专利名称：蛋白质间相互作用的高灵敏度检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测蛋白质间相互作用的方法。
背景技术：
最近，利用分裂荧光素酶片段的互补性，人们开发出了检测两个目的蛋白质间相互作用的系统(Kim, S. B.，Ozawa, T.，Watanabe, S.，Umezawa, Y. ,2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101，1巧42-1巧47)。作为利用互补性来检测蛋白质间相互作用的方法，通常是将分裂的报告蛋白的各片段与目的蛋白融合，但此时，任何片段自身都无法保持有意活性。如果目的蛋白质间发生相互作用，则两个无活性的报告蛋白片段相互互补，使活性恢复，产生用来间接跟踪该蛋白质间相互作用的可读信号。对于以二氢叶酸还原酶、β -内酰胺酶绿色荧光蛋白为首的各种报告蛋白，一直以来使用利用上述互补性的方法。此外，海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、发红光叩甲虫 (Elateridae)荧光素酶、发绿光叩甲虫荧光素酶等几种荧光素酶也一直以来使用上述方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种检测灵敏度显著提高的利用分裂荧光素酶的检测系统。解决技术问题的技术手段本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，发现使用源于巴西产发光叩甲虫 (Pyrearinus termitilluminans)的荧光素酶，使具有SEQ ID NO 1的C端侧片段与具有任一 SEQ ID NO :2 6的N端片段分别与可相互结合的两个蛋白质融合，在使这两个融合蛋白结合时，会释放出比现有发光强度强约30倍以上的光，从而完成了本发明。S卩，本发明的一种实施方式为具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的融合蛋白。 此外，另一实施方式为具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列的融合蛋白。并且，在本说明书中，“蛋白质具有氨基酸序列”是指该蛋白质含有该氨基酸序列， 其也可以含有除该氨基酸序列以外的氨基酸序列。此外，“融合蛋白”是指源于发光叩甲虫荧光素酶的肽(在本发明中，具体是指由选自SEQ ID NO :1 6所示的氨基酸序列组成的肽)与非源于发光叩甲虫荧光素酶的肽相融合的蛋白质。此外，另一实施方式为具有由SEQ ID NO 1所示氨基酸序列所组成的肽的融合蛋白与具有由选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列所组成的肽的融合蛋白的复合物。此外，另一实施方式为编码由选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列所组成的肽的DNA。并且，还可以是含有该DNA的表达载体，其能够表达融合到由选自SEQ ID NO :1 6所示的氨基酸序列组成的肽中的融合蛋白。并且，另一实施方式为检测蛋白质间相互作用的试剂盒，其包括表达具有SEQ IDNO :1所示氨基酸序列所组成的肽的蛋白质的表达载体以及表达具有选自SEQ ID N0:2 6所示氨基酸序列所组成的肽的蛋白质的表达载体。并且，另一实施方式为检测具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的融合蛋白的方法， 其特征在于，该方法包括以下步骤使该融合蛋白与结合融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤，所述结合融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列且可与该融合蛋白结合；以及检测从所述复合物中释放出的光的步骤。此外，另一实施方式为检测具有选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤使该融合蛋白与结合融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤，所述结合融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列且可与该蛋白质结合；以及检测从所述复合物中释放出的光的步骤。此外，另一实施方式为复合物的检测方法，所述复合物为第一融合蛋白与结合融合蛋白的复合物，所述第一融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；所述结合融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列且可与第一蛋白质结合，其特征在于，该方法包括检测从所述复合物释放出的光的步骤。