专利名称：来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及β-半乳糖苷酶。具体而言，涉及从环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)中分离出的新型β _半乳糖苷酶及其基因以及其用途等。本发明的β _半乳糖苷酶例如可用作低乳糖牛奶的制造、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受症患者用的药品或补充剂的有效成分。本申请基于2009年6月5日提出的日本国专利申请第2009-136735号要求优先权，并将该专利申请的全部内容通过参照而援引于此。
背景技术：
β -半乳糖苷酶(EC3. 2. 1. 23)是水解β _D_半乳糖苷键而使D-半乳糖游离的酶， 一般广泛存在于微生物和动植物中。β -半乳糖苷酶的别名也称为乳糖酶，作为用于制造来自制造乳糖不耐受症用的低乳糖牛奶、奶酪时副产的乳清的乳清糖浆的酶，或者作为乳糖不耐受症患者用的药品、补充剂的有效成分而使用。另外，半乳糖苷酶还具有转移半乳糖苷键的能力，已知有利用该能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的寡糖)的方法。作为用于这些用途的β-半乳糖苷酶，已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(K. marxinus)、细菌环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等。其中，对于环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶，由Mozaffer等(非专利文献1)、 Vetere等(非专利文献2、、Ito等(非专利文献3、4)进行了研究。根据非专利文献1，报告了分子量为240kDa和160kDa的2种酶的纯化。并且报告了，前者的分解活性高，后者的半乳糖转移活性高，另外前者对于合成底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的分解活性比对于乳糖的分解活性高。另一方面，根据非专利文献2，报告了分子量212kDa、 145kDa和86kDa的3种酶的纯化。但是，不清楚这些多种酶的相互的蛋白质化学相关性、分子生物学(基因的)特性。另外，在非专利文献3、4中报告了 67kDa的酶的基因克隆和重组蛋白质的性质，但该酶是对β _1，3键特异的酶，对牛奶中的乳糖中的键β _1，4键没有作用。因此，是与在牛奶、来自牛奶的乳糖的处理中使用的通常的半乳糖苷酶不同的酶。 另外，基因数据库(GenBank)中登录有2种来自环状芽孢杆菌的β _半乳糖苷酶基因(基因数据库登录号(GenBank accession number)L034M和L03425)，但对于它们，仅报告了基因序列，不清楚是否编码实际具有活性的蛋白质。现有技术文献非专利文献# # ^lJ i K 1 :Mozaffar, Ζ. ， Nakanishi, K. ， Matsuno, R. ， and Kami kubo, Τ. Agric. Biol. Chem.，48 (12)，3053-3061，1984# 专禾Ij JC 2 :Vetere, A. , and Paoletti, S. Biochem. Biophys. Acta., 1380，223-231 (1998)非专禾Ij 文献 3 :Ito. Y.，and Sasaki, Τ. Biosci. Biotech. Biochem. ,61(8),
41270-1276(1997)4 :Fujimoto, H. ， Miyasato, M. ， Ito, Y. ， Sasaki, Τ. ， and Ajisaka, K. Glycoconjugate Journal,15，1550160(1998)非专利文献 5 =Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72，619—629 (1963)
发明内容
像这样，报告了作为来自环状芽孢杆菌的半乳糖苷酶的多种酶，但由于不清楚它们相互的蛋白质化学相关性、分子生物学(基因的)特性，因此，在低乳糖牛奶的制造、 低聚半乳糖的制造等制造产业上的各种用途的酶剂方面存在限制。本发明提供来自环状芽孢杆菌的新型半乳糖苷酶。本发明人等在研究环状芽孢杆菌产生的半乳糖苷酶的过程中，发现了目前为止没有报告的分子量为195kDa(利用SDS-PAGE测得，在质量分析中为189. 3kDa)的酶(本说明书中称为“ β-Gall”)，而且成功地克隆了编码该酶的基因(以下称为“本基因”)。并且，明确了本基因的碱基序列和由其推定的氨基酸序列是与目前为止报告的来自环状芽孢杆菌的3种半乳糖苷酶(氨基酸序列参照非专利文献3，基因数据库登录号L034M和L0342O大不相同的新型碱基序列和氨基酸序列。另外，本发明人等还发现了环状芽孢杆菌对合成底物2-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷O-nitrophenyl β -D-Galactopyranoside =ONPG)的分解活性低，即产生3种半乳糖基转移活性高的酶(在本说明书中称为“ β _Gal2”、“ β -Gal3”、“ β _Gal4”)。进而，还发现这3种β-半乳糖苷酶是由本基因(编码β-Gall的基因)派生而产生。此外，通过将本基因和本基因的片段导入适当的宿主，还确立了这些半乳糖苷酶蛋白质组的制造方法。本发明基于以上成果而完成，以下示出本发明。[1] 一种来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶，其分子量为195kDa(利用 SDS-PAGE 测得)。[2] 一种来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶，其由[1]所述的β-半乳糖苷酶的片段构成。[3] 一种β -半乳糖苷酶，由序列号7的氨基酸序列、或显示β -半乳糖苷酶活性的其片段构成。[4]根据[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列号7的氨基酸序列中从N末端到WSIGNEIY(序列号18)的区域。[5]根据[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列号8 10中的任意序列号的氨基酸序列。[6]根据[3]所述的β-半乳糖苷酶，其中，利用含有序列号5的序列的DNA进行编码。[7] 一种β-半乳糖苷酶基因，其由选自以下(a) (e)中的任意DNA构成(a)编码序列号6或7的氨基酸序列的DNA ；(b)含有序列号5的序列的DNA ；(c)在严格条件下对与序列号5的序列互补的序列进行杂交的DNA ；(d)作为序列号5的序列的DNA序列简并体的DNA ；
