通过树突细胞脱唾液酸糖蛋白受体(dc-asgpr)结合抗原呈递细胞的活性剂的制作方法

专利名称：通过树突细胞脱唾液酸糖蛋白受体(dc-asgpr)结合抗原呈递细胞的活性剂的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及通过树突细胞脱唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)结合(engage) 抗原呈递细胞的活性剂(agent)领域。
背景技术：
不限制本发明的范围，对与抗原呈递相关的背景进行描述。树突细胞通过提供可溶性的细胞间信号然后病原体识别而在控制先天性和获得 性免疫之间的界面中起关键作用。树突细胞的这些功能极大地依赖于特定的表面受体“模 式识别受体”(PRR)，最显著的代表为toll样受体(TLR)和C型凝集素或凝集素样受体 (LLR)的表达(1-3)。在当前的范式中，TLR的主要作用在于提醒DC产生白细胞介素12(IL_12)和其他 炎症性细胞因子以起始免疫应答。C型LLR作为巨噬细胞和树突细胞中强大的抗原捕获和 摄取机制的组成部分起作用(1)。然而，与TLR相比，LLR可能具有更为广阔的生物学功能， 包括细胞迁移(4)、细胞间相互作用(5)丄1^具有这些多重功能可能是由于不同于111 丄1^ 能够识别自身和非自身的事实。LLR的复杂性，包括在免疫细胞中表达大量LLR的冗余性， 这些已经成为了解各个LLR的详细功能的主要障碍之一。此外，大部分这些受体的天然配 体仍然未被确定。虽然如此，最近研究的证据表明，在微生物感染过程中，LLR与TLR协作， 对激活免疫细胞产生作用(6-14)。Valladeau 等人(The Journal of Immunology，2001，167 :5767_5774)描述了一 种新LLR受体，位于未成熟的人树突细胞上，并且与肝脏脱唾液酸糖蛋白受体相关，其被证 明有效地介导细胞内吞作用。主要是在免疫组织中即在DC和粒细胞中而不是在T细胞、B 细胞或NK细胞或单核细胞中观察到DC-ASGPR mRNA。DC-ASGPR种类限于从CD34来源的祖 细胞获得的CD14来源的DC，而不是来自CDla来源的亚类。单核细胞来源的DC和扁桃体间 质型DC都表达DC-ASGPR蛋白，而郎格罕氏型细胞不表达该蛋白。此外，DC-ASGPR是未成 熟的特征，因为当CD40活化时不表达。与胞质内结构域中存在基于酪氨酸的双亮氨酸基序 一致，抗DC-ASGPR的mAb在37°C下迅速被DC内在化。最后，细胞内的DC-ASGPR位于初级 内体中，表明在配体内在化后，该受体再循环到细胞表面。这些发现确定了 DC-ASGPR/人巨 噬细胞凝集素是未成熟的DC的特征，作为对于DC专门Ag捕获功能来说重要的另一种凝集素。发明概述尽管已知DC-ASGPR能够指导替代抗原内在化入人DC中，但是本发明利用 DC-ASGPR的新生物学活性在免疫系统中产生特别期望的改变，一些改变与抗原摄取(例 如，疫苗接种)相关，另一些通过DC-ASGra效应分子独特的作用(单独地或者与其他免疫 调控分子一起)，这些效应分子能够通过DC、B细胞和单核细胞上的该受体引发信号传导。 本发明公开了开发能够激活携带DC-ASGPR的细胞的独特的活性剂的方法，以及公开了在 接受这些信号作用的细胞中产生的变化对免疫系统中的其他细胞所产生的作用。这些作用(或者单独地，或者与其他信号一同(即共刺激))高度预测特定疾病状态的治疗效果或者 与疫苗接种相关的加强保护的效果。本发明包括用于增加表达DC-ASGPR的抗原呈递细胞抗原呈递效力的组合物和方 法，通过分离和纯化DC-ASGPR特异性抗体或其片段进行，其中目标活性剂与所述DC-ASGPR 特异性抗体或其片段结合形成抗体_抗原复合物，其中所述活性剂通过已与所述抗原_活 性剂复合物接触的例如树突细胞加工和呈递。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细 胞，DC-ASGI3R特异性抗体或其片段与Coherin/Dockerin对的一半结合。DC-ASGI3R特异性 抗体或其片段还可以与Coherin/Dockerin对的一半结合，而抗原与Coherin/Dockerin对 的互补性一半(complementary half)结合，形成复合物。非限制性的示例活性剂包括一种 或多种肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸以及它们的组合。所述活性剂可以是一种或多种细胞因子，所述细胞因子选自白细胞介素，转化生 长因子(TGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子 (EGF)，结缔组织激活肽(CTAP)，成骨因子，以及这些生长因子的生物学活性类似物、片段和 衍生物，B细胞/T细胞分化因子，B细胞/T细胞生长因子，促有丝分裂细胞因子，趋化细胞 因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-α，IFN-β，IFN- y , ILl, IL2，IL3，IL4，IL5，IL6， IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 等，瘦素(Ieptin), 肌肉生长抑制素(myostatin)，巨噬细胞刺激蛋白、血小板衍生生长因子，TNF-α，TNF-β， NGF，CD40L，CD137L/4_1BBL，人淋巴毒素- β , G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-I α，ILl-β， IP-10, PF4，GR0，9E3，促红细胞生成素，内皮抑素(endostatin)，血管抑素(angiostatin)， VEGF，包括转化生长因子β (例如TGF-β l、TGF-i3 2、TGF-i3 3)在内的转化生长因子(TGF) 超基因家族；骨形态发生蛋白(例如 BMP-1，BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8，BMP-9)；肝素结合生长因子(成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)，血小 板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGF))；抑制素(例如抑制素A、抑制素B)；生 长分化因子(例如GDF-1)；以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。在另一个实 施方案中，该活性剂包括抗原，该抗原是细菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生动物蛋白或癌 蛋白。本发明还包括用于增加树突细胞抗原呈递效力的组合物和方法，包括结合 DC-ASGPR特异性抗体或其片段，其中抗原与该DC-ASGPR特异性抗体或其片段结合形成抗 体-抗原复合物，其中该抗原通过已与该抗体-抗原复合物接触的树突细胞加工并呈递。另 一个实施方案是针对DC-ASGPR的抗体或其它特异性结合分子用于将抗原递送至抗原呈递 细胞以实现引起保护性或治疗性免疫应答目的的用途。对DC-ASGra特异的抗原靶向性试 剂用于通过皮肤进行疫苗接种的用途；对DC-ASGra特异的抗原靶向性试剂与共给药或连 接的佐剂联合使用用于疫苗接种，或者能够作为重组抗原-抗体融合蛋白表达的特定抗原 用于抗原靶向(疫苗接种)目的的用途。另一个实施方案包括通过以下用于增加树突细胞效力的方法分离患者的树突 细胞；使所述树突细胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗体或其片段和抗原，形成负载抗原 的活化树突细胞；和将该负载抗原的活化树突细胞再引入患者中。抗原可以是细菌蛋 白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生动物蛋白或癌蛋白。本发明还包括由哺乳动物细胞分泌的 抗DC-ASGPR的免疫球蛋白或其部分以及与该免疫球蛋白结合的抗原。该免疫球蛋白与cohesin/dockerin结构域的一半结合，或者其还可以包括与同模块式rAb载体形成复合 物的抗原结合的cohesin-dockerin结合对的互补性一半，或者与抗原形成融合蛋白的 cohesin-dockerin结合对的互补性一半。抗原特异性结构域可以是全长抗体、抗体可变 区结构域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fabc片段和/或具有Fc结构域部 分的Fab片段。抗DC-ASGPR的免疫球蛋白还可以与毒素结合，其中该毒素选自放射性同 位素、金属、酶、肉毒杆菌毒素、破伤风、蓖麻毒素、霍乱、白喉、黄曲霉毒素、产气荚膜梭菌 (perfringens)毒素、真菌毒素、志贺菌毒素、葡萄球菌肠毒素B、T2、seguitoxin、蛤蛘毒 素、才目JS豆毒素、cyanoginosin、α毒素、 可月豕毒素、aconotoxin、蛇毒禾口_虫朱毒。抗原可以 是与免疫球蛋白构成的融合蛋白，或者是化学共价结合的或不是化学共价结合的。本发明还包括通过以下用于增加树突细胞效力的组合物和方法分离患者的树 突细胞；使所述树突细胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗体或其片段以及抗原，形成负载 抗原的活化树突细胞；将该负载抗原的活化树突细胞再引入患者中。该活性剂用于单独 或者与共激活剂一起结合DC-ASGPR以激活抗原呈递细胞用于治疗性或保护性应用，结合 DC-ASGPR和/或活化活性剂单独或者与共激活剂一起与抗原连接用于保护性或治疗性的 疫苗接种。另一种用途是开发能够结合和活化DC-ASGPR的特异性抗体V区序列，用作与毒 性剂连接的抗DC-ASGPR活性剂，用于在疾病的情况下的治疗性目的，这种疾病已知或者被 怀疑是由于经DC-ASGPR的免疫细胞的不适当激活而引起，以及用作含有DC-ASGI3R特异性 抗体或其片段的疫苗，其中抗原与该DC-ASGPR特异性抗体或其片段结合形成抗体_抗原复 合物，其中该抗原被已与该抗体_抗原复合物接触的树突细胞加工并呈递。附图的简要说明为了更完整地理解本发明的特点和优点，现参考发明详述以及附图，在附图中图IA至IE例示通过凝集素样受体DC-ASGra信号传导来激活DC，导致共刺激分 子以及细胞因子和趋化因子水平升高。图IA显示3天和6天的GM/IL-4DC用FITC标记的 山羊抗小鼠IgG染色，接着用小鼠单克隆抗人DC-ASGI3R抗体染色。图IB显示6天的GM/ IL-4DC在用抗DC-ASGPR或者对照mAb (l-2ug/ml)包被的平板中培养16_18h。细胞用荧光 染料标记的抗CD86和HLA-DR抗体染色。柱状图中的空白柱和黑色柱分别代表用同型对照 mAb和抗凝集素mAb激活的细胞。