专利名称：稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及工程细 胞系MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl及其构建方法，所构建细胞系可用于禽流感疫苗株的大規模细胞化生产。
背景技术：
流感病毒表面的血凝素(HA)通过与宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体结合从而起始病毒感染宿主细胞，禽源和马源流感病毒偏嗜结合α 2，3-唾液酸寡糖受体(Neu5Aca2，3Gal)，而人源和猪源流感病毒偏嗜结合α2，6_唾液酸寡糖受体(Neu5Ac α 2，6Gal)。因此，细胞表面唾液酸受体的类型及丰度，影响流感病毒对不同宿主的适应性。不同的唾液酸受体对流感病毒在宿主细胞中感染、复制和扩散产生重要的影响。目前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗。哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型中表现出较好的保护性作用，当前Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)被认为是培养A型和B型流感病毒最适合的细胞系。传统的流感病毒疫苗是依靠鸡胚生产的，病毒经过培养增殖、浓缩、灭活、进一歩纯化，配制、无菌灌装，最后检测和放行。除了研发使用高产重组毒株作为A型流感的种毒，基本生产エ艺在过去的60年几乎没什么变化。不仅成本代价高，而且鸡胚的残留物质还可能引起过敏反应，此外，当面临高致病流感病毒导致的全球大流行时，传统的鸡胚生产方法可能不足以满足全球疫苗市场的需求。因此，研究机构和疫苗公司正在合作开发新的生产技木，以达到省时高效的目的。为了获得流感疫苗生产的替代方法，疫苗公司已经尝试了许多新的途径。组织培养的细胞系作为鸡胚生产方式的一种补充或替代方法，已经引起了人们的重视。细胞生产系统主要具有以下优势1)可以应用许多在鸡胚生产系统中得到临床验证的基本方法(如全病毒的生产、多步裂解、纯度更高的流感抗原或减毒活疫苗)，同时，缩短鸡胚生产的供应时间，稳定产品供应链；2)可以应用更加先进可控的种毒生产系统，由于生产用细胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的风险；3)提供了一种更加高效、稳定、可重复的疫苗生产方式，使用一种规格可变且封闭的生物反应器，可以在任意时间起始反应，并可以根据需要延长生产周期；4)提高了部分禽流感毒株生产疫苗的能力。除了上述优点，以哺乳动物细胞生产疫苗至少具有一种理论上的优点在鸡胚中进行的流感病毒的分离和复制通常会产生特定表型的选择，而这种选择往往不同于正确的人类分离株。相反，在细胞中进行的流感病毒的分离复制不会产生这种传代依赖性的表型选择。从而有利于表达天然构象的血凝素抗原，优化抗体的特异性。Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)来源于ー只成年猎犬的肾脏组织。关于MDCK细胞来源的季节性流感疫苗的临床试验结果表明，MDCK细胞来源的病毒经过连续传代之后，可以保持抗原的稳定性，此类疫苗的安全性和免疫原性与鸡胚来源的疫苗相当。人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV (hST3GalIV)能将唾液酸(Neu5Ac)转移到糖蛋白的末端的2型糖链(Gal β l-4GlcNAc)，或者I型糖链(Gal β l_3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之间连键是α 2-3。hST3GalIV优先作用于2型糖链(Gal β l_4GlcNAc)，其次才是 I 型糖链(Gal β l_3GlcNAc)。人源β 1-4半乳糖基转移酶I (UDP-半乳糖Ν-こ酰氨基葡萄糖基β 1-4半乳糖基转移酶，简称为β l_4GalTl，EC2.4. I. 38)，是ー组II型膜结合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)转移到糖链的N-こ酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal与GIcNAc之间的连键是β 1-4。
发明内容
本研究首次建立了提高禽流感病毒α 2，3-唾液酸丰度的MDCK细胞系一MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 细胞。通过稳定共表达 hST3GalIV 和 β l_4GalTl，可以增强β l-4GalTl催化半乳糖与N-こ酰葡萄糖以β 1-4连键连接的效力，hST3GalIV催化唾液酸与半乳糖以α 2-3连键连接的效力，从而提高MDCK细胞表面α2，3_唾液酸丰度。该稳定表达细胞系细胞表面α 2，3-唾液酸显著高于母本MDCK细胞系，与母本MDCK细胞系相比，禽流感病毒的分离株和疫苗候选株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系上形成更大的 噬斑，生长滴度更高。稳定共表达hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK细胞系建立之后，更适合禽流感病毒的生长，无论是病毒滴度还是噬斑形成能力都要更高，也证明了禽流感病毒对α 2，3-唾液酸的偏嗜性，不仅为研究α 2，3-唾液酸受体提供了方便的工具，对于实时监测禽流感病毒进行受体结合特性、检测禽流感病毒变异株的出现、发现受体结合特性发生变化的禽流感毒株具有广泛的应用价值。