(e)由以序列号5的序列为基准并含有1个或多个碱基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列构成的且编码具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA。[8]根据[7]所述的半乳糖苷酶基因，其中，具有半乳糖苷酶活性的蛋白质由序列号7的氨基酸序列中发生小于60%、优选小于45%、进一步优选小于25%的变化的序列或其片段构成。[9]根据[8]所述的β -半乳糖苷酶基因，其中，所述变化为保守性氨基酸取代。[10] 一种β -半乳糖苷酶，由[7] [9]中任一项所述的β -半乳糖苷酶基因编码。[11] 一种重组载体，其含有[7] [9]中任一项所述的β-半乳糖苷酶基因。[12]根据[11]所述的重组载体，其为表达载体。[13] 一种转化体，其导入有[7] [9]中任一项所述的β -半乳糖苷酶基因。[14] 一种转化体，其导入有[11]或[12]所述的重组载体。[15]根据[1 或[14]所述的转化体，其为细菌细胞、酵母细胞或真菌细胞。[16] 一种β-半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步骤⑴和(2)(1)将[13] [15]中任一项所述的转化体在能产生由所述半乳糖苷酶基因编码的蛋白质的条件下进行培养的步骤；(2)将产生的所述蛋白质进行回收的步骤。[17] 一种酶剂，将[1] [6]和[10]中任一项所述的β _半乳糖苷酶作为有效成分。[18]根据[17]所述的酶剂，其中，所述有效成分是选自含有序列号7的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列号8的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列号9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列号10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一种以上的半乳糖苷酶。[19] 一种[1] [6]和[10]中任一项所述的β _半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶剂的使用，用于制造选自低乳糖牛奶、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受症患者用药品或补充剂中的制品。[20]使用[1] [6]和[10]中任一项所述的β-半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶剂而得到的低乳糖牛奶、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受症患者用药品或补充剂。
图1是来自环状芽孢杆菌的β -半乳糖苷酶粗酶溶液的羟基磷灰石色谱的洗脱图形。280nm的吸光度表示蛋白质，420nm的吸光度表示用ONPG法测定的β -半乳糖苷酶活性。图2是所得组分1 (参照图1)的利用亲和色谱法得到的洗脱图形。280nm的吸光度表示蛋白质浓度，420nm的吸光度表示用ONPG法测定的β-半乳糖苷酶活性。图3是所得组分2 (参照图1)的利用亲和色谱法得到的洗脱图形。280nm的吸光度表示蛋白质浓度，420nm的吸光度表示用ONPG法测定的β-半乳糖苷酶活性。图4是4种纯化的β -半乳糖苷酶β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、3-Gal3(泳道5)和i3_Gal4(泳道6)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。向泳道2提供粗酶粉末。左端表示使用的分子量标记(泳道1和7)的分子量。图5是大肠杆菌转化体的细胞破碎物离心上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1为β-Gall、泳道2为3-Gal2、泳道3为3_Gal3、泳道4为β _Gal4。泳道 5和6是大肠杆菌载体转化体的细胞破碎物的离心上清液。箭头表示表达的半乳糖苷酶蛋白质。左端表示使用的分子量标记(泳道Μ)的分子量。
具体实施例方式(用语)在本发明中，“编码氨基酸序列的DNA”是指将其进行表达时可以得到具有该氨基酸序列的蛋白质的DNA，即，具有与该氨基酸序列对应的碱基序列的DNA。因此还可以考虑密码子的简并。在本说明书中，用语“分离”可以与“纯化”交换使用。对本发明的酶(β-半乳糖苷酶)使用时的“分离”是指当本发明的酶来自天然材料时，在该天然材料中实质上不含有该酶以外的成分的(特别是实质上不含有污染蛋白质)状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中，污染蛋白质的含量以重量换算计为总体的约小于20%、优选约小于10%、进一步优选约小于5%、更进一步优选约小于1 %。另一方面，本发明的酶是利用基因工程方法制备的酶时，用语“分离”是指实质上不含有来自所使用的宿主细胞的其它成分、培养液等的状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中污染成分的含量以重量换算计为总体的约小于20%、优选约小于10%、进一步优选约小于5%、更进一步优选约小于1%。应予说明，在没有明确表示与其不同的意思的情况下，在本说明书中只是记载为“β-半乳糖苷酶” 时，意味着“分离状态的半乳糖苷酶”。对于代替半乳糖苷酶而使用的用语“本酶” 也同样。对DNA使用时的“分离”是指在原本天然存在的DNA的情况下，典型地从天然状态下共存的其它核酸中分离的状态。但是，可以含有天然状态下邻接的核酸序列(例如启动子区域的序列、终止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如对于基因组DNA的情况的“分离”状态，优选实质上不含有天然状态下共存的其它DNA成分。另一方面，对于利用cDNA分子等基因工程方法来制备的DNA的情况的“分离”状态，优选实质上不含有细胞成分、培养液等。同样地，对于利用化学合成制备的DNA的情况的“分离”状态，优选实质上不含有dNTP 等前体(原材料)、合成过程中使用的化学物质等。应予说明，在没有明确表示与其不同的意思的情况下，在本说明书中只是记载为“DNA”时，意味着分离状态的DNA。β -半乳糖苷酶一般显示乳糖分解活性(作用于β -1，4键来分解乳糖的活性)和半乳糖基转移活性(转移半乳糖的活性)。因此，本发明中的“β_半乳糖苷酶活性”包括该两种活性。乳糖分解活性可以利用实施例所示的乳糖法而测定。另外的半乳糖基转移活性可以将利用实施例所示的ONPG法得到的活性值与利用该乳糖法得到的活性值的比作为指标来表示。已知[利用实施例所示的ONPG法得到的活性值/利用该乳糖法得到的活性值]的值越小，则转移活性越高(非专利文献1)。本发明中的“分子量”在没有特别说明的情况下是指用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量。