图IC显示6天的GM/IL-4DC在用mAb包被的平板中培养 12h，并进行RNA分离和Affymetrix基因芯片分析，如方法部分所述。将抗凝集素mAb刺激 的基因表达增加的倍数与用对照mAb刺激的DC中的基因表达水平进行比较。图ID显示来 自图IB所示试验的培养物上清液中的细胞因子和趋化因子，通过Luminex方法测量。图IE 显示6天的GM/IL-4DC在含有或不含有50ng/ml可溶性⑶40L下，在mAb包被的平板中培 养16-18h，然后用抗CD83抗体染色。来自图IE所示试验的上清液中的细胞因子和趋化因 子通过Luminex方法测量。所示结果代表使用来自不同正常供体的细胞的三个独立试验。图2A至2D显示在DC上表达的DC-ASGI3R导致增强的体液免疫应答。在用抗 DC-ASGPR或者对照mAb包被的96孔平板中，培养5 X IO3/孔6天的GM/IL-4DC 16_18h，然 后在20单位/mlIL-2和50nM CpG存在下，共培养经CFSE染色的1 X IO5自体CD19+B细胞。 图2A是用荧光标记的抗体染色的6天的细胞的FACS。将CD3+细胞和7-AAD+细胞作门去 除(gate out)。通过FACS分选仪纯化⑶38+和CFSE—细胞，进行吉姆萨染色。图2B是第 13天的培养物上清液，通过夹心ELISA分析IgM、IgG和IgM的总量。图IC显示用感染复数(moi)为5的热灭活流感病毒(PR8)脉冲刺激并用B细胞培养的DC。在第13天，分析培 养物上清液中的流感特异性免疫球蛋白(Ig)。图ID显示对用抗DC-ASGI3R或对照mAb培养 的DC染色用于细胞表面的APRIL表达，并分析上清液中的可溶性APRIL。图3A至3D显示B细胞上的细胞表面表达的DC-ASGPR导致B细胞活化和免疫球 蛋白的产生。图3A是来自血沉棕黄层的PBMC，用抗⑶19、抗⑶3和抗DC-ASGPR或者对照 mAb染色。对⑶19+和⑶3+细胞作门，通过流式细胞仪测量⑶19+B细胞上的分子表达水平。 图3B是来自血沉棕黄层的CD19+B细胞，其在用mAb包被的平板上培养12h，进行如方法部 分所述的RNA分离和Affymetrix基因芯片分析。将由抗DC-ASGPR mAb引起的基因表达倍 数增加与用对照mAb刺激的⑶19+B细胞中的基因表达水平进行比较。图3C显示在用mAb 包被的平板中培养16_18h的⑶19+B细胞，然后通过Luminex分析培养物上清液中的细胞因 子和趋化因子。图3D显示1 X IO5⑶19+B细胞，这些细胞在用mAb包被的平板中培养13天。 Ig总水平通过ELISA测量。数据代表使用来自三个不同的正常供体的细胞进行的两组重复 试验。图4A至4D显示纯化的同种异体T细胞的增殖被用对DC-ASGPR特异的mAb刺激 的DC显著地增强。图5显示某些抗DC-ASGPR mAb能够激活DC. GM_CSF/IL_4。DC用一组12种纯抗 ASGPR mAb中的一种培养24h。然后对细胞表面⑶86 (DC活化标记物)进行检测，并分析上 清液中的分泌细胞因子。来自抗ASGPR mAb组的三种mAb (36、38、43)激活DC。图6显示在DC-ASGPR rAb的情况下能够表达不同的抗原。可将这种抗DC-ASGPR rAb. Doc蛋白与任何cohesin融合蛋白简单地混合，组装成稳定的非共价的[rAb. DociCoh. 融合物]复合物，其作为rAb融合蛋白起作用。图 7-GM-CSF/IFNa DC (5，000/ 孔)负载了 IOnM 或 InM 的抗 DC-ASGP R. Doc Coh. Flu M1，或者 hIgG4. Doc:Coh. Flu Ml 复合物。在 6h 后，将自体 CD8+T 细胞(200，000/ 孔)添加到培养物中。在第8天，分析CD8+T细胞中的携带有对HLA-A201免疫显性肽 (immuno-dominant peptide)特异的TCR的细胞的扩增。内部方框指示四聚体特异性⑶8+T 细胞的百分比。图8例示不同抗体与猴ASGPR的之间的交叉反应性。发明详述尽管下文详细讨论本发明的各种实施方案的制造和使用，但是应当理解，本发明 提供了许多可应用的创造性设想，它们可以大量不同的特定方式具体实施。在此讨论的特 定实施方案仅仅是例示制造和使用本发明的特定方式，而不界定本发明的范围。为了便于理解本发明，下文对大量术语进行定义。本文定义的术语具有与本发明 相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语，如“一个”、“一种"和“该”等不意欲为 仅指单数实体，而是包括其中特定的例子可以用于例示的总体类别。本文的术语用于描述 本发明的特定实施方案，但是除了在权利要求书中进行概括之外，它们的使用不界定本发 明。树突细胞(DC)是在调节抗原特异性免疫性中起关键作用的抗原呈递细胞 (Mellman 禾口 Steinman 2001)，(Banchereau，Briere 等人，2000)，(Cella, Sallusto 等人， 1997)。DC捕获抗原，将它们加工成肽，再呈递给T细胞。因此，将抗原直接递送给DC是改良疫苗的焦点领域。一个这样的例子就是使用负载抗原的离体自体DC然后再将该DC重 新给予患者来开发基于DC的疫苗(Banchereau，Schuler-Thurner等人，2001)，(Steinman 和Dhodapkar 2001)。增加疫苗效力的另一种策略是将与针对内在化DC特异性受体的抗 体结合的抗原特异性靶向DC。重要的小鼠研究表明通过靶向DC进行疫苗接种的可能性。 在体内，用与卵清蛋白(OVA)偶联的抗LOX-ImAb靶向，通过向MHCI类途径的交叉呈递外源 性抗原，来诱导保护性的CD8+T细胞反应(Delneste，Magistrelli等人2002)。此外，与抗 DEC205mAb结合的OVA和⑶40L成熟刺激物联合体内增强DC的MHC I类限制性地呈递，并 导致持久形成效应分子记忆CD8+T细胞(Bonifaz，Bonnyay等人2004)。这两个研究都显 示显著的剂量节约(即，在极低抗原剂量下产生强大的免疫应答)，并且提示产生了比通常 用其他类型的OVA免疫更为广泛的反应。最近通过DEC205将HIV gag抗原靶向DC的研究 已经将这些构思扩展到临床相关的抗原，并证实抗原靶向DC的宗旨(tenent)-通过单次疫 苗接种显著的剂量节约的保护性反应，以及抗原特异性T细胞在CD8和CD4区室中的扩增 (Trumpfheller, Finke 等人 2006)。本发明提供以受控的多元方式将多种抗原或蛋白质(独立地从原发mAb开始工程 化、表达和纯化)与单个原发重组mAb复合。目前，有多种方法将位点特异性生物素化位点 工程化，以提供用于将不同蛋白质(工程化的各个分别与链霉抗生物素连接)添加到该一 个原发HlAb上。然而，本发明提供以固定的等摩尔比例和位置，将分别工程化的蛋白质的多 组合添加到原发mAb上。如在此所用，术语“模块式rAb载体”用于描述一种重组抗体系统，该系统被工程 化以提供以受控的模块式的方式将不同抗原、活化蛋白质或者其他抗体添加到单个重组单 克隆抗体(mAb)上。rAb可以是用常规杂交瘤技术、重组抗体展示制备的单克隆抗体，人源 化单克隆抗体等等。模块式rAb载体可用于，例如(通过抗内在化受体例如人树突细胞受 体的原发重组抗体)将多种抗原和/或抗原与活化细胞因子靶向至树突细胞(DC)。模块式 rAb载体还可以用于以受控的确定方式将两种不同的重组mAb首末相连。“模块式rAb载体”的抗原结合部分可以是一个或多个可变结构域，一个或多个可 变结构域和第一恒定结构域，Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段以及Fv片段，Fabc片段和 /或具有部分Fc结构域的Fab片段，其中关联模块式结合部分被添加到氨基酸序列上和/ 或与之结合。用于模块式rAb载体中的抗体可以是任何同种型或类别、亚类或者来自任何 来源(动物和/或重组体)。在一个非限制性例子中，将模块式rAb载体工程化为具有一个或多个模块式 cohesin-dockerin蛋白质结构域，用于制备在工程化的重组mAb情况下的特异且明确的蛋 白质复合物。mAb是融合蛋白质的一部分，该融合蛋白质包括一个或多个来自mAb的抗原结 合结构域的模块式cohesin-dockerin蛋白质结构域羧基。cohesin-dockerin蛋白质结构 域甚至可以在翻译后被连接，例如使用化学交联剂和/或二硫化键连接。术语“抗原”用于此是指能够在该抗原接受者中启动体液免疫应答和/或细胞免 疫应答的分子。在本发明中，抗原以两种不同含义使用作为抗体或者rAb的其他抗原识别 结构域的目标，或者作为一种分子，其作为模块式rAb载体的dockerin/cohesin分子补体 的一部分，被rAb携带到和/或进入细胞或目标。抗原通常是导致疾病的活性剂，对于该疾 病来说，疫苗接种是有效的治疗。当抗原被呈递在MHC上时，该肽通常为约8至约25个氨基
8酸。抗原包括任何类型生物分子，包括例如简单的中间代谢产物、糖、脂质和激素以及大分 子，如复合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白质。常见的抗原种类包括，但是不限于病毒抗原， 细菌抗原，真菌抗原，原生动物抗原和其他寄生虫抗原，肿瘤抗原，参与自体免疫性疾病、过 敏反应和移植排斥反应的抗原和其他多种抗原。模块式rAb载体能够运载多种活性剂，例如抗生素、抗感染药、抗病毒药、抗肿瘤 药、解热药、镇痛药、抗炎药、骨质疏松治疗剂、酶、细胞因子、抗凝血药、多糖、胶原、细胞以 及两种或多种前述活性剂的组合。用本发明方法递送的抗生素的例子包括而不限于四环 素、氨基糖苷类、青霉素、头孢菌素、磺胺类药物、氯霉素琥珀酸钠、红霉素、万古霉素、林可 霉素、氯林可霉素、制霉菌素、两性霉素B、金刚胺、碘苷、对氨基水杨酸、异烟胼、利福平、放 线菌素D、光辉霉素、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、长春碱、长春新碱、甲基苄胼、咪唑氨甲酰寸寸。用本发明递送的抗肿瘤药的例子包括，但是不限于阿霉素、柔红霉素、紫杉 醇，氨甲蝶呤等等。解热药和镇痛药的例子包括阿司匹林、美林(Motrin )、布洛芬 (Ibuprofen )、萘普生、醋氨酚等等。用本发明递送的抗炎药的例子包括，但是不限于NSAIDS、阿司匹林、甾族化合物、 地塞米松、氢化可的松、波尼松龙、双氯芬酸钠等等。用本发明递送的用于治疗骨质疏松的治疗剂和作用于骨和骨骼的其他因子的例 子包括，但是不限于钙，阿伦膦酸盐，骨GLa肽，甲状旁腺素及其活性片段，组蛋白H4相关骨 形成和增生肽及其突变体、衍生物和类似物。用本发明递送的酶和酶辅助因子的例子包括，但是不限于胰酶(pancrease)、 L-天冬酰胺酶、透明质酸酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、链激酶、尿激酶、胰酶制剂、胶原 酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、血纤维蛋白溶酶原、链激酶、腺苷酸环化酶、过氧化物歧化酶 (SOD)等等。