用于乙型肝炎病毒感染治疗的导向rna靶点的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般涉及分子生物学、细胞生物学和基因治疗领域。更具体地，本发明涉 及用于乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV)感染治疗的15个导向RNA(shortguide RNA，gRNA)靶点，通过这些靶点获得的导向RNA及其重组表达载体，以及应用这些靶点和导 向RNA以各种方式获得的用于HBV感染治疗的药物和方法。
【背景技术】
[0002] 目前针对HBV的抗病毒药物为核苷酸类似物和干扰素。虽然，核苷酸类似物 (Nucleotide,NAs)可通过抑制HBV聚合酶的活性高效抑制HBV复制，但其对HBV共价闭合 环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)无作用，由于cccDNA是HBV复制的 模版，其半衰期可达数年至数十年，所以短期内NAs不能清除HBV，机体免疫力低下或耐药 等因素均可诱发HBV再激活和肝炎复发。尽管，干扰素a(IFN-a)可清除一部分感染者体 内的HBV，且体外实验证实高剂量的IFN-a可降解CCCDNA，但其清除比例较低（〈8% )，且 由于高剂量的IFN-a具有很强的副作用，机体不能耐受。因此，HBVcccDNA是慢性乙型肝 炎（乙肝）治疗过程中的一大障碍，目前尚无高效清除HBVcccDNA的方法。
[0003] CRISPR/Cas系统，是最近几年来发展起来的一种新的可对基因组DNA进行靶向 编辑的工具。该系统原本是存在于细菌中的一种对付病毒等外来DNA的防御系统。在一 些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作"规律间隔成簇短回文重复序 列"（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)。这些重 复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。并且，这些序列 在被转录成为RNA后，能够与宿主细菌产生的一类称为Cas(CRISPRassociated)的蛋白 质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA(guideRNA， gRNA)。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，CRISPR/Cas系统可以识别外源核 酸中的特殊片段，该特殊片段中含有原型间隔序列峨邻基序（即ProtospacerAssociated Motif,PAM)。Cas蛋白由此到达PAM识别序列的特定位点而对外来DNA进行定点、特异的切 害J，达到DNA序列的修饰或者编辑的目的。
[0004] 严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为来自于间隔区、 识别入侵DNA的crRNA(CRISPRRNA,crRNA)，另一部分为活化Cas蛋白所需的 tracrRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)。在人工构建的CRISPR_Cas9 系统载体中， 这两段RNA可融合为一条，称为导向RNA(guideRNA，gRNA)。
[0005] 细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌（Streptococcus pyogenes)的由Cas9蛋白参与的系统被人们研宄的最为透彻。因此人们对它进行了改造， 将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。在转入宿主细胞后， 产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因 编辑的作用。
[0006] 以CRISPR-Cas系统为基础将有望开发出新型的更有效地用于HBV感染治疗的方 法，该方法需要提供有效清除HBVcccDNA的gRNA靶点。本发明满足了这一要求，提供了用 于该目的的gRNA靶点、gRNA和重组表达载体等。
【发明内容】
[0007] 为了解决以上问题，本发明提供了靶向HBV的gRNA靶点，用于构建包含或互补本 发明涉及的gRNA靶点的表达载体、重组载体和宿主细胞，以及可获得用于获得包含有由本 发明涉及的gRNA靶点获得的治疗药物。
[0008] 本发明提供的gRNA靶点可靶向HBV，可破坏共价闭合环状DNA并抑制HBV复制。 本发明提供的gRNA靶点是通过以下方法获得的：选择设计可靶向HBV的gRNA靶点序列，通 过设计合适的引物构建gRNA，并克隆入表达载体获得相应的gRNA表达载体，将该载体分别 与HBV表达载体进行共转染实验，通过检测HBV表面抗原水平及鉴定抑制特异性等分析筛 选获得合适的gRNA靶点。
