专利名称：靶向去唾液酸糖蛋白受体的抗乙型肝炎病毒反义寡核苷酸的结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR，asialoglucoprotein receptor)治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
HBV感染严重威胁人类的健康，是导致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。目前仍然缺乏特别有效的治疗药物，因此新型抗HBV药物具有重大的社会和经济效益。
ASGPR为本实验室通过筛选从肝细胞中获得的几种靶标之一，通过验证发现其具有很好的特异性和可药性。国外文献报道ASGPR为乙型肝炎病毒进入肝细胞的受体之一，可发展成为抗HBV治疗的潜在作用靶点。
ASODN是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于ASODN作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
本发明的目的是，根据已公开的ASGPR基因mRNA序列，设计针对ASGPR的ASODN，通过抑制ASGPR mRNA和蛋白的表达，阻断HBV进入肝细胞，阻止HBV感染，抑制HBV复制和表达，为治疗慢性HBV感染提供新的特效的药物。
本发明的主要内容是，通过检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的ASGPRmRNA参考序列NM_001671，对其进行RNA二级结构的计算机模拟，选择了5个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。在Expedite 8909型自动DNA合成仪上合成硫代反义寡核苷酸序列(S-ASODN)，合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。采用转染有HBV DNA，可稳定表达HBV蛋白和完整Dane氏颗粒的HepG2.2.15细胞模型，对上述ASODNs进行活性筛选和评价。结果显示5条ASODNs中，AS2，AS3在0.8μmol/L-1.6μmol/L时对HBV DNA，HBsAg，HBeAg，ASGPR mRNA具有明显的抑制作用，AS2在0.2-0.8μmol/L浓度范围内，对HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及ASGPR mRNA和蛋白都具有特异性的剂量依赖性抑制活性。且当浓度为0.8μmol/L-1.6μmol/L时，AS2对HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。同时，设计了AS2对应的正义，随机序列，活性筛选结果显示AS2具有很好的特异性。
硫代反义寡核苷酸序列及性质编号 名称 ASGPR靶位 长度 性质反义序列1 AS1 1083-110220ATCC CAA TCC CGG ACC CCT GC2 AS2 749-768 20ACCT CCC AGG ACG TGA CCA CC3 AS3 460-479 20ATCT TCC CAC ATT GCC TCC CT4 AS4 171-190 20ATCC TTG GTC ATG ATA GGG CT5 AS5 456-475 20ACCC ACA TTG CCT CCC TGG GT6 S2 749-768 20SGGT GGT CAC GTC CTG GGA GG7 R2 -20RGAC CGG CCT AAC CCG CCT ACA反义；S正义；R随机序列根据本发明，针对ASGPR mRNA的ASODNs能特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，AS2的长度根据实验确定，本发明包含了与AS2具有相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了AS2硫代修饰。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他反义寡核苷酸及其衍生物形式。
根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
结合图表
本发明的具体实施方法图1硫代ASGPR反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用图2硫代ASGPR反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制作用图3硫代ASGPR反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用
图4硫代ASGPR反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中ASGPR mRNA的抑制作用图5硫代ASGPR反义寡核苷酸序列AS2，AS3对HepG2.2.15细胞中ASGPR蛋白的抑制作用图6硫代ASGPR反义寡核苷酸序列AS2对HepG2.2.15细胞增殖的影响图7硫代ASGPR反义寡核苷酸序列AS2特异性分析结果图8硫代ASGPR反义寡核苷酸序列AS2剂量依赖关系检测结果表15条硫代反义寡核苷酸序列及性质表2硫代反义寡核苷酸AS2的正义、随机序列实施例一材料与方法1.S-ASODN的设计和合成检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的ASGPR mRNA参考序列NM_001671，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，选择了5个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达(见表1)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，过程如下将硫代试剂(Beaucage regent，Transgenomic)溶于无水乙腈中使其终浓度为1g/100ml，置于DNA合成仪的AUX位置处，采用合成仪上提供的DNA硫化程序进行自动合成硫代寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
2.ASODN转染Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种6孔板，1.5×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM并设细胞对照、脂质体对照。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时。收集细胞培养液，-20℃保存备用。提取Hep2.2.15细胞总RNA(Trizol RNA提取试剂盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15细胞总蛋白，-20℃保存备用。
3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用检测取细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为P15’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；荧光探针序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q5’-GTA GTT TCCGGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。