用本发明递送的细胞因子的例子包括，但是不限于白细胞介素，转化生长因子 (TGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，结 缔组织激活肽(CTAP)，成骨因子，以及这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物。细 胞因子可以是B细胞/T细胞分化因子、B细胞/T细胞生长因子、促有丝分裂细胞因子、趋 化细胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、IFN-α、IFN-β、IFN- γ , ILU IL2、IL3、IL4、 IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、ILlU IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18 等、瘦素、、 肌肉生长抑制素、巨噬细胞刺激蛋白、血小板衍生生长因子、TNF-α、TNF-β、NGF,⑶40L、 CD137L/4-1BBL、人淋巴毒素- β、G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-I α、ILl-β、ΙΡ-10、 PF4、GR0、9E3、促红细胞生成素、内皮抑素1、血管抑素1、VEGF或者其任何片段或组合。其 他因子包括转化生长因子(TGF)超基因家族的成员，包括转化生长因子β (例如TGF-β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3)；骨形态发生蛋白(例如 ΒΜΡ-1、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、 ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8、ΒΜΡ-9)；肝素结合生长因子(例如、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因 子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF))；抑制素(例如抑制素Α、 抑制素B)；生长分化因子(例如GDF-1)；以及活化素(例如活化素Α、活化素B、活化素AB)。用本发明递送的生长因子的例子包括，但是不限于从天然或自然来源例如从哺乳 动物细胞分离的生长因子，或者可以通过合成制备例如通过DNA重组技术或者各种化学方
9法制备的生长因子。此外，可以使用这些因子的类似物、片段或者衍生物，只要它们表现天 然分子的至少一些生物学活性。例如，可以通过表达位点特异性突变或者其他遗传工程技 术改造的基因来制备类似物。用本发明递送的抗凝血药包括，但是不限于华法令、肝素，水蛭素等等。用本发明 递送的作用于免疫系统的因子的例子包括，但是不限于控制炎症和恶性赘生物的因子以及 攻击感染性微生物的因子，例如趋化肽和缓激肽。病毒抗原的例子包括，但是不限于，例如逆转录酶病毒抗原，如来自人免疫缺陷病 毒(HIV)抗原的逆转录酶病毒抗原，例如gag、pol和env基因的基因产物，Nef蛋白，反转 录酶和其他HIV成分；肝炎病毒抗原，例如乙肝病毒的S、M和L蛋白，乙肝病毒和其他肝炎 病毒的pre-S抗原，例如甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒的pre-S抗原，病毒成分例如丙肝 病毒RNA ；流感病毒抗原，例如血球凝集素和其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原，例如麻疹 病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；风疹病毒抗原，如蛋白El和E2以及其他的风疹病毒 成分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其他的轮状病毒成分；巨细胞病毒抗原，例如包膜糖蛋 白B和其他巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，例如RSV融合蛋白，M2蛋白和其他 呼吸道合胞病毒抗原成分；单纯疱疹病毒抗原，例如立即早期蛋白，糖蛋白D，以及其他单 纯疱疹病毒抗原成分；水痘带状疱疹病毒抗原，例如gpl、gpll以及其他的水痘带状疱疹病 毒抗原成分；日本脑炎病毒抗原，例如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80% Ε,以及其 他的日本脑炎病毒抗原成分；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病糖蛋白，狂犬病核蛋白以及其他 的狂犬病病毒抗原成分。关于其他的病毒抗原实例，参见Fundamental Virology，第二版， Fields, B. N.禾口 Knipe，D. M 编著(Raven Press, New York，1991)。可以使用本发明的rAb-DC/DC-抗原疫苗递送的抗原性靶标包括编码抗原例如编 码病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或者寄生虫抗原的基因。病毒包括微小核糖核酸病毒、冠 状病毒、囊膜病毒、棒状病毒、副粘病毒、正粘病毒，布尼亚病毒，沙粒病毒、呼肠孤病毒、逆 转录酶病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒以及海绵状病毒。其 他的病毒靶标包括流感、单纯疱疹病毒1和2、麻疹、登革热、天花、脊髓灰质炎或者HIV。病 原体包括锥虫、绦虫、蛔虫、蠕虫，疟疾。肿瘤标记物，例如胚胎抗原或前列腺特异性抗原可 以这种方式打靶。其他例子包括HIV env蛋白和乙肝表面抗原。按照本发明用于疫苗接 种目的的载体的给予要求载体结合的抗原是足够非免疫原性的，以使得转基因能够长期表 达，以期对此产生强烈的免疫应答。在某些情况下，对个体疫苗接种的需要仅是不经常的， 例如每年或者每两年一次，并提供对感染活性剂产生长期的免疫保护作用。在本发明中用 作载体并且最终用作抗原的生物体、过敏原和核酸和氨基酸序列的特定例子可以在美国专 利US6，541,011中找到，该专利的相关部分在此引入作为参考，特别地，可用于本发明的与 生物体以及特定序列相对应的表格。与在此公开的rAb疫苗一起使用的细菌抗原包括，但是不限于，例如细菌抗原，例 如百日咳毒素、丝状血球凝集素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶以及其他 百日咳细菌抗原成分；白喉细菌抗原，例如白喉毒素或类毒素以及其他白喉细菌抗原成分； 破伤风细菌抗原，例如破伤风毒素或类毒素以及其他破伤风细菌抗原成分；链球菌抗原，例 如M蛋白以及其他的链球菌抗原成分；革兰氏阴性杆菌细菌抗原，例如脂多糖以及其他的 革兰氏阴性细菌抗原成分，结核分枝杆菌细菌抗原，例如霉菌酸，热休克蛋白65 (HSP65)，30kDa主要分泌性蛋白，抗原85A以及其他的分枝杆菌抗原成分；幽门螺杆菌抗原成分；肺 炎球菌抗原，例如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖以及其他的肺炎球菌抗原成分；流感 嗜血杆菌细菌抗原，例如荚膜多糖以及其他的流感嗜血杆菌抗原成分；炭疽杆菌抗原，例如 炭疽保护性抗原以及其他的炭疽杆菌抗原成分；立克次体细菌抗原，例如rompA以及其他 的立克次体细菌抗原成分。本文描述的细菌抗原还包括任何其他的细菌、分枝杆菌、支原 体、里克次氏体或者衣原体的抗原。部分或者整个的病原体还可以是流感嗜血杆菌；镰状 疟原虫；脑膜炎奈瑟氏球菌；肺菌链球菌；淋病奈瑟氏菌；伤寒沙门氏菌血清型；志贺氏菌； 霍乱弧菌；登革热；脑炎；日本脑炎；莱姆病；鼠疫耶尔森氏菌；西尼罗河病毒；黄热病；兔 热病；肝炎(病毒性；细菌性)；RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV 1和HPIV 3 ；腺病毒；天花； 过敏物和癌症物质。用于本发明的组合物和方法中的真菌抗原包括，但是不限于，例如念珠菌属真菌 抗原成分；组织胞浆菌属真菌抗原，例如热休克蛋白60(HSP60)以及其他的组织胞浆菌属 真菌抗原成分；隐球菌真菌抗原，例如荚膜多糖以及其他的隐球菌真菌抗原成分；球孢子 菌真菌抗原，例如小球体(spherule)抗原以及其他的球孢子菌真菌抗原成分；以及癣真菌 抗原，例如发癣菌素以及其他的球孢子菌真菌抗原成分。原生动物和其他的寄生虫抗原的例子包括，但是不限于，例如恶性疟原虫抗原，例 如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，环子孢子抗原，配子母细胞/配子表面抗原，红内期 抗原pfl55/RESA以及其他的疟原虫抗原成分；弓形体属抗原，例如SAG-1、p30以及其他 的弓形体抗原成分；裂体吸虫抗原，例如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白，以及其他的血 吸虫抗原成分；利什曼原虫主要抗原以及其他的利什曼原虫抗原，例如gp63、磷脂聚糖及 其相关蛋白质，以及其他的利什曼原虫抗原成分；和克氏锥虫抗原，例如75-77kDa抗原、 56kDa抗原以及其他的锥虫抗原成分。用本发明的rAb靶向的抗原通常根据许多因素来选择，所述因素包括内在化的 可能性、免疫细胞特异性的水平、靶向的免疫细胞的类型、免疫细胞的成熟程度和/或活化 等。树突细胞的细胞表面标记物的例子包括，但是不限于MHC I类、MHC II类、B7-2、⑶18、 CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR 和 / 或 ASPGR 等等；在某些情况下，缺乏 CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD56 和 / 或 ⑶57。抗原呈递细胞的细胞表面标记物例子包括，但是不限于MHC I类、MHC II类、⑶40、 CD45、B7-l、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-I和/或Fc γ受体。T细胞的细胞表面 标记物的例子包括，但是不限于 CD3、CD4、CD8、CD14、CD20、CDllb、CD16、CD45 和 HLA-DR。用于递送的细胞表面上的目标抗原包括肿瘤抗原特征性的那些抗原，其通常来自 肿瘤组织细胞的细胞表面、胞质、细胞核、细胞器等等。