[0009] 本发明提供一种靶向HBV的导向RNA靶点序列，其选自以下序列之一：
[0010] (l)SEQIDNOs:l-15中任一个所述的序列；
[0011] (2)与⑴中序列具有至少70% (优选至少80%、85%、90%、95%、99%或更高） 一致性的序列；
[0012] (3)在严格条件下或者高度严格条件下与（1)中序列能够杂交的核苷酸序列；
[0013] (4)与⑴中的序列仅有1-3个（优选1-2个，更优选1个）核苷酸不同的序列； 以及
[0014] (5)与（1)-⑷中序列的片段或者互补序列。
[0015] 在一个具体方面，所述gRNA靶点序列可以靶向HBVA、B、C或者D型基因。
[0016]在本发明的一个实施方式中，gRNA靶点序列N18_2(l符合如下结构：5'-Nx-NGG-3'， NGG中N表示A、G、C和T中的任一种，Nx中N表示A、G、C和T的任一种，x= 18-20。
[0017] 本发明还提供包含根据本发明的导向RNA靶点序列的核酸构建体或载体如表达 载体。
[0018] 本发明还提供根据本发明的导向RNA靶点序列获得的、能够破坏共价闭合环状 DNA或者抑制HBV复制或者降低HBV表面抗原的导向RNA。
[0019] 在一个实施方式中，本发明的gRNA依次由能够与靶点序列互补结合的RNA片段和 骨架RNA片段连接而成，骨架RNA片段可与Cas核酸酶结合。具体地说，gRNA中能够与靶 点序列互补结合的RNA片段为能与5' -Nx-NGG-3'中Nx(N18_2CI)片段互补结合的RNA片段。 优选地，gRNA包含能够与下列靶点序列结合的片段，其选自以下序列之一：
[0020] (l)SEQIDNOs:l-15中任一个所述的序列；
[0021] (2)与⑴中序列具有至少70% (优选至少80%、85%、90%、95%、99%或更高） 一致性的序列；
[0022] (3)在严格条件下或者高度严格条件下与（1)中序列能够杂交的核苷酸序列；
[0023] (4)与⑴中的序列仅有1-3个（优选1-2个，更优选1个）核苷酸不同的序列； 以及
[0024] (5)与（1)-⑷中序列的片段或者互补序列。
[0025] 在一个优选的实施方式中，含有由本发明获得的gRNA靶点序列的gRNA序列导入 肝细胞后可使细胞获得抑制HBV复制和病毒基因表达的能力。
[0026] 本发明还提供可表达本发明的导向RNA的重组表达载体。
[0027] 在一个实施方式中，本发明的导向RNA的重组表达载体具有以下特征：包含了本 发明提供的导向RNA靶点序列的gRNA序列，这些gRNA序列与表达控制序列可操作地连接， 使得可在真核细胞（特别是哺乳动物细胞，如人细胞，优选肝细胞和干细胞）中表达靶向 HBV的gRNA〇
[0028] 本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体。
[0029] 本发明还提供包含本发明的导向RNA靶点序列、或者本发明的核酸构建体或载 体、或者本发明的导向RNA、或者本发明的重组表达载体的宿主细胞，包括原核细胞（如细 菌细胞、大肠杆菌细胞）和真核细胞（如真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞，特别是 哺乳动物细胞如人细胞，优选肝细胞和干细胞）。
[0030] 本发明还涉及治疗或者预防HBV感染或者HBV患者的药物组合物，其包含本发明 提供的gRNA靶点序列获得的导向RNA中的一种或多种、和/或包含所述导向RNA的重组表 达载体中的一种或多种，以及任选的药物载体。
[0031] 本发明还涉及包含本发明提供的gRNA靶点序列获得的导向RNA中的一种或多种、 和/或包含所述导向RNA的重组表达载体中的一种或多种在制备治疗或者预防HBV感染或 者HBV患者的药物中的用途。
[0032] 本发明还涉及包含本发明提供的gRNA靶点序列获得的导向RNA中的一种或多种、 和/或包含所述导向RNA的重组表达载体中的一种或多种在制备破坏共价闭合环状DNA或 者抑制HBV复制或者降低HBV表面抗原的药物中的用途。
[0033] 本发明还涉及包含本发明提供的导向RNA靶点序列、或者本发明提供的gRNA靶点 序列获得的核酸构建体或载体/或者导向RNA/或者重组表达载体、或者本发明所述的宿主 细胞中的任一项在筛选抗HBV药物中的应用。
[0034] 本发明还提供抑制HBV复制的方法，包括将有效剂量的本发明提供的gRNA靶点序 列获得的导向RNA中的一种或多种、和/或包含所述导向RNA的重组表达载体中的一种或 多种给药至患者。
[0035] 本发明还提供抑制HBV复制的方法，包括以下步骤：
[0036] (1)将本发明提供的gRNA靶点序列获得的导向RNA中的一种或多种、和/或包含 所述导向RNA的重组表达载体中的一种或多种导入宿主细胞或者生物体中；以及
[0037] (2)表达本发明提供的gRNA靶点序列获得的导向RNA中的一种或多种