此外，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系在抗禽流感病毒药物、疫苗株筛选以及细胞培养疫苗的生产方面都展示出较好的应用前景。本发明稳定表达人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)和β 1-4半乳糖转移酶(β l-4GalTl)的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl ;保藏号为CGMCC No. 5967。所述的 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞系同时含有编码 hST3GalIV 的基因和编码β l_4GalTl的基因。所述编码hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No:l所显示，其所编码的hST3GalIV的氨基酸序列如SEQ ID No:3所显示；所述编码β l_4GalTl的基因序列如SEQ ID No:2所显示，其所编码的β l_4GalTl的氨基酸序列如SEQ ID No:4所显示。所述编码hST3GalIV基因序列和β l_4GalTl基因序列来自于人。本发明的另ー个方面，提供构建MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系的方法，所述方法包括将hST3GalIV和β l_4GalTl的基因重组到MDCK细胞的基因组中。所述MDCK-hST3Gal IV-MGalTl细胞系的构建方法，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β l_4GalTl基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl基因的细胞系MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl。在本发明的另ー个方面中，提供ー种提高禽流感病毒生长滴度的方法，该方法包括，将H5N1亚型或H9N2亚型禽流感病毒株接种于本发明构建的MDCK-hST3GalIV-^4GalTl细胞系中，病毒在所述细胞系上的培养条件为35°C、5%C02。毒株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系中生长滴度的提高，为禽流感疫苗的细胞化生产提供了有利条件。更具体地说，在本发明的一个实施方案中，将编码hST3GalIV基因的真核表达载体和β l_4GalTl基因的真核表达载体转染到MDCK细胞系中，构建稳定共表达hST3GalIV和 β l-4GalTl 的MDCK细胞系，本发明中一株表达hST3GalIV和 β l_4GalTl 的Madin-Darby犬肾细胞系MDCK-hST3GalIV-β 4GalTl细胞克隆株于2012年4月10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 5967。经实验表明，所述MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞中α 2，3_唾液酸受体含量显著高于母本MDCK细胞，禽流感病毒在本发明MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞系上繁殖的能力显著高于母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV，禽流感病毒在MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl细胞上测定的滴度均高于在母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞上的滴度。使用MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系可用于提高禽流感病毒产量并且避免了鸡胚来源灭活疫苗中鸡胚的残留物带来的副反应效应，可用于具有α 2，3-唾液酸受体能力的病毒疫苗株的大規模细胞化培养和生产。
图I:不同G418浓度下MDCK细胞生存曲线横坐标时间(天数)纵坐标细胞存活率(%)选择在1(Γ14天内把细胞全部杀死的浓度作为G418的筛选浓度，即O. 8mg/mL。图2:MDCK 与 MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 细胞 RT-PCR 鉴定结果(A)ST3GalIV 基因的电泳結果，I :MDCK_hST3GalIV-β 4GalTl 细胞，2 :母本 MDCK细胞，M 200bp Marker ；(B) β l_4GalTl 基因的电泳結果，I :MDCK_hST3GalIV-β 4GalTl 细胞，2 :母本MDCK细胞，M 200bp Marker。图3:流式细胞术检测不同MDCK细胞表面α 2，3_唾液酸受体与特异性凝集素MAA的结合。(A)MDCK细胞空白对照；MDCK细胞与MAA结合；MDCK_ST细胞与MAA结合；MDCK-STGT细胞与MAA结合；(B)不同MDCK细胞表面α 2，3_唾液酸受体与MAA的结合3次检测果平均值的比较。(*)表示与MDCK-MAA组相比具有显著差异(ρ〈0· 05)；(#)表示与MDCK MAA和MDCK-ST MAA组相比均具有显著差异(ρ〈0· 05)。注MDCK-ST 代表 MDCK_ST3GalV 细胞系；MDCK-STGT 代表 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞系。图4:禽流感病毒在 MDCK 细胞、MDCK-ST3GalV 细胞和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl细胞上的繁殖曲线。(A) LH5N1在三种细胞上的繁殖曲线；(B) LR38/H5N1在三种细胞上的繁殖曲线；(OF/H9N2在三种细胞上的繁殖曲线。