本发明的抗体部分的肿瘤靶标的例 子包括，但是不限于血液癌例如白血病和淋巴瘤，神经肿瘤例如星形细胞瘤或恶性胶质瘤， 黑色素瘤，乳癌，肺癌，头颈癌，胃肠肿瘤例如胃癌或结肠癌，肝癌，胰腺癌，泌尿生殖器肿瘤 如宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌或阴茎癌，骨肿瘤，血管肿瘤，或者唇、 鼻咽、咽和口腔，食道、直肠、胆囊、胆道系统、喉、肺和支气管、膀胱、肾脏、大脑以及神经系 统的其他部分、甲状腺的癌症，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤和白血病。可以用本发明单独或者联合地递送至免疫细胞用于抗原呈递的抗原例子包括肿 瘤蛋白质，例如突变的癌基因；肿瘤相关病毒蛋白，以及肿瘤粘蛋白和糖脂。抗原可以是肿瘤相关的病毒蛋白，其是来自上述病毒种类的蛋白质。某些抗原可以是肿瘤特征性的(一 个亚集，是通常不在肿瘤前体细胞中表达的蛋白质)，或者可以是通常在肿瘤前体细胞中表 达但是具有肿瘤特征性的突变的蛋白质。其他抗原包括具有改变的活性或亚细胞分布的正 常蛋白质的突变型变体，例如产生肿瘤抗原的基因突变。肿瘤抗原的特定非限制性例子包括CEA，前列腺特异性抗原(PSA)，HER-2/neu, BAGE，GAGE，MAGE 1-4,6 和 12，MUC(粘蛋白)(例如 MUC_1、MUC_2 等)，GM2 和 GD2 神经节苷 脂，ras，myc，酪氨酸酶，MART (黑色素瘤抗原)，Pmel 17 (gplOO)，GnT-V内含子V序列(N-乙 酰氨基葡糖转移酶V内含子V序列)，前列腺Ca psm, PRAME (黑色素瘤抗原)，β -连环蛋 白，MUM-I-B (黑色素瘤遍在突变基因产物)，GAGE (黑色素瘤抗原)1，BAGE (黑色素瘤抗 原)2-10，C-ERB2 (Her2/neu)，EBNA (EB 病毒细胞核抗原)1_6，gp75，人乳头瘤病毒(HPV) E6 和E7，p53，肺抗性蛋白(LRP)，Bcl-2和Ki-67。此外，免疫原性分子可以是参与自体免疫 性疾病的起始和/或进展的自体抗原，该疾病的病理学主要是由相关靶器官、组织或细胞 表达的分子的特异性抗体的活性引起，例如SLE或MG。在这些疾病中，可能期望将进行中 的针对相关自体抗原的抗体介导的(即Th2型)免疫应答引向细胞型(即Thl型)免疫应 答。或者，可能期望在没有感染但是疑似易感染相关自体免疫疾病的受试者中通过预防性 诱导针对适当的自体抗原的Thl反应来防止针对自体抗原的Th2反应的起始或者降低该反 应的水平。感兴趣的自体抗原包括，但不限于(a)关于SLE，Smith蛋白、RNP核蛋白、SS-A 和SS-B蛋白；以及(b)关于MG，乙酰胆碱受体。参与一类或多类自体免疫应答的其他各种 抗原的例子包括，例如内源性激素，例如黄体生成素、卵泡刺激素、睾丸激素、生长激素、催 乳素和其他激素。参与自体免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原可被在本发明的组合物和方法使 用，例如参与以下任何一种或多种自体免疫性疾病或障碍的抗原可被用于本发明中糖尿 病(diabetes、diabetes mellitus)，关节炎(包括风湿性关节炎、幼发型风湿性关节炎、 骨关节炎、银屑病关节炎)，多发性硬化，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自体免疫性甲状腺 炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)，银屑病，斯耶格伦氏综合征，包括继发于斯耶 格伦氏综合征的干燥性角膜结膜炎，斑秃，由于节肢动物叮咬而引起的过敏反应，克罗恩氏 病，口疮性溃疡，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性结肠炎，哮喘，过敏性哮喘，皮肤红斑 狼疮，硬皮病，阴道炎，直肠炎，药疹、麻风病逆向反应(1印rosy reversal reaction)，麻风 结节性红斑，自体免疫性葡萄膜炎，过敏性脑脊髓炎，急性坏死性出血性脑病，特发性双侧 进行性感觉神经性听力丧失，再生障碍性贫血，单纯性红细胞贫血，特发性血小板减少症， 多软骨炎，韦格纳氏肉芽肿，慢性活动性肝炎，斯_约二氏综合征，特发性口炎性腹泻，扁 平苔癣，克罗恩氏病，格雷夫斯眼病，结节病，原发性胆汁性肝硬化，后葡萄膜炎(uveitis posterior)，以及间质性肺纤维化。参与自体免疫性疾病的抗原例子包括谷氨酸脱羧酶 65 (GAD 65)、天然DNA、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体成分、甲状腺 球蛋白和促甲状腺激素(TSH)受体。参与过敏症的抗原例子包括花粉抗原，例如日本柳杉 花粉抗原、豚草属花粉抗原、黑麦草花粉抗原，动物来源的抗原，例如尘螨抗原和猫科抗原， 组织相容性抗原，和青霉素以及其他的治疗性药物。参与移植排斥反应的抗原例子包括移 植给移植接受者的移植物的抗原性成分，例如心脏、肺、肝、胰腺、肾脏和神经移植物成分。 抗原可以是用于治疗自体免疫性疾病的经改造的肽配体。
如在此所用，术语“表位”是指肽或蛋白质抗原，其包括一级结构、二级结构或三级 结构，这些结构与位于大量的由病原体DNA或RNA编码的病原体多肽的任何一种中的表位 类似。相似性的程度一般达到使得抗这种多肽的单克隆或多克隆抗体也结合、反应或者识 别该肽或蛋白质抗原。各种免疫测定方法可以与这种抗体联合使用，例如，蛋白质印迹法、 ELISA、RIA等等，这些方法全部都是本领域技术人员知晓的。确定可用作疫苗的病原体表位 和/或它们的功能性等价物也是本发明的一部分。一旦病原体表位被分离和确定，可以容 易地获得其功能性等价物。例如，可以采用美国专利US4，554，101中教导的Hopp方法，其 根据亲水性从氨基酸序列中鉴定和制备表位，该文献在此引入作为参考。在其他一些文献 中描述的方法以及基于这些方法的软件程序也可以用于确定表位核心序列(参见，例如， Jameson和Wolf，1988 ；Wolf等人，1988 ；美国专利US4，554，101)。然后，通过肽合成技术或 重组技术，可容易地将这些“表位核心序列”的氨基酸序列掺入肽中。可将包含编码本发明抗原的核酸作为活性成分的疫苗组合物制备成注射剂，为液 体溶液或者悬浮液；也可以制备成适合在注射前溶解或者悬浮在液体中的固体形式。可将 制剂乳化，包封在脂质体中。活性免疫原性成分通常与载体混合，该载体是药学上可接受的 并且与活性成分相容的。术语“药学上可接受的载体”是指不会在被给予的受试者中引发过敏反应或者 其他不期望作用的载体。合适的药学上可接受的载体包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐 水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合中的一种或多种。此外，如果期望，疫苗可含有少 量的辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂和/或增强疫苗效力的佐剂。可能有效 的佐剂的例子包括，但是不限于氢氧化铝，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰-nor-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺、MTP-PE和RIBI，RIBI含有 三种在2%鲨烯/Tween 80乳剂中的细菌提取成分，单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯以及 细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的其他例子包括DDA(溴化二甲基双十八烷基铵)、弗氏 完全佐剂和不完全佐剂以及QuilA。此外，免疫调节物，例如淋巴因子(例如IFN-γ、IL-2 和IL-12)或者合成的IFN-Y诱导剂，例如poly I C与本文描述的佐剂联合使用。如本发明中所述，药品以生理学上可接受的可给药形式包括具有单个或多个拷贝 的特定核苷酸序列的裸多核苷酸，该核苷酸序列与存在于血浆脂蛋白上的载脂蛋白的特定 DNA结合位点结合。多核苷酸可以编码生物活性肽、反义RNA或者核酶，并以生理学上可接 受的可给药形式提供。可来自本发明的另一种药品以生理学上可接受的可给药形式包括 高纯度的血浆脂蛋白部分和预先结合到纯化的脂蛋白部分的包含单个或多个拷贝的特定 核苷酸序列的多核苷酸，所述血浆脂蛋白部分按照本文描述的方法从患者血液或者其他来 源中分离，所述特定核苷酸序列与存在于血浆脂蛋白上的载脂蛋白的特定DNA结合位点结
I=I ο另一种药品以生理学上可接受的可给药形式包括高纯度的血浆脂蛋白部分，该血 浆脂蛋白部分含有包含单个或多个拷贝的特定DNA结合基序的重组载脂蛋白片段，其预先 与含有单个或多个拷贝的特定核苷酸序列的多核苷酸结合。还有一种药品以生理学上可接 受的可给药形式包括高纯度的血浆脂蛋白部分，该血浆脂蛋白部分含有包含单个或多个拷 贝的特定DNA结合基序的重组载脂蛋白片段，其预先与含有单个或多个拷贝的特定核苷酸 序列的多核苷酸结合。
给药剂量很大程度上取决于治疗的受试者的体重和身体健康状况，以及给药途径 和治疗频率。包含预先与高纯度的血浆脂蛋白部分结合的裸多核苷酸的药物组合物可以按 1 μ g-lmg多核苷酸和1 μ g-100mg蛋白质的量给予。向患者给予rAb以及rAb复合物遵循给予化学治疗剂的一般方案，如果载体存在 毒性的话，应考虑载体的毒性。可以想到按需要重复治疗循环。还还考虑，各种标准治疗方 法以及手术干预可以与所述基因治疗方法联合使用。在考虑基因治疗的临床应用时，需要制备复合物作为适合目的应用的药物组合 物。通常需要制备基本上不含有热原以及任何其他对人和动物会产生损害的杂质的药物组 合物。通常还期望使用合适的盐和缓冲液，以使得该复合物稳定和允许被靶细胞摄取。本发明的含水组合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在药学上可接受的 载体或含水介质中。这种组合物也被称作为接种物。这种介质和试剂用于药学活性物质的 应用是本领域熟知的。任何常规介质或试剂除非与活性成分不相容，否则其在治疗性组合 物中的使用被考虑。补充性活性成分也可以被添加到组合物中。本发明的组合物可以包括 典型的药学制剂。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体。在通常的 存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。疾病状态。根据要治疗的特定疾病，通过任何常规途径来给予本发明的治疗组合 物，只要通过该途径能够到达靶组织，使得将抗原最大化地递送到该位点，产生最大化(或 者在某些情况下最小化)的免疫应答。通常可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或者静 脉内注射进行给药。递送的其它部位包括口、鼻、颊、直肠、阴道或者局部。局部给药对于 治疗皮肤癌是特别有利的。这种组合物通常作为包含生理学上可接受的载体、缓冲液或者 其他赋形剂的药学上可接受的组合物被给予。