(β-半乳糖苷酶)本发明的第1方式提供本发明人等在分离和赋予特征上取得成功的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶。本发明的β-半乳糖苷酶在一个方式中，其分子量为195kDa(利用SDS-PAGE测得)。本发明人等在分离纯化本β-半乳糖苷酶的过程中发现另外产生分子量为135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和160kDa 的β -半乳糖苷酶(β "Gal4)(均利用SDS-PAGE测得)，并且发现这3种β -半乳糖苷酶均由一个基因派生。另一方面，确认了实际上缺失了一半以上C末端区域的基因表达具有活性的半乳糖苷酶。基于这些发现，作为本发明的另一方式，提供由上述半乳糖苷酶 (分子量为195kDa的来自环状芽孢杆菌的半乳糖苷酶)的片段(以下称为“本片段”) 构成的半乳糖苷酶。只要显示半乳糖苷酶活性，则本片段的长度没有特别的限定， 但含有作为基准的蛋白质的例如5 98%、优选为40 95%、最优选为55 75%的蛋白质。另外，优选含有作为基准的蛋白质的N末端区域。本片段的具体例是本发明人等发现的分子量为135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和 160kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal4)。本片段也可以通过蛋白酶处理而得到。例如，通过将纯化的上述β-半乳糖苷酶 (分子量为195kDa的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶)提供给蛋白酶处理从而得到本片段。或者，也可以通过将含有上述半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌的培养液用蛋白酶处理从而得到本片段。使用的蛋白酶没有特别的限制。例如，可以使用市售的蛋白酶剂、环状芽孢杆菌产生的内源性蛋白酶。本发明的β -半乳糖苷酶在一个方式中含有序列号7的氨基酸序列。该氨基酸序列是从序列号6的氨基酸序列中除去信号肽部分而得到的氨基酸序列。应予说明，序列号6 的氨基酸序列是从由环状芽孢杆菌克隆得到的基因的碱基序列(序列号5)推定而得的氨基酸序列。具有序列号7的氨基酸序列的本发明的半乳糖苷酶从氨基酸数的不同和相同性低的程度(10 12%)来讲，是与目前为止报告的3种来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶明显不同的新型酶。本发明的另一方式是由序列号7的氨基酸序列的片段构成的半乳糖苷酶。在这里，片段优选含有序列号7的氨基酸序列中从N末端至WSIGNEIY(序列号18)的区域。该部分序列(WSIGNEIY)是推定的活性区域。作为片段的具体例，可以举出具有序列号8 10 中任一序列号的氨基酸序列的片段。序列号8的氨基酸序列对应fel2，序列号9的氨基酸序列对应Gal3，序列号10的氨基酸序列对应feil4。一般在某蛋白质的氨基酸序列的一部分实施修饰的情况下，有时修饰后的蛋白质与修饰前的蛋白质具有相同的功能。即，有时氨基酸序列的修饰对蛋白质的功能不带来实质性的影响，蛋白质的功能在修饰前后得以维持。考虑到该技术常识，与本发明的半乳糖苷酶(由序列号7 10中的任一氨基酸序列构成)进行比较的情况下，虽然发现氨基酸序列的略微的不同但没有发现在作为半乳糖苷酶的功能上的实质性差异的酶可以看作与上述β-半乳糖苷酶实质上相同的酶。这里的“氨基酸序列的略微的不同”是指代表性地通过构成氨基酸序列的1 数个(上限是例如3个、5个、7个、10个)的氨基酸的缺失、 取代、或1 数个(上限是例如3个、5个、7个、10个)的氨基酸的附加、插入、或它们的组合从而在氨基酸序列中发生变异(变化)的情况。“实质上相同的酶”的氨基酸序列与作为基准的上述半乳糖苷酶的氨基酸序列的同一性(％)优选为90%以上、更优选为95% 以上、进一步优选为98%以上、最优选为99%以上。应予说明，氨基酸序列的不同也可以发生在多个位置。“氨基酸序列的略微的不同”优选由保守性氨基酸取代而产生。这里的“保守性氨基酸取代”是指将某一氨基酸残基替换为具有相同性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、 谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个家族。保守性氨基酸取代优选为同一家族内的氨基酸残基间的取代。在这里，二个氨基酸序列的同一性(％ )例如可以用以下的程序确定。首先，为了能够进行最佳的比较，将二个序列进行排列(例如可以在第一序列中导入间隙(< W 1 )而使得与第二序列的对齐最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)与第二序列中对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。序列同一性是该二个序列共通的同一位置的数目的函数(即，同一性(％)=同一位置的数/位置的总数X100)，优选将对齐的最佳化所需的间隙的数目和尺寸也考虑进来。二个序列的比较和同一性的确定可以利用数学算法来实现。作为可以用于序列比较的数学算法的具体例，有记载于Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68,并在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77中改良的算法，但不限于此。这样的算法被合并到 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10 中记载的 NBLAST 程序和 XBLAST 程序(版本 2. 0)中。例如，在XBLAST程序中如果以score = 50、wordlength = 3进行BLAST多肽检索，则可以得到同一性高的氨基酸序列。为了得到用于比较的间隙对齐，可以利用Altschul 等(1997) Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中记载的 Gapped BLAST。利用 BLAST 和Gapped BLAST时，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细的可以参照例如NCBI的网页。作为可以用于序列比较的其它数学算法的例子，有Myers和 Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4 :11-17中记载的算法。这样的算法被合并到例如 GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中可使用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比较中利用ALIGN程序时，例如，可使用PAM120残基质量表，使间隙长罚分(￥ \ 7 長 f Hr ^ ) = 12、间隙罚分(￥ \ 7 《f A于4 ) = 4。可以使用 GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，使间隙权重=12、10、8、6或 4、间隙长权重=2、3或4来确定二个氨基酸序列的同一性。(β-半乳糖苷酶基因)本发明的第2方式涉及半乳糖苷酶基因。在一个方式中本发明的基因含有编码序列号6或7的氨基酸序列的DNA。