种类型(例如，具有不同功能)的酶和/或识别部分。在一个实施方案中，中空纳米酶还可包括保护部分、细胞间和细胞内的运输引导部分、和/或变构官能部分，其中各自可单独地附着(例如，直接地或间接地)至聚合物层。关于中空纳米酶描述的各个部分与以上关于核/壳纳米颗粒纳米酶的描述的那些是相同的或类似的。
[0059]在一个实施方案中，由聚合物层界定的中空的核可具有约Inm至5000nm、约Inm至lOOOnm、或约Inm至500nm的尺寸，以球形或近球形的纳米颗粒的直径(或沿纳米颗粒的横截面的最长距离)计。在一个实施方案中，聚合物层可具有约I至50的厚度。
[0060]在一个实施方案中，聚合物层可通过交联以下的一种或更多种形成:酶、识别部分、和保护部分、或纳米酶的其他部分。在一个实施方案中，交联可在以下的一端或靠近一端处发生:酶、识别部分、保护部分、或其他部分，使得中空的核区域由聚合物层围绕。在一个实施方案中，聚合物层可由以下组成:聚炔、聚烯烃、聚异戊二烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚硅酮、这些的共聚物、这些的组合等。在一个实施方案中，聚烯烃的前体(例如，炔烃)可以是以下的一种或更多种的官能团的一部分:酶、识别部分、保护部分、或其他部分，其中将前体配置在或靠近最接近中空区域(或在中空区域之前的纳米颗粒)的一端。在一个实施方案中，酶、识别部分、保护部分、或其他部分的一种或更多种可在聚合物层形成后或形成过程中分别附着至聚合物层。
[0061]在一个实施方案中，聚合物层包括穿过聚合物层的多个孔。孔可具有约0.2nm至1nm或5nm至200nm的直径。孔径可相同或不同。
[0062]在一个实施方案中，显像剂可附着至中空纳米酶。在一个实施方案中，显像剂可包括染料、金属氧化物纳米颗粒、金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒量子点、和金刚石纳米颗粒。在一个实施方案中，显像剂可附着(例如，直接地或间接地)至中空纳米酶或在中空的核内。合适的检测系统可被用于检测或成像纳米酶。
[0063]如以上提及的，可将治疗剂配置在中空的核中。如本文更详细地描述的，可通过孔将治疗剂配置在中空的核中。然后，部分诸如保护部分可被用于基本上防止或防止治疗剂从中空的核释放，直到与状况或疾病所涉及的靶细胞相互作用为止。
[0064]在一个实施方案中，包括在中空的核中的治疗剂的量可以是约I至115个分子。然而，量可基于中空的核的尺寸、待治疗的状况或疾病、中空纳米酶上存在的其他部分(在某些情况下，治疗剂和部分可协同起作用)等被调整。
[0065]在一个实施方案中，治疗剂可以是小分子药物、基于肽的药物、基于蛋白的药物诸如干扰素、基于核酸的药物诸如短干扰RNA、和聚合物药物偶联物等。
[0066]在一个实施方案中，中空纳米酶可由具有纳米颗粒的纳米酶制成。在一个实施方案中，纳米酶包括可被去除以产生中空的核的纳米颗粒核。在一个实施方案中，纳米颗粒可包括金属(例如，金和银)、金属氧化物(例如，氧化铁和氧化锌)、或半导体(例如，CdSe和InP)。
[0067]在一个实施方案中，方法包括具有纳米颗粒核的纳米酶，其中酶、识别部分、和保护部分、以及本文讨论的其他可能的部分(例如，保护部分、细胞间和细胞内的运输引导部分、和/或变构官能部分)附着(例如，各自独立地，直接或间接地)至纳米颗粒核的表面。聚合物层可由以下的一种或更多种的部分来形成:酶、识别部分、保护部分等。在一个实施方案中，聚合物层可在以下的一端或靠近一端处形成:酶、识别部分、保护部分等，使得聚合物层围绕纳米颗粒核。关于聚合物层的另外的详细内容在以上描述。形成聚合物层后，纳米颗粒核可被去除，留下围绕中空的核的聚合物层。