本发明的疫苗或治疗组合物通过经注射肠胃外例如皮下或肌内给予。适合其他 给药方式的其他制剂包括栓剂，以及在一些情况下口服制剂或者适合分配的制剂如气雾 剂。在口服制剂的情况下，使用佐剂处理T细胞亚群、抗原包装或者将单独的细胞因子添 加到各种制剂中产生具有最优化免疫应答的改良口服疫苗。对于栓剂而言，常规的粘合剂 和载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇或者甘油三酯；这种栓剂可用含有0. 5 % -10 %，优选 1% 范围内的活性成分的混合物来制备。口服制剂包含通常使用的赋形剂，例如，药用 级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物的形式可以 是溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂或者粉剂，并且含10% -95%的活性成分，优选 25-70% ο将本发明的编码抗原的核酸作为中性的或盐的形式配制入疫苗或者治疗组合物 中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，其为与无机酸例如盐酸或者 磷酸，或者与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可 以来自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异 丙胺、三甲胺、2-氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。疫苗或治疗组合物以与制剂相容的方式给予，并且以预防和/或治疗有效的量给 予。要给予的量取决于要治疗的受试者，包括例如受试者的免疫系统对合成抗体的容量，以 及期望达到的保护或治疗程度。适合的剂量范围为每次疫苗接种为几百微克级的活性成 分，范围为约0. lmg-lOOOmg，例如范围为约lmg_300mg，优选范围为约10mg_50mg。合适的首次给予和强化注射的方案也是变化的，但是通常为首次给予后，接着接种或者进行其他 给予。活性成分给予所要求的精确含量取决于医师的判断，并且可能为各个受试者所特有。 对于本领域技术人员来说，本发明的核酸分子或者融合多肽的治疗有效量尤其取决于给药 方案，给予的抗原的单位剂量，核酸分子或融合多肽是否与其他治疗剂联合给药，以及接受 者的免疫状况和健康状况，核酸分子或融合多肽的治疗活性。组合物可以以单剂量方案或多剂量方案方式给予。多剂量方案是这样的一种方 案，其中初始疫苗接种时程包括例如1-10个单独剂量，在维持和/或加强免疫应答所需的 随后时间段内给予其他剂量，例如，在1-4月给予第二剂量，并且如果需要，在数个月后再 给后续剂量。需要间隔为1-5年，通常为3年的定期加强来使保护性免疫保持在期望水平 上。在免疫接种后，对与ESAT6或ST-CF共培养的外周血淋巴细胞(PBL)进行体外增殖测 定，测量从致敏的淋巴细胞中释放的INF-Y的水平。可以使用常规的标记物例如放射性 同位素、酶、荧光标记物等进行测定。这些技术是本领域技术人员知晓的，并可在美国专利 US3, 791，932，US4, 174，384和US3, 949，064中找到，这些文献的相关部分引入作为参考。模块式rAb载体和/或结合的rAb载体(cohesion/dockerin和/或 dockerin-cohesin)-抗原复合物(rAb_DC/DC_抗原疫苗)可在一个或多个“单位剂量”中 提供，这取决于是否使用核酸载体，最终的纯化蛋白或者使用的最终疫苗的形式。单位剂 量定义为含有计算以产生与治疗组合物给药即适当的途径和治疗方案相关的期望反应的 预定量的治疗组合物。给药量和特定给药途径和制剂在临床领域技术人员技术能力的范 围内。还可以对要治疗的受试者进行评估，特别是受试者免疫系统状态和期望的保护作 用。单位剂量不必以单次注射给药，而是可以包括在设定的一段时间内的连续输注。本发 明的单位剂量以DNA/kg(或者蛋白质/Kg)体重方便地描述，给药范围约0.05、0. 10,0. 15、 0. 20,0. 25,0. 5、1、10、50、100、1，000或者更多mg/DNA或蛋白质/kg体重。同样地，递送的 rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以在约0. 2-8. 0mg/kg体重的范围变化。因此，在特定实施方 案中，可以将 0. 4mg、0. 5mg、0. 8mg、L 0mg、L 5mg>2. 0mg>2. 5mg>3. 0mg>4. 0mg>5. 0mg>5. 5mg、 6. 0mg、6. 5mg、7. Omg和7. 5mg疫苗体内递送给个体。rAb-DC/DC-抗原疫苗的给药剂量在 很大程度上取决于所治疗的受试者的体重和身体状况，以及给药途径和治疗频率。包含预 先结合到脂质体或病毒递送载体上的裸多核苷酸的药物组合物可以以从ι μ g-lmg多核苷 酸到Iyg-IOOmg蛋白质的量范围给予。因此，特定组合物可以包括约1 μ g、5y g、10y g、 20μ g、30y g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、100y g、150y g、200y g、250y g、500y g、 600 μ g、700 μ g、800 μ g、900 μ g或1，000 μ g之间的多核苷酸或蛋白质、该多核苷酸或蛋白 质独立地与 1μ g、5y g、10y g、20y g、3. ομ g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、100y g、 150 μ g、200y g、250 y g、500y g、600y g、700y g、800y g、900y g、lmg、l. 5mg、5mg、10mg、 20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 或 IOOmg 载体结合。在体外细胞系统中测试本发明，该体外细胞系统测量被Flu抗原靶向的树突细胞 对人Flu特异性T细胞的免疫刺激作用。本文所示的结果证明在该系统中，在单独无效的 抗原剂量下这些抗原特异性细胞的特异性扩增。本发明还可以用于制备模块式rAb载体，该模块式rAb载体是例如与来自蓖麻毒 素、炭疽热毒素和葡萄球菌B肠毒素的保护性抗原复合的重组人源化mAb (针对特定的人树 突细胞受体)。这种实体的潜在市场是对全体军事人员的疫苗接种，以及储备待用以满足大
15人口中心应对与这些活性剂相关的任何生物威胁的存储疫苗。总体而言，本发明可广泛应 用于疫苗设计，包括人和动物用途的疫苗。感兴趣的产业包括制药和生物技术行业。本发明包括组合物和方法，包括疫苗，其特异性地将抗原靶向(递送)至抗原呈递 细胞(APC)，以引发有效而广泛的针对该抗原的免疫应答。这些组合物引起针对产生该抗原 的活性剂(病原体或癌症)的保护性或治疗性免疫应答。此外，本发明产生活性剂，所述活 性剂直接或者与其他活性剂一起通过特异性结合在抗原呈递细胞上表达的所谓DC-ASGPR 受体产生治疗作用。新的重组人源化mAb (针对特定的人树突细胞受体DC-ASGPR)通过抗体(Ab)重链 与已知抗原或者怀疑编码保护性抗原的物质融合。作为用于抵抗各种活性剂的疫苗接种的 例子包括来自流感H5m的血球凝集素；来自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B肠毒素的 减弱毒素的HIV gag;来自melanona抗原的抗原性肽“链”(string)等。本发明可作为处 于危险中或者被感染的患者的预防性或治疗性的疫苗接种。本发明可广泛用于抵抗许多疾 病和癌症的疫苗接种，包括人和动物的用途。可以使用本发明的工业包括药学和生物技术 领域。本发明可用于将抗原靶向APC用于疫苗接种目的。不知晓哪种抗原内在化受体最 适合于该目的。本发明描述了 DC-ASGH 用于该目的的特别有利的特点。此外，本发明表明， 结合DC-ASGPR在具有高度预期的显著治疗益处的激活免疫系统意义上可能是有益的。本发明包括开发抗人DC-ASGPR的高亲和性单克隆抗体。分别制备受体胞外结构 域.hlgG(人IgGlFc)和AP(人胎盘碱性磷酸酶)融合蛋白，用于免疫小鼠和筛选mAb。先 前已经描述一种hDCIR胞外结构域.IgG的表达构建体(Bates，Fournier等人1999)，并用 小鼠SLAM(mSLAM)信号肽引导分泌(Bendtsen, Nielsen等人2004)。用PCR扩增AP残基 133-1581 (gb IBC009647 I)同时添加近端读框内Xho I位点和远端TGA终止密码子和Not I位点来制备hDCIR胞外结构域.AP的表达载体。该Xho I-Not I片段替换上述hDCIR胞 外结构域.IgG载体中的IgG编码序列。在相同的Ig和AP载体系列中的DC-ASGPR胞外结 构域构建体中含有编码(bp 484-1251，gi I 53832017)的插入物。使用FreeStyle 293表 达系统(Invitrogen)，按照厂商的操作流程(Img总质粒DNA用1. 3ml 293Fectin试剂/L 转染)，制备DC-ASGI3R融合蛋白质。对于rAb的制备来说，用等量的编码H链和L链的载 体共转染。将被转染的细胞培养3天，收集培养物上清液，加入新鲜的培养液，继续培养2 天。通过过滤，使合并的上清液澄清。通过HiTrap蛋白A亲和层析，用0. IM pH2. 7甘氨酸 洗脱，并用PBS透析，纯化受体胞外结构域.hlgG。使用HiTrapMabSelect 柱类似地纯化 rAb (后面描述的重组抗体)。用常规的细胞融合技术来制备小鼠mAb。简而言之，6周龄的 BALB/c小鼠用20 μ g添加Ribi佐剂的受体胞外结构域.hlgGFc融合蛋白进行腹膜内免疫， 在10天和15天后用20yg抗原加强免疫。3个月后，在取出脾脏的3天前，再次对小鼠加 强免疫。或者，在30-40天的周期内，以每3-4天的间隔，在小鼠足垫中注射于Ribi佐剂中 的I-IOyg抗原。在最后加强免疫后的3-4天，收集引流淋巴结。用常规技术，将来自脾脏 和淋巴结细胞的B细胞与SP2/0-Ag 14细胞(Shulman，Wilde等人，1978)融合。用ELISA， 对照单独的融合伴侣或者与AP融合的受体胞外结构域区，从杂交瘤上清液中筛选受体胞 外结构域融合蛋白(Bates，Fournier等人1999)。然后，在FACS中，用瞬时转染编码全长 受体cDNA的表达质粒的293F细胞筛选阳性孔。被选的杂交瘤是在CELLine瓶(Intergra)中克隆和扩增的单个细胞。杂交瘤上清液与等体积的1.5M甘氨酸、3M NaClUxPBS,pH 7.8 混合，并与MabSelect树脂混合。用结合缓冲液洗涤树脂，并用0. 1M甘氨酸，pH 2. 7洗脱。 接着用2M Tris中和，用PBS透析mAb。通过直接ELISA表征所纯化的抗DC-ASGPR单克隆抗体。通过ELISA确定几种抗 DC-ASGPR mAb的相对亲和力(即将DC-ASGPR. Ig蛋白质固定在微量平板的表面上，并以剂 量滴度系列测试抗体与DC-ASGPR. Ig的结合能力(通过抗小鼠IgG. HRP结合试剂检测)。在 该实例中，PAB42和PAB44显示比其他mAb具有更高的亲和结合力。这些mAb不能显著地结 合已经结合在微量平板表面上的人Ig。这表明，mAb与DC-ASGPR. Ig融合蛋白的DC-ASGPR 胞外结构域部分发生反应(数据未给出)。通过间接ELISA表征所纯化的抗DC-ASGPR单克隆抗体。接着，通过ELISA确定几 种抗DC-ASGPR mAb的相对亲和力(即将DC-ASGPR. Ig蛋白质固定在微量平板的表面上， 并以剂量滴度系列测试抗体与DC-ASGPR. Ig的结合能力。结果发现，来自杂交瘤如PAB42、 PAB44和PAB54的上清液的亲和结合力高于其他mAb (数据未给出)。通过FACS表征抗DC-ASGPR mAb。还通过FACS，与用指导细胞表面DC-ASGPR合成 的表达质粒转染的293F细胞比较，检测mAb组。与未被转染的293F细胞比较，从类似的信 号减去平均荧光强度。根据这种标准，mAb能够特异性地结合到带有DC-ASGPR的细胞表面 上。一些mAb，例如37A7在这方面具有显著优势(数据未给出)。