该方式的具体例是由序列号5的碱基序列构成的 DNA。然而，一般在编码某蛋白质的DNA的一部分实施修饰的情况下，有时修饰后的DNA 所编码的蛋白质与修饰前的DNA所编码的蛋白质具有相同的功能。S卩，有时DNA序列的修饰对编码的蛋白质的功能没有带来实质性的影响，编码的蛋白质的功能在修饰前后得以维持。因此，本发明作为其它方式提供具有与序列号5的碱基序列等价的碱基序列、编码具有 β -半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA(以下也称为“等价DNA”)。这里的“等价的碱基序列” 是指与序列号5所示的核酸一部分不同、但其编码的蛋白质的功能(在这里为半乳糖苷酶活性)不会因该不同而受到实质性影响的碱基序列。作为等价DNA的具体例，是在严格条件下对与序列号5的碱基序列互补的碱基序列进行杂交的DNA。这里的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，可以参照例如Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring H arbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biolog y (edited by Frederick M. Ausubel et al.，1987)来设定。作为严格条件，例如可以举出以下条件使用杂交液(50%甲酰胺、10 XSSC (0. 15M NaCl，15mM柠檬酸钠，ρΗ 7· 0)、5XDenhardt溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA、 50mM磷酸缓冲液(pH7. 5))在约42°C 约50°C下进行温育，然后使用0. 1XSSC、0. 1% SDS 在约65°C 约70°C中进行清洗。作为进一步优选的严格条件，例如可以举出如下条件作为杂交液使用50%甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl，15mM柠檬酸钠，ρΗ 7. 0)、1 XDenhardt溶液、305、10%硫酸葡聚糖、101^/1111的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7. 5))。作为等价DNA的其它具体例，可以举出由以序列号5所示的碱基序列为基准并包括1个或多个(优选为1 数个)碱基的取代、缺失、插入、附加、或逆位的碱基序列构成且编码具有半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以发生在多个部位。这里的“多个”是指根据该DNA编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如2 40个碱基、优选为2 20个碱基、更优选为2 10个碱基。以上的等价DNA例如可以利用限制性内切酶处理、核酸外切酶或DNA连接酶等的处理、定位突变导入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或随机突变导入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13， Cold Spring Harbor Laborat ory Press,New York)的变异导入等,通过修饰具有序列号 5所示的碱基序列的DNA使其包括碱基的取代、缺失、插入、附加和/或逆位从而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法而得到等价DNA。作为等价DNA的其它的例子，可以举出将以SNP (单核苷酸多态性)为代表的多态性作为起因而发现如上述的碱基不同的DNA。在这里，如后述的实施例所示，由作为序列号7的氨基酸序列(Gall)的片段的序列号8 10的氨基酸序列构成的蛋白质(Gal2、(ia13和显示了高β -半乳糖苷酶活性。基于该事实，本发明的一个方式提供编码由在序列号7所示的氨基酸序列中发生小于 60%、优选小于45%、进一步优选小于25%的变化的序列或其片段构成的蛋白质的β-半乳糖苷酶基因。本发明的基因可以通过参考本说明书或附加的序列表所示的序列信息，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生物化学方法等而制备成分离的状态。具体而言，可以由适当的环状芽孢杆菌的基因组DNA库或eDNA库、或者环状芽孢杆菌的菌体内提取液，适当使用对本发明的基因能特异性地进行杂交的寡聚核苷酸探针 引物而制备。寡聚核苷酸探针·引物可以利用市售的自动化DNA合成装置等而容易地合成。应予说明，对于为了制备本发明的基因而使用的库的制作方法，例如可以参照Molecular Cloning, Third Edition,
10Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。例如，如果是具有序列号5的碱基序列的基因，则可以利用将该碱基序列或其互补序列的整体或一部分作为探针的杂交法来进行分离。另外，可以利用使用了设计成能够对该碱基序列的一部分特异性地进行杂交的合成寡聚核苷酸引物的核酸扩增反应(例如 PCR)来进行扩增和分离。另外，可以基于序列号6所示的氨基酸序列、序列号5的碱基序列的信息，通过化学合成而得到作为目标的基因(参考文献Gene，60 (1)，115-127 (1987))。(重组载体)本发明的另一个方式涉及含有本发明的半乳糖苷酶基因的重组载体。在本说明书中用语“载体”是指能够将插入其中的核酸分子输送至细胞等靶内的核酸性分子，其种类、形态没有特别的限定。因此，本发明的载体可以采取质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、 病毒载体(腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体等)的形态。可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，另外考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。如果举出载体的具体例子，有以大肠杆菌为宿主的载体(Μ13噬菌体或其修饰体、 λ噬菌体或其修饰体、pBR322或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母为宿主的载体(pY^^eCl、pMFa、pYES2等、以昆虫细胞作为宿主的载体(pAc、pVL等)，以哺乳类细胞作为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。本发明的重组载体优选为表达载体。“表达载体”是指可以将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内，并且能够在该细胞内表达的载体。表达载体通常含有对插入的核酸的表达所必要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。还可以使用含有选择标记的表达载体。