4.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用检测取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAgELISA检测试剂盒(华美公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原，e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原，e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入显色液A50μl，再加入显色液B50μl，37℃孵育15min，加入终止液50μl，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR＝(A450对照-A450给药)/A450对照计算抑制率。
5.ASODN对Hep2.2.15细胞中ASGPR mRNA的抑制作用检测按照Trizol试剂盒(Invitrogen)说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下各取总RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μl，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscriptII0.5μl，42℃温育1h，最后70℃变性15min。反转录产物取0.5μl作为PCR扩增的模板，以看家基因GAPDH作为内标进行双重PCR。靶基因ASGPR上游引物为5’CTGGACAATGAGGAGAGTGAC3’，下游引物为5’CTGGACAATGAGGAGAGTGAC3’，扩增片断为651bp。GAPDH的上游引物为5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物为5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，扩增片断449bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg2+浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃ 20s，61℃30s，72℃20s，循环26次，最后72℃延伸2min。2％琼脂糖胶(Sigma)电泳检查，利用ImageQuant软件读取各电泳条带信号值V，根据IR＝(1-VtsVcs/VtβVcβ)×100％计算抑制率。其中Vts表示给药组ASGPR扩增条带的信号值，Vcβ表示细胞对照组GAPDH扩增条带的信号值，Vtβ表示给药组GAPDH扩增条带的信号值，Vcs表示细胞对照组ASGPR扩增条带的信号值。
6.ASODN对Hep2.2.15细胞中ASGPR蛋白的抑制作用检测RIPA-PICT(Pharmacia)提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔50μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(PROTRANBA-S83 Reinforced NC，Schleicher&Schuell)上。4℃封闭过夜，封闭液组成10％脱脂奶粉，1×TBST。然后与羊抗人ASGPR抗体(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗体(Sigma)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗羊或抗鼠二抗(中山)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。
结果1.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列AS1-AS5，分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，同时设立阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测AS1-AS5对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用。重复三次实验，结果见图1。图中显示，脂质体对照(LIP)对HBV DNA无明显抑制作用，AS2，AS3对HBV DNA的抑制作用强于10μM拉米夫定对细胞培养液中HBV DNA的抑制作用。
2.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列AS1-AS5，分别以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM给药处理HepG2.2.15细胞，同时设立阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，HBsAgELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBsAg的表达情况。重复三次实验，25μM拉米夫定对Hep2.2.15细胞培养液中HBsAg的平均抑制率为53.76％，脂质体对照(LIP)对HBsAg无明显抑制作用，AS1-AS5对HBsAg的抑制作用检测结果见图2，图中显示AS2，AS3对细胞培养液中HBsAg具有较高的抑制率，AS2在0.8μM给药时对培养液中HBsAg的平均抑制率大于50％，且大于25μM拉米夫定对培养液中HBsAg的抑制率，AS3在1.6μM浓度时对HBsAg的平均抑制率大于50％。
3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列AS1-AS5，分别以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM给药处理Hep2.2.15细胞，72小时后收集细胞培养液，HBeAgELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBeAg的表达情况。重复三次实验，25μM拉米夫定对Hep2.2.15细胞培养液中HBsAg的平均抑制率为51.21％，脂质体对照(LIP)对HBeAg无显著抑制作用，AS1-AS5对HBsAg的抑制作用检测结果见图3。图中显示AS2，AS3对细胞培养液中HBeAg具有较高的抑制率，1.6μM给药时，对培养液中HBeAg的抑制率大于等于50％，1.6μM AS2对HBeAg的抑制率大于拉米夫定的抑制率。
4.ASODN对Hep2.2.15细胞中ASGPR mRNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列AS1-AS5，分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，72h后提取总RNA，反转录后以看家基因GAPDH为内标(扩增片段459bp)进行双重PCR(靶基因ASGPR扩增片段为651bp)，扩增产物2％琼脂糖电泳分析，应用公式(详见实验方法5)计算各种处理对靶基因mRNA表达的抑制率(见图4)。从图中可以看出AS2，AS3对ASGPR mRNA的表达起到较好的抑制作用，而AS1，AS5无抑制作用，AS4抑制率很低，脂质体对照(LIP)无显著抑制效应。