图1A-1D表明，通过DC-ASGH 信号传导激活DC。DC是决定免疫应答结果的主要 免疫细胞，该结果为诱导或者耐受，这取决于它们的活化状态(15)。LLR在DC活化中的作 用尚不清楚。因此，我们测试触发LLRDC-ASGPR是否能导致DC的激活。体外培养3天和6 天的GM/IL-4DC都表达L0X-1、ASGPR和CLEC-6 (图1A)。6天的DC用对DC-ASGPR特异的 mAb刺激，图1B中的数据表明，通过DC-ASGPR的信号能够激活DC，导致⑶86和HLA-DR的 表达增加。触发DC上的DC-ASGPR还导致DC中IL-6、MCP-l、IL_12p40和IL-8的生成增加 (图1C)。通过DC-ASGH 信号传导还使得其他细胞因子和趋化因子，TNFa、IP-10、MIP_la 和IL-10显著增加(数据未给出)，表明DC-ASGPR能够递送细胞信号来激活DC。同样地， 用DC-ASGPR特异性mAb刺激的DC所表达的多种基因的水平都升高，包括共刺激分子以及 趋化因子和细胞因子相关基因(图ID)。LLR在TLR2和TLR4介导的免疫细胞活化中的可 能贡献先前已描述(13，16)。我们观察到，通过DC-ASGPR的信号能够与通过⑶40的信号协 同以进一步活化DC(图1E)。这是重要的，因为在体内DC活化中，LLR可作为共刺激分子。 总的来说，图1中的数据证明通过DC-ASGTO信号传导能够激活DC，且DC-ASGTO作为DC活 化的共刺激分子起作用。在⑶40-⑶40L相互作用中DC-ASGPR占用导致IL_12p70的生成 显著增加。通过DC-ASGPR刺激的DC引发有效的体液免疫应答。DC通过给T细胞依赖性和T 细胞不依赖性B细胞反应提供信号(19-22)，并通过将抗原传递给B细胞(23，24)来在体液 免疫应答中起重要作用。除了 DC，作为第三信号的通过TLR9信号传导对有效的B细胞反应 也是必需的(25，26)。因此，我们测试了在TLR9配体CpG存在下，DC-ASGPR在DC介导的体液免疫应答 中的作用。6天的GM/IL-4DC用抗DC-ASGPR mAb刺激，然后共培养纯化的B细胞。如图2A 中所示，与用对照mAb刺激的DC相比，用抗DC-ASGPR mAb激活的DC导致显著增加的B细胞扩增(CFSE稀释)和浆细胞分化(⑶38+CD20—)。⑶38+CD20—B细胞具有浆细胞的典型形态 学，但是它们不表达CD138。大多数增殖细胞不表达CCR2、CCR4、CCR6或CCR7。通过ELISA 测定所生成的总免疫球蛋白(Ig)的量(图2B)。与图2A中的数据一致，用抗DC-ASGTO刺 激的DC培养的B细胞导致IgM、IgG和IgA生成的显著增加。除了总Ig，我们还观察到，对 于通过B细胞产生流感病毒特异性IgM、IgG和IgA(图2C)来说，触发DC-ASGPR而活化的 DC比用对照mAb刺激的DC更有效，表明DC-ASGPR介导的DC活化对总的和抗原特异性的 体液免疫应答都起作用。我们测试离体抗原呈递细胞(APC)中的DC-ASGH 在体液免疫应 答中的作用。包括⑶19+和⑶14+细胞在内的PBMC中的部分APC表达DC-ASGPR (增补的图 2)。在用抗DC-ASGPR mAb包被的平板中培养来自血沉棕黄层的PBMC，并测定总Ig和B细 胞增殖。与从DC获得的数据(图2A) —致，在缺乏(图2d中的上面一组)或存在(图2D 中的下面一组)TLR9配体的情况下，通过DC-ASGPR刺激的APC导致B细胞增殖和浆细胞分 化增多。当PBMC在用抗DC-ASGPR的mAb包被的平板中培养时，总IgM、IgG和IgA也显著 增加(图2e)。如图1中所示，通过DC-ASGH 信号传导激活的DC具有成熟的表型，并生成 大量炎症性细胞因子和趋化因子，而且成熟的DC表型和来自DC的可溶性因子都对增强的B 细胞反应起作用(图2)。但是，DC来源的B淋巴细胞刺激蛋白(BLyS，BAFF)和增殖诱导配 体(APRIL)也是重要分子，DC通过这些分子能够直接调控人B细胞的增殖和功能(27-30)。 因此，我们测试通过DC-ASGPR的信号是否能改变BLyS和APRIL的表达水平。图2d中的数 据表明，由所表达的DC-ASGH 刺激的DC增加了细胞内APRIL以及所分泌的APRIL的水平， 但是对BLyS不起作用(未给出)。测定混合培养物中的B细胞上的BLyS和APRIL受体的 表达水平，但是没有显著的变化(未给出)。DC-ASGPR对B细胞活化以及Ig生成起作用。CD19+B细胞表达DC_ASGPR(图3A)。 因此，我们测试DC-ASGPR在B细胞活化中的作用。图3B中数据表明，通过DC-ASGPR刺激 的B细胞生成显著更高量的趋化因子。当用抗DC-ASGPR mAb刺激B细胞时，与对照mAb 相比，除了 IL-8和MIP-la外，还观察到IL-6和TNF a略微增加。与细胞活化相关的基因 也被上调(图3C)。当通过DC-ASGH 刺激B细胞时，它生成IgM、IgG和IgA(图3D)，表明 DC-ASGH 在维持体内正常的免疫球蛋白水平中起重要作用。然而，单独通过DC-ASGH 信号 传导并不引起显著的B细胞增殖。DC-ASGPR在T细胞反应中的作用。通过DC-ASGPR刺激的DC表达共刺激分子的水 平增强，并且生成的细胞因子和趋化因子的量增加(参见图1)，表明DC-ASGra对细胞免疫 应答以及体液免疫应答都起作用。这通过混合淋巴细胞反应(MLR)来测试。用对DC-ASGPR 特异的mAb刺激DC，显著增加纯化的同种异体T细胞的增殖(图4A)。与对照mAb刺激的 DC相比，通过DC-ASGPR活化的DC更有效地致敏Mart_l特异性⑶8T细胞(图4B的上一 组)。更重要的是，通过DC-ASGH 信号传导允许DC交叉致敏(cross-prime)Mart-1肽至 ⑶8T细胞上(图4B中的下一组)。这显示DC-ASGPR在增强DC功能中发挥重要作用，导致 更好地将抗原致敏和交叉致敏至⑶8T细胞上。PBMC中的APC混合物上所表达的DC-ASGPR 在T细胞反应活化中的作用示于图4C中，其中与用对照mAb刺激的DC相比，用DC-ASGPR 的mAb刺激的PBMC导致Flu Ml四聚体特异性CD8T细胞的频率升高。该增强的抗原特异 性⑶8T细胞反应由图4D中数据所支持，表明通过DC-ASGPR刺激的DC显著地增加⑶4T细 胞的增殖。
材料与方法。抗体和四聚体_包括同型对照Ab在内的用于DC和B细胞的表面染色的抗 体(Ab)购自 BD Biosciences (CA)。用于 ELISA 的抗体购自 Bethyl (TX)。抗 BLyS 和抗 APRIL 购自 P印roTech(NJ)。四聚体，HLA-A*0201_GILGFVFTL(SEQ ID NO. 1) (Flu Ml)禾口 HLA-A*0201-ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 2) (Mart-1)购自 Beckman Coulter (CA)。细胞和培养物-来自正常供体的单核细胞(1 X 106/ml)在含有GM-CSF (lOOng/ml) 和IL-4(50ng/ml) (R&D, CA)的Cellgenics (France)培养液中培养。对于第3天和第6天 的DC，分别在第1天和第3天将相同量的细胞因子添加到培养液中。B细胞用阴性分离试 剂盒(BD)纯化。CD4和CD8T细胞用包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy, CA)纯化。使用 Percoll 梯度(GEHealthcare UK Ltd,Buckinghamshire,UK)通过密度梯度离心从血沉棕 黄层中分离PBMC。对于DC活化，将1 X 105DC在用mAb包被的96孔平板中培养16_18h。在 碳酸盐缓冲液PH 9.4中的mAMljyg/孔)在37°C下培养至少3h。收集培养物上清液， 细胞因子/趋化因子通过Luminex(Bi0rad，CA)测定。对于基因分析，DC在mAb包被的平 板中培养 8h。在一些实验中，将可溶性 50ng/ml CD40L(R&D, CA)或 50nM CpG(InVivogen, CA)添加到培养液中。在DC和B细胞共培养中，将重悬在含有10% FCS和抗生素的RPMI 1640 (Biosource，CA)中的5 X 103DC首先在mAb包被的平板中培养至少6h，然后加入1 X 105 用CFSE(Molecular Probes,OR)标记的纯化自体B细胞。在一些实验中，DC用5moi (感染 复数)热灭活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脉冲攻击2h，然后与B细胞混合。对于DC和T细 胞共培养，将5X 103DC与IX 105纯化的自体⑶8T细胞或者混合的同种异体T细胞一起培 养。在培养的最后18h，用1 y Ci/孔3[H]-胸苷脉冲攻击同种异体T细胞，然后通过P _计 数仪(WallaC，MN)测定cpm。以5X 105PBMC/孔在mAb包被的平板中培养。分别在第10天 和第7天，通过用抗⑶8和四聚体染色细胞来测定Mart-1和Flu Ml特异性⑶8T细胞的频 率。将 10 ii M 的 Mart-1 肽(ELAGIGILTV) (SEQID N0. 2)禾P 20nM 的含 Mart-1 肽的重组蛋 白(参见下文)添加到DC和⑶8T细胞培养物中。将20nM纯化的重组Flu Ml蛋白(参见 下文)力口到PBMC培养物中。单克隆抗体-通过常规技术制备小鼠mAb。简而言之，用含有Ribi佐剂的20iig 受体胞外结构域.hlgGFc融合蛋白对6周龄的BALB/c小鼠进行i. p.免疫，然后在第10天 和第15天，用20 y g抗原进行加强免疫。3个月后，在取出脾脏的前3天，再对小鼠加强免 疫。