供含在跨弹性蛋白酶原肽和成熟的弹性蛋白酶蛋白 质之间的连接的区域中的切割结构域或切割位点的原弹性蛋白酶蛋白质。原弹性蛋白酶蛋 白质还可含分泌用信号序列。所述蛋白质被认为是前原弹性蛋白酶蛋白质。前原弹性蛋白 酶蛋白质还可含酵母a因子原肽，及任选的信号序列与弹性蛋白酶原肽之间的间隔序列。 本发明的弹性蛋白酶蛋白质还可含图2所示的核心模块成分之外的成分。例如，弹性蛋白 酶蛋白质可含用于纯化的表位标签或组氨酸标签。还应知本发明的弹性蛋白酶蛋白质无需 含图2所示全部成分，但一般含图2中所示的至少一种成分（包括例如但不限于成熟的弹 性蛋白酶或原弹性蛋白酶序列）。本发明的例示弹性蛋白酶蛋白质下文第8部分的实施方 式1~12、28~39和68~69所述，包括下文第8部分的实施方式13~27所述的I型原 弹性蛋白酶蛋白质。
[0027] 本文含盖了编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸、制备和纯化所述蛋白质、重 组细胞和细胞培养物上清的方法、含弹性蛋白酶蛋白质的组合物（例如药物组合物、单元 齐U、制剂）、所述蛋白质用于治疗目的的用途和含所述蛋白质、制剂、药物组合物和单元剂的 试剂盒。编码本发明的弹性蛋白酶蛋白质的核酸例示于下文第8部分的实施方式40~67， 包括载体（见例如实施方式70~72)。例示于下文第8部分的还有重组细胞（见例如实施 方式73~84)、含弹性蛋白酶蛋白质的细胞上清（见例如实施方式88)。制备弹性蛋白酶 蛋白质的方法例示于下文第8部分的实施方式89~224、261~276和347~373。制备弹 性蛋白酶制剂的方法例示于下文第8部分的实施方式225~260。制备药物组合物的方法 例示于下文第8部分的实施方式374~385。含弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物例示于下 文第8部分的实施方式277~313和386,且单元剂例示于下文第8部分的实施方式415~ 420。弹性蛋白酶蛋白质制剂例示于下文第8部分的实施方式324~346。弹性蛋白酶蛋白 质用于治疗目的的用途例示于下文第8部分的实施方式387~414。含所述蛋白质的试剂 盒例示于下文第8部分的实施方式421~424。
[0028] 本发明的有关药物组合物和/或具有SEQIDN0 :64和69的原弹性蛋白酶蛋白质 的方面例示于下文第8部分的实施方式425~472 ;而所述实施方式可应用于本文公开的 其他弹性蛋白酶蛋白质序列和组合物。
[0029] 本文描述的制备方法长包括活化步骤，其中所述活化肽从原弹性蛋白酶序列除去 /从成熟的弹性蛋白酶序列分离出，由此产生成熟的弹性蛋白酶蛋白质。本文描述的活化步 骤可为自体活化步骤（即通过弹性蛋白酶活性进行）或非自体活化步骤（即非弹性蛋白酶 介导的，例如通过胰蛋白酶进行）。
[0030] 在某些方面，本发明提供含编码弹性蛋白酶蛋白质（包括但不限于SEQIDN0: 6~9、64~69、88~91或98~103中任一蛋白质）的核苷酸序列的核酸分子，所述弹性 蛋白酶蛋白质包括：（i)含活化肽序列（含弹性蛋白酶识别序列）的弹性蛋白酶原肽，其可 操作连接于（ii)具有弹性蛋白酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所述蛋白质任选还包括可 操作连接于所述弹性蛋白酶原肽的信号序列（如酵母a-因子信号肽，且由SEQIDN0 :34 的氨基酸序列所例示）。所述a-因子在本文中有时被称为"a-因子（alpha-因子）"或 "a交配因子"或"a-交配因子"。在某些特定实施方式中，所述蛋白质含非弹性蛋白酶原 肽，如酵母a-因子原肽。在某些特定实施方式中，所述蛋白质可含一种或多种间隔序列。 间隔序列可包括但不限于：Kex2和STE13蛋白酶切割位点。在特定实施方式中，可使用Kex2 间隔子。在另一实施方式中，如图1B所示，Kex2间隔子可被可操作连接于STE13间隔子。 信号肽序列和非弹性蛋白酶原肽序列以SEQIDN0 :51或97的氨基酸序列例示。含信号肽 序列、非弹性蛋白酶原肽序列和间隔序列的肽以SEQIDN0 :50或96的氨基酸序列例示。
[0031] 在其他特定实施方式中，所述信号序列是哺乳动物分泌信号序列，如猪或人I型 弹性蛋白酶（与I型胰腺弹性蛋白酶互换使用）信号序列。
[0032] 弹性蛋白酶识别序列优选为I型胰腺弹性蛋白酶识别序列。
[0033] 在特定实施方式中，所述具有I型弹性蛋白酶活性的蛋白质是成熟的人I型弹性 蛋白酶，例如SEQID勵：1、4、5、84或87的氨基酸序列的蛋白质。
[0034] 本发明还提供含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质含：（i)在比 赤酵母中可操作的信号序列，其可操作连接于（ii)含弹性蛋白酶识别序列（包括但不限于 SEQIDNO: 11~23和93的氨基酸序列）活化序列（包括但不限于SEQIDNO:23、72、73 或80的氨基酸序列），其又连接于（iii)成熟的人I型弹性蛋白酶的氨基酸序列。在优选 实施方式中，蛋白酶识别序列是人I型弹性蛋白酶识别序列，最优选为SEQIDNO:20的弹 性蛋白酶识别序列。