注M代表MDCK细胞系；ST 代表 MDCK_ST3GalV 细胞系；STGT 代表 MDCK-hST3GalIV_P 4GalTl 细胞系。图5:不同禽流感病毒毒株在母本MDCK细胞、MDCK_ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl 细胞上的感染滴度(TCID50)。(*)表示MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞与母本MDCK细胞测定结果相比具有显著差异(ρ〈0· 05)；(#)表示 MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl 细胞与母本MDCK 细胞和 MDCK_ST3GalV 细胞
注MDCK-ST3 代表 MDCK_ST3GalIV 细胞；MDCK-STGT2 代表 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞。图6:禽流感病毒在在母本MDCK细胞、MDCK_ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 细胞上的 PFU 測定。(*)表示MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞与母本MDCK细胞测定结果相比具有显著差异(ρ〈0· 05)；(#)表示 MDCK-hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞与母本 MDCK 细胞和 MDCK_ST3GalIV 细胞相比均具有显著差异(p〈0.05)。注MDCK-ST 代表 MDCK_ST3GalIV 细胞；MDCK-STGT 代表 MDCK-hSTXallV- β 4GalTl 细胞。
具体实施例方式下文将參考实施例和附图详细说明本发明，所述实施仅仅g在举例说明本发明，而非限制本发明的范围，本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例lMDCK-hST3GalIV 细胞系和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞系的构建I.材料与方法I. I试剂与仪器含人源ST3GalIV和β l_4GalTl开放阅读框的真核表达质粒购自Genecopoeia公司(货号EX-C0523-M02和EX-C0234-M02) ；DMEM培养基和无血清Opti-MEM购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司；质粒小量提取试剂盒Plasmid MiniprepKit购自Qiagen公司；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；FuGENEP; HD转染试剂、购自Roche公司；G418(40mg/mL)溶液购自上海生エ生物工程有限公司。MDCK细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。普通倒置显微镜和突光倒置显微镜为Leica产品；分光光度计为NanoDrop公司NDlOOO ;凝胶成像系统为基因公司产品。I. 2引物设计用于扩增人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV (hST3GalIV)的引物
3G4F :5，-ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’ (SEQ ID No:5)3G4R :5，-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’ (SEQ ID No:6)用于扩增人源β 1-4半乳糖转移酶I (β l_4GalTl)的引物B4G1F :5，-ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’ (SEQ ID No:7)B4G1R :5’ -CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’(SEQ ID No:8)。I. 3确定筛选培养基中合适的G418浓度MDCK细胞接种48孔细胞培养板待长至80_90%丰度时加入含不同浓度的geneticin (G418)培养基:0、0· 1,0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 5 和 2mg/mL，置 37°C、5%C02 培养箱培养，每天观察并记录细胞生长情況。培养14天后绘制细胞生长曲线确定G418的筛选浓度。