或者，在30天至40天的期间内，每3-4天用在Ribi佐剂中的1-10 y g抗原注射小鼠 足垫。在最后加强免疫后的3-4天，收集引流的淋巴结，来自脾脏或淋巴结细胞的B细胞与 SP2/0-Agl4细胞融合。对杂交瘤上清液进行筛选，与单独的融合伴侣或与碱性磷酸酶融合 的受体胞外结构域(44)相比，分析受体胞外结构域融合蛋白的Ab。然后在FACS中使用用 编码全长受体cDNA的表达质粒瞬时转染的293F细胞对阳性孔进行筛选。被选的杂交瘤是 在CELLine瓶(Intergra，CA)中克隆和扩增的单个细胞。杂交瘤上清液与等体积的1. 5M 甘氨酸、3M NaClUx PBS，pH 7. 8混合，并与MabSelect树脂混合。用结合缓冲液洗涤树脂， 并用0. 1M甘氨酸，pH 2. 7洗脱。接着用2M Tris中和，用PBS透析mAb。ELISA-进行夹心ELISA来测量总IgM、IgG禾口 IgA以及flu特异性免疫球蛋白 (Ig)。含有已知量的Ig的标准人血清(Bethyl)和人AB血清分别用作总Ig和flu特异性 Ig的标准。样本中的Flu特异性Ab滴度，单位被确定为具有相同的光密度的AB血清的稀释系数。用ELISA试剂盒(BenderMedSystem，CA)测定BAFF和BLyS的量。RNA纯化和基因分析-用RNeasy柱(Qiagen)提取总RNA，并用 2100Bioanalyser (Agilent)分析。生物素标记的cRNA靴标用Illumina totalpr印标记试 剂盒(Ambion)制备并杂交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的转录本)上。这些微阵列 由附着在3 ym珠上的50mer寡核苷酸探针组成，所述珠固定在硅片表面上蚀刻的微孔中。 用链霉抗生物素_Cy3染色后，用Illumim^Beadstation 500X)生产的亚微米分辨扫描仪 成像。用基因表达分析软件程序GeneSpring，Version 7. 1 (Agilent)进行数据分析。重组Flu Ml和MART-1蛋白的表达和纯化-用PCR扩增流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)Ml基因的0RF，同时加入起始密码子远端的Nhe I位点以及 终止密码子远端的Not I位点。将消化片段克隆到pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml 0RF 读框内插入His6标签，从而编码His. Flu Ml蛋白质。编码插入在Nco I和Nhe I之间的来 自热纤梭菌(C. thermocellum)(未公开)的N端169个残基cohesin结构域的pET28b (+) 衍生物表达 Coh. His。为了表达 Cohesin-Flex-hMART-1-肽 A-His，序列GACACCACCGAGGCCC GCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATC GGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCC ATCACACTGGCGGCCG (SEQID NO. 3)(编码 DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRT NNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO. :4)-带阴影的残基是免疫显性的HLA-A2-限制性肽，而 该肽周围带下划线的残基来自MART-1)被插入到上述载体的Nhe I位点和Xho I位点之间。 蛋白在大肠杆菌菌株BL21(DE3) (Novagen)或者T7Express (NEB)中表达，这些菌株在37°C 下在LB中培养，以卡那霉素抗性(40 u g/ml)选择，并以200转/分钟摇瓶直至生长到对数 中期，同时添加120mg/L IPTG。3h后，通过离心收集细胞，保存在_80°C下。将来自每1L发 酵物中的大肠杆菌细胞重悬在30ml含有0. lml蛋白酶抑制剂Cocktail II (Calbiochem, CA)的冰冷的50mM Tris,lmM EDTApH 8. 0(缓冲液B)中。在冰上超声处理细胞2次，每次 5分钟，设定值为18(Fisher SonicDismembrator 60)，其中有5分钟静止期，然后在4°C下 以 17, 000r. p. m. (SorvallSA-600)离心 20 分钟。为了纯化 His. Flu Ml，使 50ml 细胞裂解 物上清液部分通过5ml Q琼脂糖珠，将6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaCl pH7. 9添加 到Q琼脂糖流动液中。将其以4ml/分钟速度上样到5ml带有Ni++的HiTrap螯合HP柱上。 结合柱的蛋白质用20mM NaP04,300mM NaCl pH7. 6(缓冲液D)洗涤，接着用100mM H3C00Na pH 4.0再洗涤一次。结合的蛋白质用lOOmM H3C00Na pH 4.0洗脱。合并峰值馏分，以4ml/ 分钟的速度上样到用lOOmM H3C00Na pH 5. 5平衡的5ml Hi Trap S柱上，用平衡缓冲液洗 涤，接着用在50mM NaP04pH 5. 5中的梯度为0-1M的NaCl洗脱。合并用约500mM NaCl洗脱 的峰值馏分。为了纯化Coh. Flu Ml. His,如上所述将来自2L培养物的细胞裂解。离心后， 将2. 5ml Triton 29X114加到上清液中，在冰上培育5分钟。在25°C下再温育5分钟后，在 25°C下进行离心，从Triton XI14中分离上清液。重复提取操作，将上清液通过5ml的Q琼 脂糖珠，在Q琼脂糖流动液中添加6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaClpH 7.9。如上所 述，用M++螯合的层析柱纯化蛋白质，并用在缓冲液D中的0-500mM咪唑洗脱。仅特定的抗DC-ASGPR mAb具有DC激活特性-本发明公开了 DC激活不是抗 DC-ASGPR抗体的普遍特性，仅仅某些抗DC-ASGPR mAb具备该功能。图5表明仅某些mAb通 过DC-ASGPR激活DC，这必须用真实DC筛选来表征。
对应于抗DC-ASGPR mAb的L和H可变区的特定序列-本发明包括下文所示的对 应于抗DC-ASGH 单克隆抗体的特定氨基酸序列，它们是治疗性或保护性产品的期望成分 (在例如人源化重组抗体的情况下)。如下是嵌合小鼠V区-人C区重组抗体的序列。[m Anti-ASGPR_49Cll_7H-LV-hIgG4H-C]是 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSffHWIRQFP GNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASffGQGTLVTVSAAK
ttgpsvfplapc srstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgt
KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ IDNO. :5)。上述序列是在 mAb 49C11 的 H 链 V 区(以下
划线显示)和hIgG4的C区之间的嵌合体。[mAnti-ASGPR_49Cll_7K-LV-hIgGK-C]是相应
的 L 链嵌合体-QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRfflYDTSRLASGVPARFSG
SGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQffSSHPffSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SE
Q ID NO. 6)。[mAnti-ASGPR_4G2. 2_Hv_V-hIgG4H_C]为 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGY
TFTNYGMNVVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRL
NYFDYffGQGTTLTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSS
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EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO. :7)。[mAnti_ASGPR_4G2. 2_
Kv-V-hlgGK-C]为 DIQMTQSSSSFSVSL⑶RVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSR
FSGSGSGKDYALSITSLQTEDLATYYCQQCffTSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(
SEQ ID NO. :8)。 「mAnti-ASGPR 5F10H-LV-hIgG4H_Cl 为EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTF
TDYYMKffVKQSHGKSLEfflGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDV
ffGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
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GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW
QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS(SEQ ID NO. :9)。[mAnti-ASGPR_5F10K-LV-hIgGK_C]
为 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAffYQQKPGQSPKLLIYffASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLT
INNVQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKV
DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.
