含有唾液酸的糖链的制造方法
【专利摘要】已知唾液酸以α2,3连接或α2,6连接于糖链的非还原末端的糖链的重要性，存在对此糖链化合物的工业化生产的需求。尤其，在例如制造糖蛋白药物时，在控制唾液酸的连接模式（α2,6连接或α2,3连接）的同时，大规模生产均一结构的糖链是不可或缺的。对于3分支型或4分支型的N-型复合型糖链，一般认为难以化学合成在所有的非还原末端均具有唾液酸的糖链，目前尚未报道过化学合成的该糖链。酶学上亦难以有效率地制备此糖链。本发明中，新发现唾液酸转移酶具有在CMP存在下分解反应产物中的唾液酸的活性，发现可通过酶而分解CMP，从而有效率地制造含唾液酸的糖链。进而还发现，对于传统上难以合成的以α2,6连接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖链，可以以2分支型糖链为原料，进行糖链延长反应，在不进行各步酶反应后的纯化的情况下，以一锅法合成而高产率地进行制备。
【专利说明】含有唾液酸的糖链的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及可应用于糖蛋白等药物、分析仪器用的标准品、学术用试剂、糖链阵列等的糖链的合成法。
【背景技术】
[0002]先前的大量研究表明连接于蛋白质的糖链结构在该蛋白质的生物活性的机能上扮演着重要角色。并且，糖链也称为“细胞的脸”。已知在细胞表面上表达的糖链与细胞间相互作用或信号传递、发育或分化、受精、癌转移等相关。关于哺乳类的糖链修饰，为人熟知的主要是Asn连接型、黏蛋白型、蛋白多糖型糖基化和其它的类型。这些修饰通过不同的生物合成途径，形成它们各自固有的糖链结构。已知的是在这样的糖链结构的非还原末端侧，加成海藻糖或唾液酸等糖。
[0003]唾液酸是对作为连接有氨基或羧基的特殊的9碳糖的神经氨酸中氨基或羟基被取代的化合物的总称。5位的氨基被乙酰化的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)可能是自然界中最多的形式。另外，还已知有5位的氨基是以乙醇酰基修饰的N-乙醇酰基神经氨酸或去氨基神经氨酸KDN等各种结构。
[0004]据报道，含有唾液酸的糖链不仅存在于人类或老鼠等哺乳类中，还存在于脊椎动物或棘皮动物，甚至原生生物或具有革兰氏阴性病原性的一些细菌中。通过唾液酸转移酶制备该含有唾液酸的糖链。唾液酸转移酶用加成于胞苷一磷酸(CMP)的唾液酸作为底物供体，通过存在于唾液酸供体的2位的醛基，将唾液酸转移至例如半乳糖的3位或6位、N-乙酰半乳糖胺的6位、或另一唾液酸的8位等。例如转移唾液酸于半乳糖的3位的酶被称为α _2，3-唾液酸转移酶，转移唾液酸于半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的6位的酶被称为α-2，6-唾液酸转移酶，转移唾液酸于另一唾液酸的8位的酶被称为α-2，8-聚唾液酸转移酶。其中，关于α-2，6-唾`液酸转移酶，已知人类中作为转移唾液酸于半乳糖的6位的酶，有ST6Gal-1和ST6Gal-1I，及作为转移唾液酸于N-乙酰半乳糖胺的6位的酶，有ST6GalNAc-1、ST6GalNAc-11、ST6GalNAc-1II 和 ST6GalNAc_IV。
[0005]ST6Gal-1将作为具有连接于4位的半乳糖的N-乙酰葡糖胺的N-乙酰乳糖胺结构(Gal β l-4GlcNAc)识别为底物受体，从而修饰一些糖脂质或N-连接型糖链的非还原末端结构。其对底物受体的特异性主要是利用2分支或3分支的N-连接型糖链进行分析。据报道，唾液酸容易转移于α?，3连接的甘露糖的分支上的乳糖胺(参考非专利文献I)。关于2分支或3分支的N-连接型糖链的制备，因为例如难以从天然物中提取糖基转移酶的底物，和酶的大规模制备法尚未确立等，所以很难有效率地大量地生产这些糖链。
[0006]另一方面，关于4分支之N-连接型糖链的α 2，6唾液酸转移反应，已通过使用来自牛的ST6Gal-1来进行研究。在糖链的4个N-乙酰乳糖胺结构中，唾液酸最容易转移至在α?，3连接的甘露糖上以β?，2连接加成的N-乙酰乳糖胺结构上，然后是在al，3连接的甘露糖上以β?，4连接加成的N-乙酰乳糖胺结构，进一步的是在al，6连接的甘露糖上加成的2个N-乙酰乳糖胺结构中任一者，但未发现含有四分子唾液酸的产物(参考非专利文献2)。另外，人ST6Gal-1，以及ST6Gal-1I已被报道具有底物特异性(参考非专利文献3和4。)。但对于以4分支的N-连接型糖链为受体底物的唾液酸加成还未进行研究。
[0007]据报道，有关ST6Gal-1的因CMP的产物抑制，其被0.25mM的CMP抑制49% (参考非专利文献5)，或抑制71% (参考非专利文献6)。