I. 4 FuGENE' HD转染MDCK细胞及抗性细胞克隆的筛选接种约2 X IO-5MDCK细胞至6孔细胞板，细胞密度至80% 90%时可用于转染。将FuGENEk HD转染试剂及质粒溶液平衡到室温，在离心管内准备以下混合液将编码β-半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV基因序列的真核表达质粒hST3GAL4和编码β 1，4-半乳糖转移酶I基因序列的真核表达质粒β l_4GalTl (均购自Genecopoeia公司)各I μ g加入100 μ L无血清Opti-MEM培养基中，混匀之后，再添5 μ L FuGENEit HD转染试剂至上述混合液中，充分混匀之后，室温孵育15分钟，同时用无血清Opti-MEM培养基洗涤两次。将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2mL，置于37°C、5%C02培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。36小时后用胰酶消化细胞，按1:10的比例传代至48孔细胞板中，继续用含O. 8mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培养基为筛选培养基培养，每孔200 μ L，每3天换一次筛选培养基，G418持续筛选10-14天后，可见有抗性细胞生长。不进行质粒转染的细胞组作为阴性对照，细胞在含有G418的培养液中培养至死亡。选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用于单克隆细胞筛选用含O. 8mg/mL G418的筛选培养基将细胞密度稀释至I个/100 μ L，铺于96孔细胞板中50 μ L，每孔补加50 μ L筛选培养基。持续筛选10天后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单克隆筛选，以确保筛选出单克隆抗性细胞。筛选出的细胞依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板中扩大培养并冻存于液氮中。1.5RT-PCR 鉴定筛选出的细胞株和母本MDCK细胞分别在6孔细胞培养板中，每株细胞铺ー个孔，以2. 5mL含10%胎牛血清的DMEM培养基贴壁培养。待细胞长至90-100%汇合度吋，收集细胞，PBS洗涤两次，加入ImLO. 25%胰酶，37°C消化5分钟，加入lmL10%DMEM吹打，将吹匀的细胞悬液转移到离心管内离心IOOOrpm离心10分钟，弃去上清液，加入PBS吹匀，转移至I. 5mL离心管内，2000rpm离心5分钟,弃去上清液,并吸干PBS,加入ImL Trizol,混勻,冰上放置10分钟。加入200 μ L预冷氯仿，震荡15秒，室温放置2分钟；4°C 12000rpm离心10分钟；吸取上层水相约500 μ L至I. 5mL离心管，加入500 μ L预冷异丙醇，混匀，_20°C放置15分钟；4°C 12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入lmL75%预冷こ醇洗涤沉淀；40C 12000rpm离心3分钟；弃去上清液,加入ImL预冷无水こ醇再次洗漆沉淀；4°C 12000rpm离心3分钟；吸尽液体，室温10分钟晾干沉淀；加入50 μ L ddH20溶解RNA。以上试验所有的枪头、离心管、ddH20和75%预冷こ醇均用DEPC处理并且高压，全程戴手套进行实验。取2yL溶解的RNA，以分光光度计ND1000检测RNA浓度和A260/A280。提出的总RNA按如下体系反转录形成cDNA，步骤如下首先加入提取的总RNA溶液22 μ L、OligodT3 μ L，吹匀之后，置于70°C金属浴作用5分钟后置冰浴上，再加入下列试剂RNA酶抑制剂
2μ L、5 X缓冲液8 μ L,M-MuLV反转录酶I μ L和dNTP Μ χ4 μ L，总反应体积为40 μ L，置于37°C水浴孵育2 3小时，然后开始RT-PCR反应，使其反转录成cDNA。以反转录成的cDNA为模板，以3G4F和3G4R为引物通过PCR反应扩增人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)基因;B4G1F和B4G1R为引物扩增βト4半乳糖转移酶1(β l_4GalTl)基因。PCR反应循环參数94 °C预变性3分钟；94 °C变性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸90秒，共30个循环。配制1%的琼脂糖凝胶，并以EB染色，每孔加入10 μ LPCR产物，在100V电压下进行电泳，凝胶成像系统检测电泳結果。PCR产物经胶回收试剂盒回收之后，送上海生エ生物工程有限公司去测序。2.结果2. I培养基G418工作浓度的确定 我们选择10-14天内能够全部杀死MDCK细胞的G418浓度作为筛选浓度。根据细胞生长曲线(图1)，6418浓度在0.8 1.011^/111し之间时，细胞在10 14天内全部死亡。因此，我们选择O. 8mg/mL为本实验中压力筛选培养基中G418的浓度。2. 2RT-PCR 鉴定结果由RT-PCR结果(图2)可见，一株筛选的细胞株扩增出1002bp的条带，条带单一而且清晰，与目的基因(hST3GalIV)大小一致；另ー株筛选的细胞株可扩增出两个条带1002bp的条带和1197bp的条带，分别与目的基因(hST3GalIV和β HGalTl)大小一致。而对照组中母本MDCK细胞未见到有扩增的条带。说明我们已经将目的条带已经整合到MDCK细胞中。将这两株MDCK细胞按照常规方法扩增冻存。我们分将只扩增ー条基因的MDCK细胞定名为MDCK-ST3GalIV细胞，而扩增出两条基因的MDCK细胞定名为MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 细胞。2.3目的细胞的筛选正常MDCK细胞转染质粒之后，使用含有O. 8mg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选，获得具有抗性的细胞克隆。在含有G418的培养基中，未转染的细胞死亡。将获得的抗性细胞混合克隆用G418进行有限稀释、鉴定选择之后得到单克隆抗性细胞株。本发明中，我们对构建好的MDCK_ST3GalIV细胞和MDCK_hST3GalIV_β 4GalTl细胞进行RT-PCR鉴定，同时可在无G418压カ筛选下，持续传代细胞株，结果表明外源基因可稳定表达至少10代以上。