此外，另一实施方式为检测具有相互结合能力的第一融合蛋白与第二融合蛋白间的结合的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，第二融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤；以及检测从所述复合物释放出的光的步骤。 并且，该检测方法还可以包括使SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列与第一蛋白质融合，制备第一融合蛋白的步骤，以及使选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列与第二蛋白质融合，制备第二融合蛋白的步骤。并且，另一实施方式为从蛋白质文库(library)中筛选可与第一融合蛋白结合的结合融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有SEQ ID NO 1 所示的氨基酸序列，包含于蛋白质文库中的多个第二融合蛋白具有选自SEQ ID N0:2 6 所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用的步骤；以及通过检测释放出的光，对与第一融合蛋白形成复合物的结合融合蛋白进行鉴定的步骤。此外，另一实施方式为筛选可与第一融合蛋白结合的结合融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有选自SEQ ID N0:2 6所示的氨基酸序列，多个第二融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用的步骤；以及通过检测释放出的光，对与第一融合蛋白形成复合物的结合融合蛋白进行鉴定的步骤。<与相关文献的交叉引用>另外，本申请要求2009年5月29日提出申请的日本申请号特愿2009-131481以及2010年2月23日提出申请的日本申请号特愿2010-37921的优先权，且通过引用上述申请，使其包含在本说明书中。
图1-1的图IA为发光叩甲虫·荧光素酶的cDNA碱基序列。图1-2的图IB为在本发明的一个实施例中，用于制备plucN及plucC的PCR引物
5的列表。图1-3的图IC为在pcDNA3. 1/myc-His (B)中，被插入到pcDNA3. 1的多克隆位点的DNA碱基序列。图1-4的图ID为在pcDNA4/V5-His(B)中，被插入到pcDNA4的多克隆位点的DNA 碱基序列。图2-1为在本发明的一个实施例中，使用pFRB-lucC389 pFRB_lucC391与 plucN404-FKBP plucN417-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图。对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果；右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图2-2为在本发明的一个实施例中，使用pFRB-lucC392 pFRB_lucC394与 plucN404-FKBP plucN417-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图。对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果；右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图3-1为在本发明的一个实施例中，使用pFRB-lucC394 pFRB_lucC399与 plucN404-FKBP plucN417-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图。对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果；右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图3-2为在本发明的一个实施例中，使用pFRB_lucC400 pFRB_lucC403与 plucN404-FKBP plucN417-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图。对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果；右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图3-3为在本发明的一个实施例中，使用pFRB-lucC404 pFRB_lucC407与 plucN404-FKBP plucN417-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图。对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果；右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图4为在本发明的一个实施例中，使用pFRB-lucC394与plucN412_FKBP plUCN416-FKBP的组合，调查荧光素酶分裂检测中的发光强度的结果示意图和表。