[0008]另一方面，作为来自细菌的α 2，6-唾液酸转移酶，报道有Photobacteriumdamsel a JT0160 (参考非专利文献 7)、Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (参考非专利文献8)等，但关于以4分支的N-连接型糖链为受体底物的唾液酸的加成，它们中的任一种均未被研究。
[0009]另外，关于4分支的N-连接型糖链的α 2，3唾液酸转移反应，将其中四分子的唾液酸以α 2，3连接加成的4分支N-连接型糖链加成于红细胞生成素(EPO)等糖蛋白(参考非专利文献9)，据报道，唾液酸加成对糖蛋白在血中的稳定性有贡献(参考非专利文献10)。虽然这些结构为天然中存在的结构，但未见有实际上大量制备四分子的唾液酸以α 2，3连接加成的4分支的N-连接型糖链的报告例。这是因为，就成本而言，用作原料的EPO等很难进行大量的制备，并且在酶合成中，也很难由其他天然物廉价地制备成作为受体的去唾液酸4分支型N-连接型糖链。并且，已知的是在EPO中也混合存在加成于糖蛋白的α 2，3连接及α 2，6连接的4分支型N-连接型糖链等(参考非专利文献11)。
[0010]关于加成于抗体药物或细胞因子等糖蛋白药物中的N-型糖链的唾液酸的连接模式，有报道称加成α 2，6连接唾液酸的蛋白质比加成α 2，3连接唾液酸的蛋白质在血中消失得更快。对于糖蛋白从血中清除，糖蛋白通过与体内的凝集素(Lectins)结合而摄入细胞内，最终被代谢。因此，具有α 2，6连接的唾液酸的糖蛋白有希望通过结合特异的凝集素而被以特异于器官的方式摄入，以及有希望灵活地用于药物传递。另外，已知的是糖蛋白根据分子尺寸，在肾脏中随尿液排出。据报道，红细胞生成素的表观分子尺寸随其糖链的分支数目的增多而增加，从而导致在血中清除得慢。因此，具有α 2，3连接和/或α 2，6连接的唾液酸的糖链，尤其是具有四分子的α 2，3连接和/或α 2，6连接的唾液酸的4分支N-型糖链的合成，有希望应用于生产不同的脏器摄入效率的糖蛋白药物。
[0011]另外，人流感病毒可识别在细胞表面表达的糖链中的α 2，6连接的唾液酸而进行感染，而来自鸟类的流感病毒可识别α 2，3连接的唾液酸而进行感染。不仅流感病毒，许多病毒也通过识别待感染细胞的糖链结构而感染该细胞，所以有必要使用各种糖链，来调查与病毒的结合特异性。因此，具有α 2，3连接或α 2，6连接的唾液酸的糖链可作为用于研究病毒结合特异性的材料，而应用于病毒检测等。
[0012][文献列表]
[0013][非专利文献]
[0014][非专利文献 I]:van den Eijnden DH et al., Biochem Biophys ResCommun.，92(3)，839-45(1980)
[0015][非专利文献 2] Joziasse et al.，JBC, 262，2025-2033 (1987)
[0016][非专利文献 3]:Takashima et al.，JBC, 277，45719-45728 (2002)
[0017][非专利文献 4] =Krzewinsk1-Recchi et al.，EJB, 270，950-961 (2003)
[0018][非专利文献 5]:Miyazaki T et al., Glycobiology, 18, 187-194(2008)
[0019][非专利文献 6]:Kleineidam et al., Glycoconj.J., 14, 57-66 (1997)[0020][非专利文献 7]:Yamamoto T et al.，BBB, 62，210-214 (1998)
[0021][非专利文献 8] =Yamamoto T et al.，Glycobiology, 17，1167-1174 (2007)
[0022][非专利文献 9]:Takeuchi et al.，J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)
[0023][非专利文献 10]:Tsuda et al.，Eur J Biochem.，188 (2)，405-11 (1990)
[0024][非专利文献 11]:Takeuchi et al., J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)
【发明内容】
[0025](本发明要解决的技术问题)
[0026]已知具有在糖链的非还原末端的α 2，3连接或α 2，6连接唾液酸的糖链是很重要的。对于这些糖链化合物，尽管有可能是天然存在的，但由于自天然物提取有作为天然物的稀少性、取得的困难性、安全性等问题，因此需要它们的工业化生产。尤其，制造抗体医药品或细胞因子等糖蛋白药物或研究病毒的结合特异性等时，不可避免地需要通过控制唾液酸的连接模式(α 2，6连接或α 2，3连接)，量产均一结构的糖链。尤其，对于3分支型或4分支型的N-型复合型糖链，一般认为难以从化学上合成所有的非还原末端都具有唾液酸的糖链，例如对于所有的非还原末端都具有α 2，6连接唾液酸的4分支型N-型复合型糖链，并没有化学合成的报道。此外，酶学上也难以有效率地制备这些具有唾液酸的3分支型或4分支型的糖链。