这些鉴定结果表明，所得到的MDCK-ST3GalIV细胞单克隆细胞株中，ST3GalIV基因开放阅读框序列cDNA已经整合到MDCK细胞基因组中，能够随着MDCK细胞系传代而稳定持续地转录和表达；MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞中，人源ST3GalIV和人源β l_4GalTl基因开放阅读框序列cDNA已经整合到MDCK细胞基因组中，能够随着MDCK细胞系传代而稳定持续地转录和表达。本发明首次成功构建ー株稳定表达人源ST3GalIV基因的MDCK_ST3GalIV细胞系和一株稳定表达人源ST3GalIV和人源β l_4GalTl的MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl细胞系，以期提高细胞表面的α 2，3-唾液酸丰度。MDCK-hST3GalIV_i3 4GalTl稳定细胞系的建立，不仅为禽流感病毒α 2，3-唾液酸倾向性研究提供重要的研究工具，对于禽流感病毒受体结合特异性变异株监测、抗禽流感病毒药物筛选、中和抗体的测定以及大規模生产细胞培养禽流感病毒疫苗的生产应用，具有广泛的应用前景。实施例2流式细胞仪检测细胞表面α 2，3_唾液酸的表达I材料与方法I. I试剂与仪器地高辛标记糖鉴别试剂盒(DIGGlycan Differentiation Kit)和 Anti-Digoxigenin-Fluorescein (Anti-DIG FITC)购自 Roche 公司；流式细胞仪 FACSAria 为美国 BD 公
司产品。I. 2流式细胞检测细胞表面唾液酸的表达母本MDCK与转染MDCK细胞分别铺于6孔细胞板各3个孔。细胞长至90%丰度时 (约I. 5X IO6个细胞/孔)，胰酶消化，再加入少量10%DMEM，分别收集每孔细胞至EP管中，1400rpm离心8分钟，收集细胞沉淀。以PBS重悬洗漆两次,再用Buffer I (50mM Tris-HCl>O. 15M NaClUmM MgCl2UmM MnCl2UmM CaCl2,pH7. 5)洗一次。用配置好的封闭稀释液封闭稀释液的配制10倍稀释封闭液于TBS (O. 05M Tris-HCUO. 15M NaCl，pH7. 5)均匀重悬细胞沉淀，在冰上封闭I小吋。之后按上述方法重复洗涤步骤，再分别用ー抗DIG标记的MAA处理细胞，同时设ー组空白对照，即不加ー抗。一抗处理的方法为加4yL MAA于30yLBuffer I中均勻重悬细胞沉淀,冰浴I小时。重复洗漆步骤，再加入ニ抗，即I μ L Anti-DIGFITC于30 μ I Buffer I中均匀重悬细胞沉淀，冰浴I小时，最后PBS洗涤3次用于流式细胞仪检測。2.结果为了检测α 2，3-唾液酸受体在母本MDCK细胞、MDCK_ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞上的含量，我们使用地高辛(DIG)标记的α 2，3-唾液酸特异性凝集素，朝鲜槐凝集素(MAA)作为ー抗，FITC标记的抗DIG抗体作为ニ抗。朝鲜槐凝集素(MAA)能特异性地结合SAa-2，3Gal。检测结果显示，MDCK_ST3GalIV细胞中α 2，3_唾液酸受体的含量显著高于母本MDCK细胞，而MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞中α 2，3-唾液酸受体的含量均显著高于母本MDCK细胞和MDCK-ST3GalIV细胞(图3)。荧光强度道数区峰图也显示，与母本MDCK细胞相比，MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK_hST3GalIV- β 4GalTl细胞的道数区均向右偏移，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞的偏移量更多(图3)。实验结果表明，ST3GalV基因在MDCK-hST3GalIV细胞中稳定表达，提高了细胞表面α 2，3-唾液酸受体的丰度，而人源ST3GalV基因与β l-4GalTl基因在MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞中共表达(图3)，进ー步提高了其表面的α 2，3-唾液酸受体丰度。实施例3TCID5(i的测定以及病毒噬斑的测定I材料与方法I. I毒株与试剂H5N1:野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005 (L株)由扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室保存(Zhang W J, Xue T, Wu X W, Zhang P H, Zhao G, Peng D X，Hu S L, WangX Qj Liu X W，Liu W B，Liu X F. Increase in viral yield in eggs and MDCK cells ofreassortant H5Nlvaccine candidate viruses caused by insertion of 38amino acidsinto the NA stalk. Vaccine，2011，29:8032-8041.)申请人承诺自申请日起向公众提供20年。