10)。 [mAnti-ASGPRlHllH-V-hIgG4H-C]为 QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHG
KSLEfflGGINPINGGPTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARffDYGSRDVMDYffGQGTSVTVS
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QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO. :11)。 「mAnti-ASGPRlHllK-LV-hlgGK-Cl 为 NIVMTQ SPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSffYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDL ADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO. :12)。本发明 包括这些V区序列以及相关序列，该相关序列由本领域熟练技术人员改造以用于例如增加 对DC-ASGPR的亲和性，和/或被整合到人V区框架序列中，以被工程化到表达载体中来指 导能够结合抗原呈递细胞上的DC-ASGPR的蛋白质的表达。 工程化的重组抗DC-ASGPR重组抗体-抗原融合蛋白((rAb.抗原)是有效的体外 原型疫苗-用不同的蛋白质编码序列来构建表达载体，例如在读框内与H链编码序列融合。 例如，抗原，例如流感病毒HA5、流感病毒Ml、HIVgag或来自癌抗原的免疫显性肽，或者细胞 因子，随后被表达成rAb.抗原或者rAb.细胞因子融合蛋白，在本发明的情况下，其可具有 来自于使用抗DC-ASGPR V区序列将抗原或细胞因子(或毒素)直接携带到带有DC-ASGPR 的抗原呈递细胞的表面的应用。这使得可以内在化例如抗原_有时与受体的活化以及随后 起始治疗性或保护性作用(例如通过起始有效的免疫应答，或者通过杀死靶向的细胞)相 关。基于该构思的示例性原型疫苗可以使用H链载体，例如[mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG 4H-C-Flex-FluHA5-l-6xHis]或者-EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEW IGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVffGAGTTVTVSSAKTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGKAS
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ID NO. :13)。上述序列对应于已显示的嵌合H链，其通过弹性接头序列(斜体显示)融合 到禽Flu HA5HA-1结构域(粗体显示)。这可以与上面已显示的相应的L链嵌合序列共同 被表达。类似地，序列[mAnti-ASGPR_49Cll_7H-LV-hIgG4H-C-Dockerin]-DVQLQESGPDLVKP SQSLSLTCTVTGYSITSGYSffHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDT ATYFCARSNYGSFASffGQGTLVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
22SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYV LKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO. 14)可用于通过共转染 上述已显示的相应L链序列表达rAb. Docker in融合蛋白。图6表明在DC-ASGPR rAb的情况下，不同的抗原可被表达。这种抗DC-ASGPR 『八匕力况蛋白可简单地与任何⑶！！⑶^.融合蛋白混合，来组装成稳定的非共价的[rAb. Doc:Coh.融合]复合物，其作用正如rAb.融合蛋白。图6表明这种[rAb. DocCoh.融合] 复合物将抗原集中到表达DC-ASGPR的细胞的表面上。该图还表明，抗DC-ASGPR. Doc:Coh. Flu Ml复合物将Flu Ml递送到转染了 DC-ASGPR cDNA的293F细胞的表面。1 P g/ml (右 组)抗DC-ASGPR. Doc rAb (绿色所示)或者对照hIgG4. Doc rAb (蓝色所示)在室温下与 生物素化Coh. Flu Ml (2 u g/ml) 一起孵育1小时，加入被转染的293F细胞，在冰上继续孵 育20分钟。然后洗涤细胞，并用PE标记的链霉抗生物素染色。然后分析细胞的PE荧光强 度。通过Dockerin:Cohesin相互作用，与Flu Ml复合的抗DC-ASGPR rAb将抗原靶向 人DC，导致Flu Ml特异性⑶8+T细胞的扩增-抗DC-ASGPRrAb作为装置将抗原递送至例如 DC的可能用途在下图中显示。图7表明FluMl特异性⑶8+细胞的显著扩增高度预测了该 活性剂作为引发针对Flu Ml的保护性免疫应答的疫苗的可能性。图8证明了不同抗体与猴ASGH 之间的交叉反应性。通过将PCR产物插入到pIRES 载体的Nhel-NotI位点中来克隆pIRES_ASGPR-m0n(猴)。最终产物的序列是基于克隆 5S10。大部分其他克隆或者与其类似，仅仅差别1个氨基酸，或者与之相同。但是，一个克 隆5S1在接近3'端存在A缺失，产生截短且不同的C末端，可用作第二变体。为了克隆猴 ASGPR,使用如下寡核苷酸DC-ASGPR_MoN :gaattcgctagcCACCATGACATATGAAAACTTCCAAGAC TTGGAGAGTGAGGAGAAAGTCCAAGGGG(SEQ ID NO. 15)；和 DC_ASGPR_Mo :CGAATTCGCGGCCGCTCA GTGACTCTCCTGGCTGGCCTGGGTCAGACCAGCCTCGCAGACCC(SEQ ID NO. : 16)，其是 GGGTCTGCGAGGC TGGTCTGACCCAGGCCAGCCAGGAGAGTCACTGAGCGGCCGCGAATTCG(SEQ ID NO. : 17)的反向互补体。 序列比对表明了可能的重叠区，以及因此的本领域技术人员知晓的交叉反应性。下表证明了DC-ASGPR 334998 200ug/ml 12. 05. 07cfg#558 抗人 IgG PE 的结合性
台匕
AvgStDevSEM聚糖w/ow/ow/o絲名称%CV数目MaxMaxMax&Min&Min&Min82GalNAca 1 -3(Fuca 1 -2)Gaip 1 -4GlcNAcP-Sp85293010265513219210Neu5Aca2-3(GalNAc|31-4)Gaipi-4GlcNAcP-Sp8499374969248410
权利要求
一种用于增加抗原呈递效力的方法，所述方法包括分离和纯化DC ASGPR特异性抗体或其片段的步骤，所述DC ASGPR特异性抗体或其片段与抗原结合形成抗体 抗原复合物，其中所述抗原由已与所述抗体 抗原复合物接触的树突细胞加工并呈递。
2.权利要求1的方法，其中抗原呈递细胞是树突细胞。
3.权利要求1的方法，其中DC-ASGI3R特异性抗体或其片段与Coherin/Dockerin对的——坐社入干？ 口 口 °
4.权利要求1的方法，其中DC-ASGI3R特异性抗体或其片段与Coherin/Dockerin对的 一半结合而抗原与Coherin/Dockerin对的互补性一半结合，形成复合物。
5.权利要求1的方法，其中抗原选自肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸及其组合。
6.权利要求1的方法，其中抗原特异性结构域特异于免疫细胞表面蛋白，所述免疫细 胞表面蛋白选自 MHC I类、MHC II类、CDl、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、 CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、 CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受体、Langerin、 DECTIN-UB7-UB7-2, IFN- γ受体和IL-2受体、ICAM_l、Fc γ受体或者由抗原呈递细胞相 对特异性表达的其他受体。
7.权利要求1的方法，其中抗原包括细菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生动物蛋白或 癌蛋白。
8.一种用于增加树突细胞抗原呈递效力的方法，所述方法包括结合DC-ASGPR特异性 抗体或其片段，所述DC-ASGPR特异性抗体或其片段与抗原结合形成抗体_抗原复合物，其 中该抗原由已与所述抗体_抗原复合物接触的树突细胞加工并呈递。
9.权利要求8的方法，其中树突细胞的效力增加使用同种异体CD8+T细胞来确定。
10.针对DC-ASGPR的抗体或其它特异性结合分子用于递送抗原至抗原呈递细胞以引 起保护性或治疗性免疫应答的用途。
11.对DC-ASGPR特异的抗原靶向性试剂用于经皮肤的疫苗接种的用途。
12.对DC-ASGra特异的抗原靶向性试剂与共给药或连接的佐剂相结合用于疫苗接种 的用途。
13.能够作为重组抗原-抗体融合蛋白表达的特异性抗原用于抗原靶向(疫苗接种) 目的的用途。
14.抗原特异性抗DC-ASGra免疫球蛋白或其片段，其由哺乳动物细胞分泌且该免疫球 蛋白与抗原结合。
15.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原是与免疫球蛋白构成的融合蛋白。
16.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括细菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原 生动物蛋白或癌蛋白。
17.权利要求14的免疫球蛋白，其中该免疫球蛋白与cohesin/dockerin结构域的一半社a？口口。
18.权利要求14的免疫球蛋白，其还包括与抗原结合的cohesin-dockerin结合对的互 补性一半，其中该抗原与模块式rAb载体形成复合物。
19.权利要求14的免疫球蛋白，其还包括与抗原构成融合蛋白的cohesin-dockerin结 合对的互补性一半。
20.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原特异性结构域包括全长抗体、抗体可变 区结构域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc 结构域的Fab片段。
21.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白与毒素结合，其中所述毒素选自 放射性同位素、金属、酶、肉毒杆菌毒素、破伤风、蓖麻毒素、霍乱、白喉、黄曲霉毒素、产气荚 膜梭菌毒素、真菌毒素、志贺菌毒素、葡萄球菌肠毒素B、T2、seguitoxin、蛤蛘毒素、相思豆 毒素、cyanoginosin、α毒素、 可月豕毒素、aconotoxin、蛇毒禾口_虫朱毒。
22.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原是与所述免疫球蛋白构成的融合蛋白。
23.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括细菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原 生动物蛋白或癌蛋白。
24.权利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括选自以下的癌细胞或其部分T细胞 和B细胞淋巴增生性疾病、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳癌、前列腺癌或 非小细胞肺癌。
25.一种用于增加树突细胞效力的方法，所述方法包括分离患者树突细胞；使所述树突细胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗体或该抗体片段和抗原，形成负载了 抗原的活化树突细胞；和将所述负载抗原的活化树突细胞再引入所述患者中。
26.单独或者与共激活剂一起结合DC-ASGPR以活化抗原呈递细胞的活性剂用于治疗 性或保护性应用的用途。
27.权利要求25的方法，其中所述DC-ASGra结合性和/或活化性活性剂单独地或者与 共激活剂一起与抗原连接用于保护性或治疗性的疫苗接种。
28.权利要求25的方法，其中所述特异性抗体V区序列能够结合并活化DC-ASGPR。
29.与毒性剂连接的抗DC-ASGPR活性剂用于在疾病的情况下治疗性目的的用途，所述 疾病已知或者被怀疑是由于经DC-ASGPR的免疫细胞的不适当激活所引起。
30.一种疫苗，其包含DC-ASGPR特异性抗体或其片段，所述DC-ASGPR特异性抗体或其 片段与抗原结合形成抗体_抗原复合物，其中所述抗原由已与该抗体_抗原复合物接触的 树突细胞加工并呈递。
全文摘要
本发明包括用于制备和使用抗DC-ASGPR抗体的组合物和方法，该抗体能够例如活化DC和其他细胞。
文档编号A61K39/00GK101952414SQ200880011349
公开日2011年1月19日 申请日期2008年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者G·祖拉夫斯基, J·F·班彻罗, S·吴, S·祖拉夫斯基, 李大鹏 申请人:贝勒研究院