[0068]在一个实施方案中，纳米酶可包括孔形成部分。在一个实施方案中，在形成聚合物层之前，将孔形成部分配置在纳米颗粒的表面(以下描述)。聚合物层可围绕孔形成部分形成，使得去除孔形成部分后，孔穿过聚合物层而形成。在一个实施方案中，孔形成部分可通过去除纳米颗粒被去除。在一个实施方案中，孔形成部分可独立于纳米颗粒的去除被去除。在一个实施方案中，孔形成部分可包括蛋白、聚合物、纳米颗粒、胶束、脂质体、及其组合。在一个实施方案中，可将约I个至5000个孔形成部分配置在纳米颗粒的表面。
[0069]在一个实施方案中，中空纳米酶可通过在包含治疗剂的溶液中处理包括孔的中空纳米酶来装载。在一个实施方案中，治疗剂可通过孔被配置(例如，流)入中空区域。治疗剂在中空纳米酶的中空区域内之后，可将保护部分配置到聚合物层上。保护部分基本上封闭孔使得治疗剂不退出孔。在一个实施方案中，当中空纳米酶进入感兴趣的细胞后，可去除保护部分，并且当去除保护部分后，治疗剂被释放进入细胞。在一个实施方案中，保护部分可在出现在某些类型的细胞(例如，癌细胞)、病毒(例如，HCV)等的周围的某些剂的存在(例如，由其产生)下被去除。
[0070]如以上提到的，中空纳米酶可包括显像剂，使得中空纳米酶的位置可被确定。
[0071]试剂盒
[0072]本公开内容包括试剂盒，其包括，但不限于，纳米酶、和说明书(关于其使用的书面说明)。纳米酶的组分可根据特定疾病、状况或甚至待研宄和/或治疗的特定疾病、状况来定制。试剂盒还可包括用于向宿主细胞或宿主生物体施用以上所列的组分的各种组合的本领域已知的适当的缓冲液和试剂。
实施例
[0073]现在已描述了本公开内容的实施方案，一般而言，实施例描述了一些另外的实施方案。虽然本公开内容的实施方案连同实施例和相应文字和附图被描述，但没有任何意图将本公开内容的实施方案限于这些描述。相反，意图是覆盖包括在本公开内容的实施方案的精神和范围内的所有替代形式、变化形式、以及等同物。
[0074]实施例:
[0075]实施例1.Fe3O4Au核/壳纳米颗粒的合成。
[0076]Fe3O4Au核/壳纳米颗粒展现出核的超顺磁特性、Au壳的表面等离子共振吸收、和Au壳的表面官能化化学。这些纳米颗粒具有低毒性，并且其是用于MRI的T2造影剂和用于透射电子显微镜(TEM)的造影剂。Fe3O4纳米颗粒核可通过油酸铁在从约280°C至340°C范围的高温下的热分解合成，并且我们的初步研宄显示，所得铁氧化物纳米颗粒的尺寸通过反应温度容易决定。1
[0077]金外壳在两步法中生长(图1)。在第一步骤中，薄壳(?Inm)于50°C下在含油胺的氯仿溶液中生长在Fe3O4纳米颗粒核上。AuCl 3被用作金前体且油胺被用作还原剂和加帽配体。使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和柠檬酸钠将所得纳米颗粒转移进水溶液中。在第二步骤中，HAuCl4被用作前体且抗坏血酸被用作还原剂。这些结果显示，两步法允许均匀的金壳生长直至20nm厚。有趣的是，水溶性核/壳纳米颗粒可在0.03M NaCl的存在下形成有序的单层(图1C)。在本研宄中，由于其超顺磁特性，我们选择了小于14nm的Fe3O4纳米颗粒核，并且我们已合成了具有6nm至45nm范围尺寸的Fe3O4Au核/壳纳米颗粒用于纳米酶的优化。每个步骤的产物使用各种技术包括UV-Vis吸收法、动态光散射、TEM,、X-射线衍射(XRD)、和超导量子干涉仪(SQUID)被充分鉴定。
[0078]实施例2.包含FeWiZAu纳米颗粒的纳米酶的合成。
[0079]纳米酶可通过Fe304/Au纳米颗粒的三步表面官能化合成:(i)用RNA核酸内切酶官能化，(ii)用具有一种或更多种RNA识别序列和包含适体的链的烷基硫醇封端的ssDNA寡核苷酸的混合物官能化，以及(iii)用PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)的共聚物作为用于保护和内涵体逃逸增强两者的组分官能化(图2)。我们选择RNA酶A或RNA酶A和RNA酶H的混合物用于纳米颗粒修饰，并且这些酶通过非特异性相互作用结合至Fe3O4Au纳米颗粒的金表面。2