5.ASODN对细胞ASGPR蛋白的抑制作用根据上述实验，挑选AS2，AS3分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，72h后提取总RNA，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以β-actin(43kD)为对照，通过Western Blot方法检测硫代反义寡核苷酸对靶蛋白ASGPR表达量的影响。由图5可见，AS2可显著抑制ASGPR蛋白的表达，而AS3对ASGPR蛋白没有明显的抑制作用。
实施例二材料与方法1.ASODN的设计与合成根据实施例一结果，选择效果较好的反义寡核苷酸序列AS2，合成其正义寡核苷酸以及随机序列(见表2)。所有硫代寡核苷酸的合成同实施例一。
2.硫代反义寡核苷酸序列AS2的细胞毒性检测Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37 ℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸AS2的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM并设细胞对照，每浓度重复三孔。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时后，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，避光培养1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，在转染ASODN后在倒置显微镜下每日观察细胞形态。
2.硫代反义寡核苷酸序列AS2的特异性考察硫代反义寡核苷酸序列AS2及其正义(S2)，随机(R2)序列分别以0.8μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例一。收集培养液，提取总RNA和总蛋白，参照实施例一的方法，检测AS2及其正义，随机序列对细胞培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用，AS2及其正义，随机序列对ASGPR mRNA以及蛋白的抑制作用。
3.硫代反义寡核苷酸序列AS2的剂量依赖性检测硫代反义寡核苷酸序列AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例一。收集培养液，提取总RNA和总蛋白，参照实施例一的方法，检测AS2不同浓度对细胞培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用，以及对ASGPR mRNA以及蛋白的抑制作用。
结果1.硫代反义寡核苷酸AS2对HepG2.2.15细胞增值的影响硫代反义寡核苷酸AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM处理细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有显著变化。细胞增殖实验检测结果见图6。图中显示，在0.2μM-10μM范围内，各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。
2.硫代反义寡核苷酸序列AS2的特异性硫代反义寡核苷酸序列AS2对ASGPR mRNA，蛋白以及培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用特异性检测结果见图7。图中显示，AS2的正义和随机硫代寡核苷酸序列处理组细胞中ASGPR mRNA、蛋白，以及培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg与正常细胞对照无明显差异。而硫代反义寡核苷酸序列AS2具有很好的抑制作用(抑制率≥50％)。
3.硫代反义寡核苷酸序列AS2对HBV复制和表达影响的剂量依赖性。
硫代反义寡核苷酸序列AS2以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM给药处理HepG2.2.15细胞后，检测系列浓度S-ASODN对HepG2.2.15细胞中ASGPR mRNA、ASGPR蛋白以及培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用，结果见图8。图中显示细胞培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及细胞中ASGPR mRNA及蛋白表达量随着硫代反义寡核苷酸序列AS2浓度的增加而递减，显示出很明显的剂量依赖关系。
权利要求
1.与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)mRNA(GeneBank接受号NM_001671)互补的寡核苷酸，其长度是10-30个碱基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反义寡核苷酸序列及性质ASGPR靶位序号 名称 长度(nt)特性序列(5’-3’)(nt)1AS1 1083-110220 A TCC CAA TCC CGG ACC CCT GC2AS2 749-768 20 A CCT CCC AGG ACG TGA CCA CC3AS3 460-479 20 A TCT TCC CAC ATT GCC TCC CT4AS4 171-190 20 A TCC TTG GTC ATG ATA GGG CT5AS5 456-475 20 A CCC ACA TTG CCT CCC TGG GT
2.根据权利要求书1中的寡核苷酸，其最佳序列为AS2，AS3
3.根据权利要求书2中的寡核苷酸，其最佳序列为AS2
4.根据权利要求书1中的寡核苷酸，经不同化学修饰后，可以用于治疗乙型肝炎及相关性疾病。
5.权利要求书3中的寡核苷酸化学修饰物可以为硫代修饰。
6.权利要求4中经化学修饰后的寡核苷酸可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于乙型肝炎及其相关性疾病的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)抗乙型肝炎病毒(HBV)反义寡核苷酸的结构和用途。根据文献报道，ASGPR为治疗HBV感染的潜在靶点。本实验室通过筛选和验证发现其具有很好的特异性和可药性。因此，本实验室设计合成了靶向ASGPR的反义寡核苷酸，采用转染有HBV DNA，可稳定表达HBV蛋白以及完整Dane′s颗粒的HepG2.2.15细胞，对5条反义寡核苷酸序列进行了活性筛选及评价，首次发现互补于ASGPR mRNA特定功能区域的寡核苷酸AS2在培养的HepG2.2.15细胞中能有效地抑制乙型肝炎的复制和表达。因此，本发明涉及到靶向ASGPR mRNA抗HBV感染的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为治疗乙型肝炎病毒相关性疾病，减小乙型肝炎相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号A61P1/16GK1587408SQ200410058300
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者王升启, 杨静, 伯晓晨, 张敏丽, 丁小然 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所