使用该表达载体时，可以利用选择标记来确认表达载体导入的有无(及其程度)。本发明的基因向载体的插入、选择标记基因的插入(必要时)、启动子的插入 (必要时)等可以利用标准的重组DNA技术(例如可以参照Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring Harbor Laboratory PFess,New York，利用了限制性内切酶禾口 DNA连接酶的公知方法)来进行。(转化体)本发明进一步涉及导入有本发明的基因的宿主细胞(转化体)。本发明的转化体中，本发明的基因作为外来性的分子而存在。本发明的转化体优选通过使用了上述本发明的载体的转染或转化而制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter， H. et al. , Proc. Natl. Aca d. Sci. U. S. Α. 81，7161-7165 (1984))、脂质转染(Feigner, P.L.et al. , Pro c. Natl. Acad. ki. U. S. A. 84，7413-7417 (1984))、显微注射(Graessman η, Μ. &Graessmann, Α. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73, 366-370 (1976))、Hanahan 方法 (Hanahan, D.，J. Mol. Biol. 166，557-580 (1983))、乙酸锂法(Schiestl, R. H. et al. , Curr. Genet. 16，339-346 (1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton, M. M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，1470-1474(1984))等来实施。宿主细胞只要是能够表达本发明的半乳糖苷酶，就没有特别的限定，例如可以从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus likemiformis)、环状芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌，乳球菌、乳酸菌、链球菌、明串珠菌、双歧杆菌等乳酸菌，大肠杆菌、链霉菌等其它细菌、酵母菌、克鲁维酵母、念珠菌、圆酵母(Torula)、球似酵母等酵母，米曲霉、黑曲霉等曲霉菌属、青霉菌属、木霉菌属、镰刀菌属等丝状真菌(真菌)等中进行选择。( β -半乳糖苷酶的制造方法)本发明的另一个方式提供半乳糖苷酶的制造方法。本发明的制造方法的一个方式中，利用上述转化体制造半乳糖苷酶。在该方式的制造方法中，首先，在能产生由导入到其中的基因编码的蛋白质的条件下培养上述转化体(步骤(1))。关于各种载体宿主系的转化体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员就能够容易地设定适合的培养条件。培养法和培养条件只要是能够产生作为目标蛋白质的β -半乳糖苷酶的培养法和培养条件，就没有特别的限定。即，将产生半乳糖苷酶作为条件，可以适当设定适合所使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养法，液体培养、固体培养均可，优选利用液体培养。以液体培养为例子，说明其培养条件。作为培养基，只要是所使用的转化体能够进行生长的培养基，就可以是任意培养基。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源、进而硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、糠、肉提取物等氮源、进而钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所使用的转化体的生长，还可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。在有氧条件下培养，条件为培养基的PH调节到例如约3 10、优选为约7 8左右，培养温度通常为约10 50°C、优选为约20 37°C左右，1 7天、优选3 4天左右。作为培养法，可以采用例如振荡培养法、利用发酵罐的有氧深部培养法。培养步骤之后，回收产生的蛋白质(β_半乳糖苷酶)(步骤O))。从培养液中进行回收时，例如通过将培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，通过将利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种色谱等适当组合来进行分离、纯化，从而可以得到本酶。另外，从菌体内进行回收时，例如可以通过采用加压处理、超声波处理等将菌体进行破碎后，与上述同样地进行分离、纯化从而得到目标蛋白质。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。β -半乳糖苷酶的纯化度没有特别的限定。另外，最终形态可以是液体状，也可以是固体状(包括粉末状)。(酶剂)本发明的半乳糖苷酶例如可以酶剂的方式提供。酶剂除了有效成分(本发明的半乳糖苷酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂， 可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。在本发明的酶剂的一个方式中，作为有效成分，可以使用选自含有序列号7的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列号8的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列号9 所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶和含有序列号10所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶中的一种以上的半乳糖苷酶。作为一个方式，可以提供全部含有这4种β-半乳糖苷酶的酶剂。(β-半乳糖苷酶的用途)本发明的另一个方式提供本发明的半乳糖苷酶或酶剂的用途。用途的例子是低乳糖牛奶的制造、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受症患者用的药品、补充剂的制造。可以通过使用本发明的半乳糖苷酶或酶剂来降低原材料中的乳糖。例如，通过相对于ImL生牛奶添加IU的β -半乳糖苷酶，在10°C的低温下放置从而使乳糖分解，可得到低乳糖牛奶。在低聚半乳糖的制造中，例如，在预先加热溶解的 40%乳糖液(pH 7.0)中加入100LU的β -半乳糖苷酶，在40°C中放置5小时，从而生成低聚半乳糖。应予说明，低聚半乳糖由fell-(Gal)n-Glc (η通常为0 幻表示(Gal 半乳糖残基、Glc 葡萄糖残基)。结合方式除了 β 1-6、β 1-3、β 1-4、β 1-2以外，还有α 1-3、α 1-6寸。实施例1.