在表中， Rap+表示诱导结合时的发光强度，DMSO表示无诱导结合时的发光强度(S卩，背景)，STDEV-R 表示在Rap+下诱导结合时的标准偏差，STDEV-D表示在DMSO下无诱导结合时的标准偏差。 在图中，对于各样品，柱形图的左侧柱为在含雷帕霉素的培养基中的结果，右侧柱为在含 DMSO的培养基中的结果。图5为在本发明的一个实施例中，使用plucN415-FKBP与pFRB-lucC394的组合以及现有的pTlucN-FKBP与pFRB-GlucC的组合，对荧光素酶分裂检测中的发光强度进行比较的结果示意表。标记与图4的意义相同。图6为在本发明的一个实施例中，对于导入pSSTR2_lucC394和ρIucM 15-抑制蛋白(plucN415-arrestin),分别使 pSSTR2_lucC394 和 plucN415-抑制蛋白 (plucN415-arrestin)瞬时表达的HEK293细胞，在添加生长抑素的情况下以及不添加生长抑素的情况下，对其发光强度进行比较的结果示意图。χ轴表示含有生长抑素(+)和不含有生长抑素㈠，y轴表示光子数(X IO4个)。
图7为在本发明的一个实施例中，用各种浓度的生长抑素或其类似物 (RIM23052或BIM23056)刺激HEK293-ARRB2-SSTR2细胞株后，测定发光时的剂量-效应 (dose-response)曲线图。χ轴表示各试剂的浓度(log(摩尔浓度))，y轴表示光子数(XlO4 个)。图8为在本发明的一个实施例中，用IX 10_6M的生长抑素刺激 HEK293-ARRB2-SSTR2细胞株后，随经过时间测定发光时的时间-效应(time-response)曲线图。χ轴表示时间(分钟)，y轴表示光子数(XlO4个)。图9为在针对GPCR进行的实验中，记载所使用的GPCR的名称、制备用来表达融合蛋白的表达载体时所使用的PCR模板和引物序列、用于刺激的配体、检测出发光的配体浓度(EC50)(单位为摩尔浓度)、观察到最大发光时的刺激后时间(T)的表。
具体实施例方式下面，列举实施例，对基于上述认知而完成的本发明的具体实施方式
进行详细说明。在没有对实施方式及实施例特别说明的情况下，均使用J. Sambrook，Ε. F. Fritsch & Τ· Maniatis (Ed.)，分子克隆，实验手册(第三版)(Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition))，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(2001) ；F. Μ. Ausubel, R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J.A.Smith，K.Mruhl(Ed·)，现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley & Sons Ltd.等标准流程手册中记载的方法，或使用对其进行修饰、 修改的方法。此外，在使用市售的试剂盒或测定装置时，在没有特别说明的情况下，均使用其附带的流程。并且，根据本说明书的记载，本领域技术人员能够清楚本发明的目的、特征、优点及其思路；只要是本领域技术人员就能够根据本说明书的记载，容易地重现本发明。以下记载的发明的实施方式及具体实施例等是表示本发明优选的实施方式，用来例示或说明，本发明不限于此。本领域技术人员应该清楚，在本说明书所公开的本发明的意图及范围内，基于本说明书的记载可以进行各种改变和修饰。==原理==本发明提供一种检测灵敏度高的荧光素酶分裂检测系统。在本检测系统中，使用源自发光叩甲虫 荧光素酶(如图IA记载的序列)的SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列以及选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列。下面，对实施本检测系统的方法进行详细描述，但荧光素酶分裂检测已经是公知技术，对于没有记载在本说明书中的部分，本领域技术人员可以根据技术常识来实施。首先，合成具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列(将这部分肽称为lucCmax)的第一蛋白质(称为第一融合蛋白)以及具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列(将这部分肽称为lucNmax)的第二蛋白质(称为第二融合蛋白)。这里，第一蛋白质和第二蛋白质为在特定条件下可结合的蛋白质。各融合蛋白可以经化学合成导入检测系统，也可以如后述所示，构建编码融合蛋白的表达载体，使其在检测系统内表达融合蛋白。此时，可以是瞬时表达也可以是永久表达。并且，在检测系统为体外(in vitro)体系的情况下优选为前者，在检测系统为细胞等体内(in vivo)体系的情况下优选为后者。