[0080]在第二步骤中，烷基硫醇-封端的ssDNA寡核苷酸可使用金-硫醇结合化学被官能化至纳米颗粒。ssDNA寡核苷酸的序列根据存活素和bcl 2的mRNA的反义序列来选择。特别地，我们根据以下设计了用于制备纳米酶的烷基硫醇官能化的寡核苷酸的序列:存活素 mRNA 的两个反义序列(1)5，TGTAGAGATGCGGTGGTCC3 ’ (SEQ ID No:1)和
(2)5’GATGGCACGGCGCACTTTC3，，(SEQ ID No:2)和 bcl 2mRNA 的两个反义序列:(1)5，GGTCTGCAGCGGCGAGGTCCTG3’ (SEQ ID No:3)和(2)5’GTCTGCAGCGGCGAGGTCCTG3’ (SEQ ID No:4)。另外，AS1411和TSLlla适体可用PEG间隔物在这些烷基硫醇官能化的寡核苷酸的5’端处进行交联(图2)。这些交联的分子用来自Glen Research, Inc的商业化试剂使用DNA合成仪合成。调整装载至纳米颗粒的交联的分子的数目和这些分子中PEG间隔物的数目以改进纳米酶的稳定性和细胞类型靶向特异性。
[0081]此外，纳米酶上的寡核苷酸密度在合成中被控制，并且使用文献方法定量测量。2通常，寡核苷酸的密度应足够高，以阻断酶接近非互补的ssRNA，然而，如果密度过高，寡核苷酸也可阻断酶接近互补的ssRNA并降低纳米酶的纳米酶活性。此外，主要的技术困难是从纳米酶样品中去除未结合的RNA。这些未结合的酶显著干扰纳米酶的酶促活性和靶特异性的体外测试。在初步研宄中，我们已建立了克服该困难的程序。该程序包括使用亲和层析和多重离心的分离。
[0082]在第三步骤中，甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)共聚物被官能化至纳米颗粒的表面，产生“成熟的”纳米酶。这些共聚物通过带正电荷的聚赖氨酸结构域和带负电荷的寡核苷酸之间的静电相互作用结合至纳米颗粒的表面。这些共聚物的一些是从公司诸如Alamanda Polymers, Inc商购可得的。我们已调整了共聚物中L-赖氨酸单元重复的数目以优化纳米酶的内涵体逃逸能力和结构稳定性，并已调整了乙二醇重复单元的数目以最小化纳米酶的非特异性结合水平并最大化其在生物环境中的稳定性。
_3] 实施例3.没有无机纳米颗粒核的中空纳米酶的合成。
[0084]无机纳米颗粒核的去除可有效地消除由核引起的纳米酶的潜在的长期毒性，并创建用于装载和递送用于癌症治疗的小分子药物(诸如索拉非尼)的腔。为了制备核可去除的纳米酶，我们修饰了 RNA核酸内切酶和识别ss-DNA寡核苷酸:用炔丙基醚基团修饰烧基硫醇封端的聚胸腺哺唆(T)喊基的序列，所述块丙基酿基团通过氣基己基丙稀基氣基(amidohexylacrylamido)接头连接至T碱基的5位置，和随后是用于灵活性和剩余部分的可及性的六个未修饰的T碱基的间隔物。具有单个烷基硫醇封端的、炔丙基醚修饰的聚胸腺嘧啶⑴序列的RNA核酸内切酶，使用来自Solulink，Inc的标准蛋白-寡核苷酸缀合试剂盒合成，并使用凝胶电泳进行纯化(图4)。
[0085]已合成了两种类型的中空纳米酶:具有连续壳的中空纳米酶(图3(上图))和具有多孔壳的中空纳米酶(图3(底部))。合成以烷基硫醇封端的和炔丙基-醚-修饰的RNA核酸内切酶通过金/硫醇连接化学反应的表面修饰开始。纯化后，将所得纳米颗粒在以下三个步骤中进一步处理以产生中空纳米结构(图3)。