来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的纯化(a) β -半乳糖苷酶活性测定法在以下的纯化中，β -半乳糖苷酶活性测定是以将2-硝基苯基β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作为底物的方法⑴和将乳糖作为底物的方法(ii)这2种进行测定。均是根据非专利文献1记载的方法实施。另外，蛋白质浓度是以^Onm的吸光度表示。i) ONPG 法将含有0. 245% ONPG的IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0) 1. 98ml在40°C预热10分钟。 向其中添加20 μ 1样品，在40°C反应10分钟后，加入10%碳酸钠溶液2. Oml，停止反应。测定反应液在420nm处的吸光度，将每1分钟生成1 μ mol的2-硝基苯酚时的活性作为IU而算出半乳糖苷酶活性。ii)乳糖法将含有5%乳糖的IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0) 2ml在40°C预热10分钟。向其中添加50 μ 1样品，在40°C反应15分钟后，在沸腾浴中煮沸，停止反应。对100 μ 1反应液用糖原稳定法测定葡萄糖浓度。即，在反应液100 μ 1中加入0. IN氢氧化钠溶液100 μ 1放置1分钟，接着添加0. IN乙酸、3ml的乙酸缓冲液(pH 5. 0)。在该溶液中添加葡萄糖氧化酶液(小野药品工业公司)500 μ 1，测定在550nm处的吸光度的增加速度，将每1分钟生成 Iumol的葡萄糖时的活性作为IU而算出乳糖分解活性。(b) β -半乳糖苷酶的粗酶粉末的制备将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) ATCC31382接种于含有3. 0 %大豆胨、 2. 5%肉提取物、1. 0%酵母提取物、0. 5%乳糖的液体培养基，在30°C振荡培养3天。将通过离心分离除去菌体而得到的培养上清液提供到超滤膜(AIP-1013D，旭化成公司制)而浓缩 5倍。将得到的浓缩液喷雾干燥，得到了半乳糖苷酶的粗酶粉末。(c) β -半乳糖苷酶的纯化将在IOmM磷酸钠缓冲液(pH 6. 0)中以5. 0%的浓度溶解有所得粗酶粉末的溶液 50ml提供到已用该缓冲液平衡化的羟基磷灰石凝胶柱(CHTTM Ceramic hydroxyapataite, BIO-RAD公司制，内径2. 5cm、长度25cm)上，用IOmM磷酸钠缓冲液(pH 6. 0)洗脱未吸附蛋白质。然后，利用使磷酸钠缓冲液浓度以100mM、150mM、200mM、300mM和500mM依次变化的分步洗脱法洗脱酶。本色谱在室温下进行。如图1所示，在磷酸钠缓冲液浓度为100mM、 150mM、300-500mM时，洗脱了显示β-半乳糖苷酶(ONPG)活性的酶，将各个组分依次设为组分1、2、3。组分3含有的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定中是分子量为195kDa的近乎单一的蛋白质，称为β-Gall。接着，将组分1利用亲和色谱法进行分离纯化。首先，将组分1对50mM乙酸缓冲液(PH 5.8)进行透析。使透析的酶液经过已用该缓冲液平衡化的亲和凝胶柱(对氨基苯基-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷-琼脂(p-Aminobenzyl-1-thio- β -D-galactopyranosi de-agarose)，Sigma公司制，直径1. 6cm，长度18cm)，用该缓冲液洗脱未吸附蛋白质后，在 4°C用使pH从5. 8变化到3. 5的线性梯度法(50mM乙酸缓冲液(pH 5. 8)/50mM乙酸缓冲液， (pH 3. 5))洗脱。如组分1所示，在清洗组分和在pH 4. 4前后分别洗脱出具有β _半乳糖苷酶活性的酶。它们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示了近乎单一的条带，分子量分别为 135kDa、86kDa。前者称为 3_Gal2，后者称为 β -Gal3 另一方面，将组分2与组分1同样地利用亲和色谱法进行分离纯化。将组分2相对于50mM乙酸缓冲液(pH 5.8)进行透析，并提供到已用该缓冲液进行平衡化的上述亲和柱上。与图2的情况相同，在用该缓冲液洗脱未吸附蛋白质后，在4°C用使pH从5. 8变化到3. 5 的线性梯度法进行洗脱。如图3所示，在清洗组分和在pH 4.4前后分别洗脱出具有β-半乳糖苷酶活性的酶。它们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示近乎单一的条带，分子量分别为86kDa、160kDa。前者与β -Gal3相同，后者称为β _Gal4。图4中表示了粗酶标准品 (泳道2)与纯化的β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、β -Gal3 (泳道5)和β -Ga 14 (泳道6)的10% SDS-PAGE的解析结果。2.来自环状芽孢杆菌的纯化β-半乳糖苷酶的各种性质研究纯化的4种β -半乳糖苷酶的主要性质。(a)比活度的测定在40°C、IOOmM磷酸缓冲液pH 6中测定使用了 ONPG (终浓度0. )和乳糖(终浓度4. 88%)作为底物时的活性。将结果示于表1。应予说明，使用了 ONPG作为底物的情况下，将在40°C、pH6的条件下1分钟生成1 μ mol产物硝基苯酚的酶量定义为IU ；使用了乳糖作为底物的情况下，将在40°C、pH6的条件下1分钟生成1 μ mol产物葡萄糖的酶量定义为1U。如表1所示，可知与对乳糖的分解活性相比，对ONPG的分解活性为β-Gall高， β -Gal2, β -Gal3 禾口 β _Gal4 低。[表1]
酶粗酶β-Gallp-Gal2p-Gal3β-GaW(U/mg)(U/mg)(U/mg)( /mg)(U/mg)比活度16.050.013.417. 610.9(底物；0NPG)比活度35.446.562.072. 645.0(底物；乳糖)分子量-189. 283 kDa134.788 kDa91.027 kDa153.932 kDa(SDS-PAGE)(195 kDa)(135 kDa)(86 kDa)(160 kDa)N末端-GNSVSYDGERRVNFNEN同左同左同左氨基酸序列(SVSYDGERRVNFNEN)
14