此外，在各融合蛋白中，lucCmax或lucNmax在与各蛋白质结合时，可以分别直接结合，也可以通过接头结合。接头优选为具有适当长度的部分肽。将两种融合蛋白导入检测系统时，第一蛋白质与第二蛋白质结合。据此，IucCmax 和lucNmax到达可相互作用的位置，IucCmax和lucNmax再构建荧光素酶，恢复荧光素酶活性，使其在赋予适当的发光条件时发光。在测定荧光素酶活性时，在检测系统为细胞的情况下，可以向细胞培养基中投入荧光素，也可以制备细胞提取物，在其中测定荧光素酶活性， 但使用市售的Emerald Luc荧光素酶检测试剂/裂解液(Emerald Luc Luciferase Assay Reagent/Lysis Solution)(东洋纺(TOYOBO)公司)等时，能够容易地测定活性。在该检测系统中，以IucC的氨基酸序列为SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，以 IucN的氨基酸序列为选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列，从而能够获得比现有强约 30倍以上的发光强度。==表达载体的构建==如上所述，向检测系统内导入融合蛋白时，可以构建编码各融合蛋白的表达载体， 使其在检测系统内表达融合蛋白。这里，通过事先制备含有编码选自SEQ ID NO :1 6所示的氨基酸序列的DNA的载体，从而能够容易地构建编码各融合蛋白的表达载体。该载体例如也可以具有如下结构。在检测系统内起作用的表达启动子的下游，插入添加了起始密码子ATG的编码lucNmax的DNA，紧接其后设置多克隆位点，然后具有转录终止信号的结构。在该多克隆位点中，将编码目的蛋白质的DNA形成框架(frame)插入，从而能够容易地使lucNmax与该蛋白质融合的融合蛋白表达。同样地，在检测系统内起作用的表达启动子的下游具有起始密码子ATG，在该下游依次插入多克隆位点及编码lucCmax的DNA，然后具有转录终止信号的结构。在该多克隆位点中，将编码目的蛋白质的DNA形成框架插入，从而能够容易使lucCmax与该蛋白质融合的融合蛋白表达。并且，含有包括编码SEQ ID NO :1所示氨基酸序列，S卩lucCmax的DNA的载体以及包括编码选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列，即lucNmax的DNA的载体的试剂盒，在检测蛋白质间相互作用等的目的下，能够容易地构建具有lucCmax或lucNmax的融合蛋白的表达载体。==检测系统的应用==使用本发明的检测系统，例如可认为进行如下所示的应用方法。首先，能够检测具有lucCmax的融合蛋白。例如，在使检测对象蛋白质中融合了 lucCmax的第一融合蛋白位于检测系统内时，事先准备使可与该检测对象蛋白质结合的结合蛋白质中融合了 lucNmax的第二融合蛋白，将其作为探针，导入到检测系统内。于是，第二融合蛋白内的结合蛋白质与第一融合蛋白内的检测对象蛋白质结合，lucCmax与 lucNmax相互作用，成为具有荧光素酶活性的状态。通过检测该荧光素酶活性，能够检测具有lucCmax的检测对象融合蛋白。作为具体的一个实例，制备表达第一融合蛋白的表达载体，导入细胞中。制备表达第二融合蛋白的表达载体，导入表达第一融合蛋白的细胞中，然后测定上述细胞的荧光素酶活性，从而能够检测具有lucCmax的融合蛋白。
其次，能够检测具有lucNmax的融合蛋白。例如，在使作为检测对象的蛋白质中融合了 lucNmax的第一融合蛋白位于检测系统内时，事先准备使可与该检测对象蛋白质结合的结合肽中融合了 lucCmax的第二融合蛋白，将其作为探针，导入到检测系统内。于是，第二融合蛋白内的结合肽与第一融合蛋白内的检测对象肽结合，lucNmax与lucCmax相互作用，成为具有荧光素酶活性的状态。通过检测该荧光素酶活性，能够检测具有lucNmax的检测对象融合蛋白。作为具体的一个实例，制备表达第一融合蛋白的表达载体，导入细胞中。 制备表达第二融合蛋白的表达载体，导入表达第一融合蛋白的细胞中，然后测定上述细胞的荧光素酶活性，从而能够检测具有lucNmax的融合蛋白。此外，能够检测具有lucNmax的融合蛋白与具有lucCmax的融合蛋白的复合物。这些融合蛋白形成复合物时，lucNmax与lucCmax相互作用，成为具有荧光素酶活性的状态， 通过检测该荧光素酶活性，能够检测该复合物。作为检测方法，将有复合物存在的检测系统置于能够检测荧光素酶活性的条件下即可。检测系统为细胞时，可以如上述测定荧光素酶活性。并且，能够检测具有相互结合能力的第一蛋白质和第二蛋白质间的结合。即，事先使第一蛋白质中融合lucNmax，合成第一融合蛋白；使第二蛋白质中融合lucCmax，合成第二融合蛋白；在第一融合蛋白与第二融合蛋白相结合的情况下，检测荧光素酶活性。使用该方法，例如能够调查第一蛋白质与第二蛋白质是否结合。即，将使第一蛋白质中融合了 IucNmax的第一融合蛋白与使第二肽中融合了 lucCmax的第二融合蛋白导入到同一个检测系统中，如果第一蛋白质与第二蛋白质相结合，则能够检测出荧光素酶活性；如果第一蛋白质与第二蛋白质不结合，则检测不到荧光素酶活性。