LR38(H5N1)疫苗候选株为扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室利用反向遗传学技术构建的重组弱毒株(Zhang W J, Xue T, Wu X W，Zhang P H, Zhao G, Peng DX, Hu S L, Wang X Q, Liu X ff, Liu W B, Liu X F. Increase in viral yield in eggs andMDCK cells of reassortant H5Nlvaccine candidate viruses caused by insertion of38amino acids into the NA stalk. Vaccine, 2011，29:8032-8041.) ,HA 和 NA 基因来源于野毒株A/Mallard/Huadong/lk/2005.申请人承诺自申请日起向公众提供20年。H9N2:野毒株A/Chicken/Shanghai/F/98 (F株)由扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病实验室保存(Shi Huoying, Liu XiuFan, ZhangXiaorong, et al. Generation of anattenuated H5Nlavian influenza virusvaccme with all eight genes from avianviruses, Vaccine, 25:7379-7384.)申请人承诺自申请日起向公众提供20年。TPCK修饰的胰蛋白酶购自Sigma公司。I. 2TCID50 的测定母本MDCK、MDCK-ST3GalIV 和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞分别铺于 96 孔板，待细胞密度至90%时用无血清DMEM洗两遍，洗去死细胞以及残留的血清，然后接种病毒。在冰浴的离心管中用无血清DMEM将病毒液作10倍梯度稀释，从10_卜10_1(1。同时在病毒稀释液中加入TPCK修饰的胰蛋白酶，使其终浓度为I μ g/mL。将病毒稀释液接种到96孔板中，每ー稀释度接种8个孔，100 μ L/孔，然后置于35°C、5%C02培养箱吸附I小吋，每隔20分钟就晃匀一次。吸附I小时之后，吸弃接种的病毒稀释液，加入无血清DMEM，每孔200 μ L，同时也加入TPCK修饰的胰蛋白酶，使其终浓度为I μ g/mL。H5N1亚型野毒株培养48小时、H5N1亚型重组弱毒株和H9N2亚型野毒株培养72小时之后分别吸取上清50 μ L至96孔血凝板中，加入等体积1%鸡红细胞悬液，30分钟后观察每孔的血凝結果，以血凝活性的有无代表细胞病变的有无，按Reed-Muench法计算出半数组织培养感染剂量(50%tissue cultureinfective dose, TCID50)结果。I. 3病毒噬斑母本MDCK 细胞、MDCK_ST3GalIV 细胞和 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞分别铺于6孔细胞培养板上，待细胞密度至90%时，弃去生长液，用无血清DMEM洗两遍，洗去死细胞以及残留的血清，然后接种病毒。以无血清DMEM稀释病毒贮存液(10—1 10_8)，加入终浓度I μ g/mL TPCK修饰的胰蛋白酶，每个稀释度接种3个孔，轻轻晃动6孔细胞培养板，使加入的病毒稀释液均勻铺于细胞表面上，置于35°C、5%C02培养箱吸附I小时。吸附I小时之后，吸弃接种的病毒稀释液，以无血清DMEM洗两遍；加入第一层覆盖液(I. 6%琼脂2倍2%DMEM=1 :1)，混匀之后铺于细胞表面使之完全覆盖，H5N1亚型重组弱毒株和H9N2亚型野毒株凝胶液中添加终浓度I μ g/mL TPCK修饰的胰蛋白酶，I. 5mL/孔，凝固之后，将细胞培养板倒置，置于35°C、5%C02培养箱培养。48 72小时之后取出细胞培养板，加入第二层覆盖液(16%琼脂'2倍2%DMEM : 1%。中性红=9 9 2),每孔I. 5mL,凝固之后，将细胞培养板倒置，置于35°C、5%C02培养箱培养。2Γ48小时之后取出细胞培养板，计数空斑，以噬斑形成单位(Plaque forming unit, PFU)表示病毒的感染滴度。2.结果2. ITCID5c^iJ定结果为了检测提高表面α 2，3-唾液酸的MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl细胞是否更适合禽流感病毒的増殖，我们选择在H5N1亚型和H9N2亚型毒株中选择几株测定TCID5tl (图5)。实验结果表明，不论是H5N1亚型还是H9N2亚型毒株在MDCK_hST3GalW_ β 4GalTl细胞上测定的滴度均高于在母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞上的滴度(p〈0. 05)，初步说明我们构建的MDCK-hST3GalIV_i3 4GalTl细胞系因为表面的α 2，3_唾液酸丰度提高而比母本MDCK细胞和MDCK-hST3GalIV细胞更适合禽流感病毒的増殖。2. 2病韋嗤斑实验结果表明，三株禽流感病毒在母本MDCK细胞、MDCK-ST3GalIV细胞和MDCK-hST3GalIV-^ 4GalTl 细胞上均能形成噬斑，但在 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞上比另两种细胞形成的噬斑个体更大，相同病毒稀释度的孔，出现噬斑的数量更多，时间也更早。PFU测定的结果显示，同种病毒在MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞上测定的结果最高(图6)。病毒噬斑实验结果进ー步表明我们构建的MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞系更适合禽流感病毒的増殖。 TCID50和噬斑形成试验的结果均表明，共表达人源ST3GalIV和β l_4GalTl基因的MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl细胞对禽流感病毒的敏感性显著高于母本MDCK细胞系和单表达 hST3GalIV 的 MDCK_hST3GalIV 细胞系，MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 细胞系更适合禽流感病毒的増殖。