(b)分子量的确定利用基质辅助激光解吸/ 电离(Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization, MALDI)分析计求出4种β-半乳糖苷酶的分子量。样品使用了 0. 1 μ 1 IOmg/ ml 芥子酸/0. 1μ 1 0. 7-3mg/ml 酶溶液的混合溶液。结果，β -Gall 为 189. 283kDa、β -Gal2 为 134. 788kDa、β -Gal3 为 91. 027kDa、β -Gal4 为 153. 932kDa (表 1)。另外，将用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求出的分子量(图4)示于表1的括号内。利用质量分析计求得的分子量对于任何酶均显示了与由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求出的分子量近似的结果。(C) N末端氨基酸序列的确定利用蛋白质序列分析仪进行4种β-半乳糖苷酶的N末端氨基酸序列的解析。其结果，明确了 β -Gall中含有2种序列GNSVSYDGERRVNFNEN(序列号1)和 SVSYDGERRVNFNEN(序列号17)。但是，可知这2种序列是在N末端有无GN方面的不同，基本上是相同序列。另外0-Gal2、β-Gal3, β _Gal4的N末端氨基酸序列也与β-Gall相同。(d)内部氨基酸序列的确定接着，将β -GalU β -Gal2, β -Gal3的纯化酶制备成1 ang/ml，向其中加入胰蛋白酶(0.5mg/ml)，在37°C中进行温育。48小时后提供到8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中。从任意酶中均检测出了 70kDa的条带。将电泳后的凝胶转印到硝基纤维素膜上，用考马斯亮蓝进行染色。从染色的条带中切出来自各酶的70kDa的条带，用蛋白质序列分析仪解析氨基酸序列。结果，来自各酶的70kDa蛋白质的N末端5残基的序列一致。另外，来自 β -Gal3的70kDa蛋白质的N末端15残基的氨基酸序列为EDRADVNIKTKISND (序列号2)。3.编码来自环状芽孢杆菌的半乳糖苷酶的基因片段的获取(a)染色体DNA的分离利用齐藤 三浦(非专利文献幻的方法由环状芽孢杆菌(Bacillus c irculans) ATCC31382的菌体制备染色体DNA。(b)利用PCR进行DNA探针的制作基于2.中确定的N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列合成2种寡聚核苷酸(序列号3、4)而作为PCR引物。使用这些引物，以环状芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，在以下的条件下进行PCR反应。<PCR 反应液〉10 X PCR 反应缓冲液(TaKaRa 公司)5. 0 μ 1
dNTP 混合液(各 2. 5mM, TaKaRa 公司)8. 0 μ 125mM MgCl25. 0 μ 150μΜ 正义引物 0. 5μ 150μΜ 反义引物 0. 5μ 1蒸馏水四.5μ1染色体DNA 溶液(100 μ g/ml) 1· 0 μ 1LA Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0· 5 μ 1<PCR反应条件〉步骤1 变性(95 °C、5分钟)1循环
步骤2 变性(95 °C、1分钟)30循环退火(52°C、1分钟)延伸(72°C、1分钟)步骤3 延伸(720C UO分钟)1循环将得到的约0. 6kb的DNA片段克隆到pGEM-Teasy (Promega公司)后，确认碱基序列，结果在紧邻正义引物之后和紧邻反义引物之前发现了编码上述部分氨基酸序列的碱基序列。将本DNA片段作为用于全长基因克隆的DNA探针。(c)基因库的制作环状芽孢杆菌的染色体DNA的Southern杂交解析的结果，在SpeI分解物中确认了与探针DNA进行杂交的约8. 21Λ的单条带。为了克隆该约8. 21Λ的SpeI DNA片段，如下制作基因库。进行上述(a)制备的染色体DNA的SpeI处理。将50 μ g的染色体DNA、40 μ 1 的10 XM缓冲液、342. 0μ 1的蒸馏水和8. 0μ 1的SpeI混合，在37°C中处理15小时。将得到的分解物连接到SpeI处理的pBluescript II KS+载体(Stratagene公司)上，得到了基因库。(d)基因库的筛选利用DIG-High Prime (Roche公司)将上述(b)得到的0. 6kb的DNA片段进行标记。将其作为DNA探针，将(c)中得到的基因库通过菌落杂交而进行筛选。由得到的阳性菌落得到了质粒pBlue-Gall。(e)碱基序列的确定根据通常方法确定质粒pBlue-Gall的碱基序列。将编码来自环状芽孢杆菌的 β -半乳糖苷酶的碱基序列(5214bp)示于序列号5。另外，将被序列号5编码的氨基酸序列(1738氨基酸)示于序列号6。该氨基酸序列中发现了 2.中确定的N末端区域氨基酸序列(序列号1)和内部氨基酸序列(序列号2)。认为很有意味的是，本基因中的起始密码子为GTG。应予说明，将从序列号6的氨基酸序列中除去信号肽的氨基酸序列示于序列号7。4.来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶β-Gall、β-Gal 2, β _Gal4在大肠杆菌中的表达(a) β -半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达质粒的构建由于与分子量 189. 3kDa、134. 8kDa、153. 9kDa(质量分析的值)的 β -Gall、 β -Gal2, β _Gal4相应的蛋白质的N末端区域氨基酸序列共通，因而基于编码其的DNA序列而合成了 1种寡聚核苷酸F-Gal(序列号11)。另外，基于编码各自推定的C末端区域氨基酸序列的DNA序列而合成3种寡聚核苷酸R-Gall、R-Gal2、R-Gal4 (序列号12、13、14)，并作为PCR引物。在正义引物F-Gal中附加McI限制性内切酶识别部位，在反义引物R_Gall、 R-Gal2、R-Gal4中附加MlI限制性内切酶识别部位。将这些引物和作为模板的具有β _半乳糖苷酶基因的染色体DNA，用以下的条件进行PCR反应。<PCR 反应液〉10XPCR 反应缓冲液(Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 1dNTP 混合液(各 2. 5mM、Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 110μΜ 正义引物 1. 5μ 110μΜ 反义引物 1. 5μ 1
25mM MgS042. 0 μ 1蒸馏水33. Ομ 染色体DNA 溶液(200 μ g/ml) 1· O μ 1KOD-Plus-DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司)1. 0 μ 1<PCR反应条件〉步骤1 变性(94 °C、2分钟)1循环步骤2 变性(94 °C、15秒)30循环退火(57°C、30秒)延伸(68°C、5 分钟)用电泳确认得到的PCR产物后，利用乙醇沉淀进行脱盐(69 μ 1)。接着，加入15 μ 1 的10ΧΤ缓冲液、10 μ 1的0. BSA溶液和SacI3y 1与SalI3 μ 1，在37°C中酶处理15 小时。用电泳确认限制性内切酶处理液，用NucleoSpin Extract II (Nippon Genetics公司)纯化后，在预先经Mel和Mil处理的载体pCold II DNA(Takara Bio公司)上连接 β-Gall、β-Gal2, β _Gal4 片段，得到了表达质粒 pCold-Gall、Gal2、Gal4。