[0086]在第一步骤中，将RNA酶修饰的金纳米颗粒用包含炔丙基醚的烷基硫醇-封端的寡核苷酸通过金/硫醇连接化学反应官能化，或对于可装载并递送小分子药物的具有多孔壳的中空纳米酶，用特定蛋白(例如，人血清白蛋白)共官能化。蛋白用作“造孔剂”;其通过非特异性相互作用结合至金纳米颗粒的表面，在金纳米颗粒表面创建没有烷基硫醇-封端的、炔丙基醚修饰的聚胸腺嘧啶(T)序列的区域，导致具有多孔壳的中空纳米酶的形成(图3)。孔径通过造孔蛋白分子的大小控制。
[0087]在第二步骤中，在室温以磷酸盐缓冲盐水(0.15M)温育期间，在金纳米颗粒的表面和沿着修饰的T碱基的炔丙基基团之间发生交联，在金纳米颗粒的表面产生密集包裹的、交联的DNA壳。在第三步骤中，用KCN水溶液(IyM)去除金纳米颗粒支架3，并将所得中空纳米结构通过多重离心分离来纯化。由于血清白蛋白随着金纳米颗粒支架的去除，在最初步骤用血清白蛋白官能化制成的中空纳米结构预期在DNA壳上具有孔(图3)。所得纳米结构的结构稳定性已通过微调纳米颗粒表面的炔丙基-醚修饰的聚胸腺嘧啶(T)序列的密度被优化。原则上，没有无机纳米颗粒支架的这些中空纳米结构，应展现出更多的结构灵活性，并且因此，我们将期望，与包含无机纳米颗粒支架的那些纳米结构相比，这些纳米结构可具有针对RNA靶的高的酶促活性。酶促活性和靶特异性通过体外和体内测试进行评价。
[0088]无孔的中空纳米结构用甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)聚合物进一步官能化，产生“成熟的”纳米酶(图5、图6)。用于制备这些纳米酶的寡核苷酸可在使用荧光素亚磷酰胺的固态DNA合成期间用荧光素修饰。因此，这些所得纳米酶可被用于用内涵体标记染料使用荧光显微术评价其内涵体逃逸能力。
[0089]另外，我们已确定具有表面孔的中空纳米结构用于装载小分子药物(诸如抗癌、抗病毒和抗细菌药物，图7)的能力。由于索拉非尼对肝癌细胞的已知的抗癌效应，我们选择索拉非尼作为模型。原则上，索拉非尼以氢键键合和π -31相互作用结合至纳米酶的密集包裹的和交联的胸腺嘧啶区域，并因此索拉非尼可被装载进纳米酶的腔。由于氢键键合和31-31相互作用是非常弱的分子间相互作用，装载的索拉非尼可从纳米酶中释放。由于纳米酶的RNA降解功能，我们预期将需要非常低剂量的索拉非尼以在体外和体内产生针对肝癌细胞的强效抗癌效应。索拉非尼释放是由于在内涵体逃逸期间，甲氧基-PEG-嵌段-聚(L-赖氨酸氢溴酸盐)聚合物从纳米酶的松开。此外，索拉非尼装载能力和释放速率取决于pH，其中索拉非尼是在高pH(例如，8.5)下装载，并在低pH(例如，6.0)下释放，该低pH是内涵体pH。索拉非尼载量能力和释放速率作为pH的函数，使用基于光谱学的测定法进行评价。
[0090]实施例4.测试纳米酶的活性和特异性。
[0091]我们已使用了包含Fe3O4Au的纳米酶评价并优化酶促活性和靶向特异性。首先，纳米酶的活性和特异性使用在一端包含荧光团且在另一端包含猝灭剂的特异性RNA分子信标来测量。被纳米酶裂解后，荧光团与猝灭剂分开，并发出被荧光计检测到的强的荧光。来自这些分子信标实验的结果被用作改进纳米酶的设计和合成的初步指导。第二，纳米酶的活性和特异性使用体外转录的HCV或存活素RNA作为底物以及体外转录的宿主管家基因GADPH作为对照被进一步确定。电泳和Northern印迹被用于量化纳米酶活性和特异性。这些结果被用作改进纳米酶的结构设计和合成的最初反馈。
[0092]参考文献
[0093]1.Lynch, J.；Zhuang, J.；ffang, T.；LaMontagne, D.；ffu, H.；Cao, Y.C.“Gas-BubbleEffects on the Format1n of Colloidal Iron Oxide Nanocrystals,，，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12664-12674.