权利要求
1.一种稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl，其含有 hST3GalIV 和 β l_4GalTl 基因序列；所述hST3GalIV 的基因序列如SEQ ID No: I所示,所述β l-4GalTl的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述细胞系的保藏号是CGMCC No. 5967。
2.权利要求I所述的稳定表达hST3GalIV和βl_4GalTl的MDCK细胞系的构建方法，其特征在于，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β l_4GalTl基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β l_4GalTl基因的细胞系 MDCK-hST3GalIV- β 4GalTl。
3.根据权利要求2所述MDCK-hST3GalIV-04GalTl细胞系的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤 1)MDCK细胞的转染及抗性细胞克隆的筛选 转染MDCK细胞密度在6孔板至80% 90%密度时用于转染；将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和编码β l-4GalTl基因序列的真核表达质粒各I μ g质粒于100 μ L无血清Opti-MEM培养基中，混匀后添加5 μ L FuGENEeHD转染试剂，充分混匀之后室温孵育15分；将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2 mL，置于37°C、5% CO2培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养； 抗性细胞克隆的筛选转染后36小时后用胰酶消化细胞，按1:10的比例传代至48孔细胞板中，继续用含O. 8 mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培养基为筛选培养基培养，每孔200 μ L，每3天换一次筛选培养基，G418持续筛选10-14天后，可见有抗性细胞生长；选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用于单克隆细胞筛选用含O. 8 mg/mL G418的筛选培养基将细胞密度稀释至I个/100 μ L，铺于96孔细胞板中50 μ L，每孔补加50 μ L筛选培养基；持续筛选10天后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单克隆筛选，以确保筛选出单克隆抗性细胞；选出的细胞依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板中扩大培养并冻存于液氮中； 2)MDCK-hST3GalIV-^4GalTl 细胞系的鉴定 提取上述所获具有抗性细胞的RNA，并反转录形成cDNA，以反转录成的cDNA为模板，用PCR方法分别通过PCR反应扩增人源β -半乳糖苷α 2，3_唾液酸转移酶IV基因和β 1-4半乳糖转移酶I基因；扩增结果表明MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl细胞系已成功构建， 用于扩增人源半乳糖苷0 2，3-唾液酸转移酶1￥0^136&11￥)的引物3G4F :5’ - ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’3G4R :5’ -TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’ 用于扩增人源β 1-4半乳糖转移酶1(β l-4GalTl)的引物B4G1F :5’ - ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’B4G1R:5’ - CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’。
4.权利要求I所述MDCK-hST3GalIV-i3l_4GalTl细胞系用于提高禽流感病毒分离株的生长滴度以及噬斑形成能力。
5.权利要求I所述MDCK-hST3GalIV-0l_4GalTl细胞系在生产疫苗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系及其构建方法，具体涉及将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和将编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK细胞系MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1，该细胞系可用于禽流感病毒疫苗株的大规模细胞化培养和生产。
文档编号C12N7/00GK102839157SQ20121037449
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年7月12日
发明者刘秀梵, 孙庆, 张文俊, 王晓泉, 胡顺林 申请人:扬州大学