[0035] 还提供了由本发明的核酸编码的原弹性蛋白酶蛋白质（任选含信号序列，由此呈 现为前原弹性蛋白酶蛋白质）和成熟的弹性蛋白酶蛋白质，及含所述成熟的弹性蛋白酶蛋 白质的组合物（例如药物组合物、制剂和单元剂）。
[0036] 在优选实施方式中，所述原弹性蛋白酶蛋白质或成熟的弹性蛋白酶蛋白质不具有 N-端甲硫氨酸残基。但在另一实施方式中，所述原弹性蛋白酶蛋白质或成熟的弹性蛋白酶 蛋白质具有N-端甲硫氨酸残基。
[0037] 以下表1总结了本发明中使用的序列标识。本发明的优选蛋白质含以下表1所列 SEQIDN0 :1~32、34、37~73、77、78、82~92和98~105中任一个，或由以下表1所列 SEQIDN0 :1~32、34、37~73、77、78、82~92和98~105中任一个构成，或部分或全部 由SEQIDN0 :33和SEQIDN0 :81的核苷酸序列编码。
[0038]
【主权项】
1. 蛋白质，其含： (i) 含弹性蛋白酶识别序列的弹性蛋白酶活化序列，其可操作连接于 (ii) 成熟的弹性蛋白酶的氨基酸序列。
2. 权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQIDNO:11。
3. 权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQIDNO:12。
4. 权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQIDNO:13。
5. 权利要求1的蛋白质，其中所述弹性蛋白酶识别序列含SEQIDNO:93。
6. 药物组合物，其含： (i) 治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和 (ii) 药学可接受载体， 所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项： (a) 所述组合物中无胰蛋白酶； (b) 所述组合物基本上无胰蛋白酶； (c) 所述组合物无由SEQIDNO:2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质； (d) 所述组合物基本上无由SEQIDNO:2、3、37、38、70和/或71构成的任意蛋白质； (e) 所述组合物无细菌蛋白质； (f) 所述组合物基本上无细菌蛋白质； (g) 所述组合物无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质； (h) 所述组合物基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
7. 药物组合物，其含： (i) 治疗有效量的成熟的人I型弹性蛋白酶，和 (ii)药学可接受载体， 所述药物组合物的特征在于具有下列特征中的至少1项： (a) 所述组合物中无胰蛋白酶； (b) 所述组合物基本上无胰蛋白酶； (c) 所述组合物无由SEQIDNO:70和71构成的任意蛋白质； (d) 所述组合物基本上无由SEQIDNO:2和3构成的任意蛋白质； (e) 所述组合物无细菌蛋白质； (f) 所述组合物基本上无细菌蛋白质； (g) 所述组合物无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质； (h) 所述组合物基本上无所述成熟的人I型弹性蛋白酶之外的哺乳动物蛋白质。
8. 权利要求6或权利要求7的药物组合物，其特征在于特征（a)~（h)中的至少2项。
9. 权利要求8的药物组合物，其中所述至少2项特征包括（a)和（c)。
10. 权利要求8的药物组合物，其中所述至少2项特征包括（b)和（d)。
【专利摘要】本发明涉及制备、纯化、配制生物学上有活性的重组弹性蛋白酶蛋白质的方法及所述生物学上有活性的重组弹性蛋白酶蛋白质的用途。描述了制备治疗学有用的弹性蛋白酶蛋白质的重组方法及含所述弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物。还公开了新的重组弹性蛋白酶蛋白质及蛋白质制剂。描述了使用含本发明的弹性蛋白酶蛋白质的药物组合物治疗和预防生物管道疾病的方法。
【IPC分类】A61K38-48, A61P43-00, C12N9-66
【公开号】CN104711243
【申请号】CN201410767370
【发明人】F·N·弗兰纳诺, K·布兰德, M·D·翁, B·C·丁
【申请人】普罗特昂治疗公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2008年12月4日
【公告号】CA2707051A1, CN101918547A, CN101918547B, CN103952388A, EP2229440A2, EP2229440B1, EP2229440B9, EP2666854A1, US8501449, US9057060, US20090162343, US20110008315, US20110081705, US20130336956, US20150166974, WO2009079220A2, WO2009079220A3