[0094]2.Wang, Z.；Liu, H ；Yang, S.H ；ffang, T.；Liu, C.；Cao, Y.C.“Nanoparticle-basedArtificial RNA Silencing Machinery for Antiviral Therapy.”Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences, 2012, 109, 12387-12392.
[0095]3.Cutler, J.1.；Zhang, K.；Zheng, D.；Auyeung, E.；Prigodich, A.E.；Mirkin, C.A.“Polyvalent Nucleic Acid Nanostructures, ’，，”J.Am.Chem.Soc.2011, 133, 9254-9257.
[0096]应当注意，比率、浓度、量和其他数值数据可在本文中以范围格式来表示。应当理解，这样的范围格式被用于方便和简洁的目的，并且因此，应当以灵活的方式解释为不仅包括明确列举的作为范围限值的数值，而且还包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地列举一样。举例来说，“约0.1%至约5%”的浓度范围应当解释为不仅包括约0.1被％至约5wt%的明确列举的浓度，而且还包括指示的范围之内的单独浓度(例如，1%、2%、3%、和4% )和子范围(例如，0.5%，1.1%、2.2%,3.3%、和4.4%)。在一个实施方案中，术语“约”可根据数值的有效数字包括传统的舍入。另外，短语“约‘X’至‘Y’”包括“约‘X’至约‘Y’”。
[0097]应当强调的是，本公开内容的上述实施方案仅仅是实现本公开内容的原理的可能的实施例，并仅为了清楚理解本公开内容的原理而被阐述。可对本公开内容的上述实施方案做出许多变化和修改而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有这些修改和变化在此预期被包括在本公开内容的范围内。
【权利要求】
1.一种纳米酶，所述纳米酶包括: 核/壳纳米颗粒、酶、和识别部分，所述酶和所述识别部分各自附着至所述纳米颗粒的表面，其中所述纳米颗粒是Fe304/Au核/壳纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述酶不与附着至所述核/壳纳米颗粒的所述识别部分和所述保护部分发生反应。
3.如权利要求1所述的纳米酶，其中至少两种不同类型的酶附着至所述核/壳纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述酶选自由以下组成的组:核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、蛋白内切酶、及其组合。
5.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述酶具有选自由以下组成的组的功能:水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、氧化、还原、核酸编辑、和缩合。
6.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述识别部分选自由以下组成的组:序列特异性DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗体、和小分子蛋白受体。
7.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述识别部分具有选自由以下组成的组的功能:靶向DNA、靶向RNA、和靶向蛋白。
8.如权利要求1所述的纳米酶，所述纳米酶还包括保护部分，其中所述保护部分附着至所述核/壳纳米颗粒。
9.如权利要求8所述的纳米酶，其中所述保护部分选自由以下组成的组:DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(丙烯延胡索酸酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、聚丙烯酰胺、多肽、聚-N-取代的甘氨酸寡聚物(类多肽)、透明质酸(HA)、藻酸盐/酯、壳聚糖、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、葡聚糖、这些配体各自的衍生物、及其组合。
10.如权利要求9所述的纳米酶，其中所述酶选自由以下组成的组:核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、蛋白内切酶、及其组合；并且其中所述识别部分选自由以下组成的组:序列特异性DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗体、和小分子蛋白受体。
11.如权利要求9所述的纳米酶，其中所述保护部分具有选自由以下组成的组的功能:细胞摄取效率、选择性细胞进入效率、基本上无毒性、基本上无免疫原性、及其组合。
12.如权利要求1所述的纳米酶，所述纳米酶还包括治疗剂。
13.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述核/壳纳米颗粒的Fe304起显像剂的作用。