(b) β -半乳糖苷酶在大肠杆菌中的表达将表达质粒pCold-Gall、Gal2、Gal4 导入大肠杆菌 BL21Competent Cells (Takara Bio公司)中。从作为氨苄青霉素耐药菌株而得到的转化体中利用菌落PCR选择保有了插入有目标β-半乳糖苷酶基因的pC0ld-Gall、Ga12、(}a14的菌株。另外，还得到了作为对照而具有表达载体pCold II DNA的大肠杆菌BL21的转化体。将这些转化体接种于含有 100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养基Iml中，在37°C以170rpm培养，直至达到0. D600 = 0. 4-1. 0 (预培养)。接着，将预培养液300 μ 1接种于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB 培养基9ml中，在37°C以170rpm培养，直至达到0.D600 = 0.4-1.0。在15°C放置30分钟后，添力卩9 μ 1的0. IM IPTG，在15°C以160rpm培养M小时(本培养)，进行集菌。将菌体悬浮于1. Oml的IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0)中，加入Φ0. Imm的玻璃珠0. 50g，利用Multi Beads Siocker (安井机械公司)破碎菌体。破碎条件是将ON 120秒、OFF 60秒重复3. 75 循环。将得到的无细胞提取物(Cell free-extract)供给于离心分离，得到了可溶性成分。(c) β -半乳糖苷酶的表达确认将获取的可溶性成分提供到SDS-PAGE。作为电泳装置使用PhastSystem (GE Healthcare 公司)，作为分离凝胶使用 PhastGel Homogeneous 7. 5 (GE Healthcare 公司)。其结果，如图5所示，pCoId-Gall中在189kDa附近、pCoId-Gal2中在135kDa附近、 pCold-Gal4中在IMkDa附近分别确认了认为是β -GalU β -Gal2, β -Gal4的有意义的蛋白质的产生。作为对照的pCold II DNA中没有确认同样的蛋白质的产生，因此认为本蛋白质是分别导入β-半乳糖苷酶基因β-Gall、β-Gal 2, i3_Gal4带来的结果。另外，对于相同样品，测定将ONPG和乳糖作为底物的半乳糖苷酶活性。将活性测定结果示于表2。[表2]
权利要求
1.一种来自环状芽孢杆菌的半乳糖苷酶，其利用SDS-PAGE测得的分子量为 195kDa。
2.一种来自环状芽孢杆菌的半乳糖苷酶，其由权利要求1所述的半乳糖苷酶的片段构成。
3.—种β -半乳糖苷酶，由序列号7的氨基酸序列、或显示β -半乳糖苷酶活性的其片段构成。
4.根据权利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列号7的氨基酸序列中从N末端到WSIGNEIY即序列号18的区域。
5.根据权利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列号8 10的任一序列号的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，由含有序列号5的序列的DNA进行编码。
7.—种β-半乳糖苷酶基因，其由选自以下(a) (e)中的任一 DNA构成(a)编码序列号6或7的氨基酸序列的DNA；(b)含有序列号5的序列的DNA；(c)在严格条件下对与序列号5的序列互补的序列进行杂交的DNA；(d)作为序列号5的序列的DNA序列简并体的DNA；(e)由以序列号5的序列为基准并含有1个或多个碱基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列构成的且编码具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA。
8.根据权利要求7所述的β-半乳糖苷酶基因，其中，具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质由序列号7的氨基酸序列中发生小于60%、优选为小于45%、进一步优选为小于25%的变化的序列或其片段构成。
9.根据权利要求8所述的半乳糖苷酶基因，其中，所述变化为保守性氨基酸取代。
10.一种β -半乳糖苷酶，由权利要求7 9中任一项所述的β -半乳糖苷酶基因编码。
11.一种重组载体，其含有权利要求7 9中任一项所述的半乳糖苷酶基因。
12.根据权利要求11所述的重组载体，其为表达载体。
13.一种转化体，其导入有权利要求7 9中任一项所述的半乳糖苷酶基因。
14.一种转化体，其导入有权利要求11或12所述的重组载体。
15.根据权利要求13或14所述的转化体，其为细菌细胞、酵母细胞或真菌细胞。
16.一种半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步骤(1)和O)(1)将权利要求13 15中任一项所述的转化体在能产生由所述β-半乳糖苷酶基因编码的蛋白质的条件下进行培养的步骤；(2)将产生的所述蛋白质进行回收的步骤。
17.一种酶剂，将权利要求1 6和10中任一项所述的β-半乳糖苷酶作为有效成分。
18.根据权利要求17所述的酶剂，其中，所述有效成分是选自含有序列号7的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列号8的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列号9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列号10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一种以上的半乳糖苷酶。
19.一种权利要求1 6和10中任一项所述的β -半乳糖苷酶或者权利要求17或18 所述的酶剂的使用，用于制造选自低乳糖牛奶、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受症患者用药品或补充剂中的制品。
20.低乳糖牛奶、作为肠内双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受症患者用药品或补充剂，其使用权利要求1 6和10中任一项所述的β -半乳糖苷酶或者权利要求17 或18所述的酶剂而得到。
全文摘要
本发明的目的是提供新型β-半乳糖苷酶。提供来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶及其基因。本发明的β-半乳糖苷酶可以用于牛奶、乳制品、发酵乳制品、低聚半乳糖或膳食补充剂的制造等。
文档编号C12N9/38GK102449148SQ20108002394
公开日2012年5月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2009年6月5日
发明者中西一弘, 山口庄太郎, 星由纪子, 片濑彻, 箕田正史, 长屋美穗 申请人:天野酶株式会社