[0027]解决问题的方法
[0028]本发明的发明人等新发现了唾液酸转移酶在CMP存在下分解反应产物上的唾液酸的活性，还发现所生成的CMP可通过酶而分解，从而可有效率地制造含唾液酸的糖链。本发明的发明人等进一步发现对于传`统上难以合成的以α 2，6连接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖链，可以通过包含以2分支型糖链为原料的糖链延长反应的一锅法合成，无需在各步酶反应后进行精制，从而可高产率地制备。
[0029]亦即，本发明涉及制造具有唾液酸的第二糖链或其衍生物的方法，包括
[0030]在唾液酸转移酶和磷酸酶(phosphatase)存在下，使第一糖链或其衍生物与CMP-唾液酸进行反应，
[0031]以将唾液酸转移至所述第一糖链或其衍生物的非还原末端。
[0032]在此，根据本发明的具有唾液酸的第二糖链或其衍生物的制造方法的一个实施方案，所述第一糖链或其衍生物为3分支型或4分支型的N-连接型复合型糖链或它们的衍生物。
[0033]另外，根据本发明的具有唾液酸的第二糖链或其衍生物的制造方法的一个实施方案，所述第一糖链或其衍生物为由下式所表示的化合物:
[0034]
【权利要求】
1.具有唾液酸的第二糖链或其衍生物的制造方法，所述制造方法包括: 在唾液酸转移酶和磷酸酶的存在下，使第一糖链或其衍生物与CMP —唾液酸进行反应， 以将唾液酸转移至所述第一糖链或其衍生物的非还原末端。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一糖链或其衍生物为3分支型或4分支型的N-连接型复合型糖链或其衍生物。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一糖链或其衍生物为下式所表示的化合物:
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖链或其衍生物为3分支型或4分支型的N-连接型复合型糖链，且为在糖链的各非还原末端都具有唾液酸的化合物或其衍生物。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖链或其衍生物为由下式所表示的化合物，
6.具有唾液酸的糖链或其衍生物的制造方法，所述方法包括以下步骤:(a)在糖基转移酶的存在下，使由下式所表示的糖链
7.在非还原末端具有唾液酸的糖链或其衍生物的制造方法，所述方法包括以下步骤: Ca)在MAGAT4和MGAT5的存在下，使去半乳糖2分支复合型糖链或其衍生物与UDP-GlcNAc反应的步骤； (b)在β4GalTl的存在下，使所述步骤(a)的产物与UDP-Gal反应的步骤；和 (c)在唾液酸转移酶和磷酸酶的存在下，使上述步骤(b)的产物与CMP-唾液酸反应的步骤。`
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述唾液酸转移酶为α2，6唾液酸转移酶。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述唾液酸转移酶为人源唾液酸转移酶。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述唾液酸转移酶为ST6Gal-1。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述CMP-唾液酸为CMP-Neu5Ac。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述磷酸酶为碱性磷酸酶。
13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述磷酸酶为来自大肠杆菌的碱性磷酸酶。
14.化合物，所述化合物在4分支型的N-连接型复合型糖链或其衍生物的各非还原末端都具有唾液酸。
15.化合物，所述化合物在4分支型的N-连接型复合型糖链或其衍生物的各非还原末端都具有α 2，6连接型的唾液酸。
16.由下式所表示的化合物:
【文档编号】C12N15/09GK103502462SQ201280011234
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月27日 优先权日:2011年3月4日
【发明者】千叶靖典, 高桥佳江, 成松久, 深江一博 申请人:株式会社糖锁工学研究所