14.如权利要求1所述的纳米酶，其中所述核/壳纳米颗粒的金起光热治疗剂的作用。
15.如权利要求1所述的纳米酶，所述纳米酶还包括附着至所述核/壳纳米颗粒的细胞间和细胞内运输引导部分。
16.如权利要求1所述的纳米酶，所述纳米酶还包括附着至所述核/壳纳米颗粒的变构官能部分。
17.—种中空纳米酶，所述中空纳米酶包括: 围绕中空的核的聚合物层，其中所述聚合物层包括酶、识别部分、和保护部分，其中所述酶、所述识别部分、和所述保护部分各自在所述聚合物层的外表面上，其中所述中空的核具有约Inm至5000nm的直径。
18.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述聚合物层包括穿过所述聚合物层的多个孔。
19.如权利要求18所述的中空纳米酶，其中所述孔的直径为约0.2nm至200nm。
20.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述聚合物层由以下的一种或更多种的交联形成:所述酶、所述识别部分、和所述保护部分，其中所述交联在以下的一种或更多种的一端发生:所述酶、所述识别部分、和所述保护部分，使得所述中空的核区域被所述聚合物层围绕。
21.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述聚合物层为聚烯烃。
22.如权利要求17所述的中空纳米酶，所述中空纳米酶还包括配置在所述中空的核中的治疗剂。
23.如权利要求22所述的中空纳米酶，其中所述治疗剂是小分子药物。
24.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中至少两种不同类型的酶附着至所述聚合物层O
25.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述酶选自由以下组成的组:核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸内切酶、蛋白内切酶、及其组合。
26.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述酶具有选自由以下组成的组的功能:水解、甲基化、去甲基化、磷酸化、氧化、还原、核酸编辑、和缩合。
27.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述识别部分选自由以下组成的组:序列特异性DNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、抗体、和小分子蛋白受体。
28.如权利要求17所述的中空纳米酶，其中所述识别部分具有选自由以下组成的组的功能:革巴向DNA、靶向RNA、和靶向蛋白。
29.—种形成中空纳米酶的方法，所述方法包括: 提供具有纳米颗粒核的纳米酶，其中酶、识别部分、和保护部分附着至所述纳米颗粒核的表面； 由以下的一种或更多种的部分形成聚合物层:所述酶、所述识别部分、和所述保护部分，其中所述聚合物层在以下的一种或更多种的一端形成:所述酶、所述识别部分、和所述保护部分，使得所述聚合物层围绕所述纳米颗粒核；以及 去除所述纳米颗粒核，保留围绕中空的核的所述聚合物层。
30.如权利要求29所述的方法，其中形成所述聚合物层包括交联以下的一种或更多种:所述酶、所述识别部分、和所述保护部分。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述纳米酶包括配置在所述纳米颗粒表面的孔形成部分。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述孔形成部分选自由以下组成的组:蛋白、聚合物、纳米颗粒、胶束、脂质体、及其组合。
33.如权利要求31所述的方法，其中去除包括去除所述孔形成部分以在所述聚合物层中形成孔。
34.一种装载中空纳米酶的方法，所述方法包括: 提供中空纳米酶，其中所述中空纳米酶包括围绕中空的核的聚合物层，其中所述聚合物层包括酶和识别部分，其中所述酶和所述识别部分各自在所述聚合物层的外表面上，其中所述聚合物层包括多个孔，其中所述中空的核具有约Inm至5000nm的直径； 将治疗剂通过所述聚合物层的孔配置入所述中空纳米酶；以及将保护部分配置在所述聚合物层上，其中所述保护部分基本上封闭所述孔使得所述治疗剂不退出所述孔。
35.一种施用治疗剂的方法，所述方法包括: 向具有状况的受试者施用中空纳米酶，其中所述中空纳米酶包括围绕中空的核的聚合物层，其中所述聚合物层包括酶、识别部分、和保护部分，其中所述酶、所述识别部分、和所述保护部分各自在所述聚合物层的外表面上，其中所述中空的核具有约Inm至5000nm的直径，其中将治疗剂配置在所述中空的核中，其中所述治疗剂以药学上有效量存在以治疗所述状况，其中所述中空纳米酶在所述聚合物层中具有孔，其中由于基本上封闭所述孔的所述聚合物层上的所述保护部分，所述治疗剂不会通过所述孔逃逸； 其中所述中空纳米酶进入所述受试者的细胞，其中当进入所述细胞后所述保护部分从所述聚合物层释放，并且所述治疗剂被释放进入所述细胞。
【文档编号】A61K9/16GK104519875SQ201480000941
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】云伟·查尔斯·曹, 辰·刘 申请人:佛罗里达大学研究基金会公司