作为具体的一个实例，分别制备表达第一融合蛋白与第二融合蛋白的表达载体，导入同一个细胞中。然后，如上述检测荧光素酶活性，如果在细胞内再构建的荧光素酶发光，则能够判断出第一蛋白质与第二蛋白质相结合; 如果不发光，则能够判断出第一蛋白质与第二蛋白质没有结合。此外，还能够从蛋白质文库中筛选可与第一蛋白质结合的结合蛋白质。即，使第一蛋白质中融合lucNmax或lucCmax，制备第一融合蛋白；使蛋白质文库中的第二蛋白质中融合lucCmax或lucNmax，制备第二融合蛋白。当第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用时， 在第二融合蛋白中，仅有具有可与第一蛋白质相结合的结合蛋白质的融合蛋白能与第一融合蛋白形成复合物。因此，通过检测从复合物中释放出的光来鉴定该融合蛋白，能够鉴定与第一蛋白质形成复合物的第二蛋白质。具体地说，例如，使第一蛋白质中融合lucNmax，制得第一融合蛋白，事先准备好用表达该第一融合蛋白的表达载体转换了的细胞。构建cDNA文库，使其以蛋白质与lucCmax融合的形态表达，将构建好的cDNA文库导入上述细胞后，向培养基中添加荧光素，鉴定发光的细胞并克隆。从每个克隆中回收来自于文库的DNA，特别指定正在表达的基因。据此，能够获得可与第一蛋白质形成复合物的第二蛋白质的cDNA。实施例<实施例1>在本实施例中，在雷帕霉素的存在下，使具有结合能力的相互作用蛋白质 FKBP (NMJ)MO 14)及FRB (NM_019906)，分别与具有发光叩甲虫·荧光素酶的N端侧序列的肽IucN及具有C端侧序列的肽IucC融合，由于这些融合蛋白的组合不同，发光能力发生变化；并且，其中，使用IucNmax (如SEQ ID NO :2 6的第1-412 416所示的氨基酸序列)和lucCmax (如SEQ ID NO=I的第394-542所示的氨基酸序列)时，显示出发光活性显著增强。首先，以发光叩甲虫 荧光素酶的cDNA(序列如图IA所示)为模板，用如图IB所示的引物进行PCR，得到14种编码具有从N末端起到第404 417个的氨基酸序列的14种肽的DNA片段(这里，使用N-PtGR-FOOl和N_PtGR_R404 R417的各对引物)以及25种编码具有从C末端起到第389 413个的氨基酸序列的DNA片段(这里，使用C_PtGR_R542 和C-PtGR-F389 F413的各对引物)。用HindIII和BamHI酶切编码N端区域的DNA，用 BamHI 和 XhoI 酶切 pFKBP，用 HindIII 和 XhoI 酶切 pcDNA3. 1/myc-His (B)，然后进行三分子连接，制得14种ρIucN-FKBPο此夕卜，用XhoI和SacII酶切编码C端区域的DNA,用BamHI 和BioI酶切pFRB，用BamHI和SacII酶切pcDNA4/V5_His (B)，然后进行三分子连接，制得 25 种 pFRB-lucC。并且，pcDNA3. 1/myc-His (B)(插入到 pcDNA3. 1 的多克隆位点的 DNA 碱基序列如图IC所示)以及pcDNA4/V5-His⑶(插入到pcDNA4的多克隆位点的DNA碱基序列如图ID所示)分别为具有SEQ ID NO 7和8所示插入序列的质粒载体。在14种plucN-FKBP与25种pFRB-lucC的组合中，与原荧光素酶的氨基酸序列相比，有按照原样进行再构建(氨基酸的重叠为0)的情况或者部分重叠地再构建(氨基酸的重叠在1以上)的情况，在如上述情况的339中，将各表达载体的组合在96孔塑料培养皿上，使用 TtansIT 转染试剂(TtansIT Transfection Reagents) (TAKARA 公司)转染到 cos7 细胞中。从转染起约16小时后，更换为含1 μ M雷帕霉素的培养基，并在培养M小时后添加 ELA(T0Y0B0 公司)，用 TriMar LB941(伯托(Berthold Technologies)公司)进行发光测定。如图2及图3所示，在pFRB-lucC394下可得到高信号，其中，在plucN412-FKBP plucN416-FKBP下可得到最高信号。(使用pFRB_lucC408 pFRB_lucC413时，由于几乎得不到信号，因此图中没有显示。此外，在图3中，使用plucN415-FKBP时，由于实验不合适而得不到信号。)因此，在plucN412-FKBP plucN416_FKBP下再次进行实验，如图4所示，在 plucN412-FKBP plucN416_FKBP下几乎获得相同程度的高信号。将上述显示为最适合的、由plucN415_FKBP和pFRB_lucC394的组合引起的发光强度与现有技术中被认为最适合的、由pTlucN-FKBP和pFRB-GlucC的组合引起的发光强度进行比较。并且，pTlucN-FKBP为使用发红光叩甲虫荧光素酶的cDNA，通过下述引物用PCR方法扩增N端片段，与plucN-FKBP同样方法构建成的载体；pFRB-GlucC为使用发绿光叩甲虫荧光素酶的cDNA，通过下述引物用PCR方法扩增C端片段，与pFRB-lucC同样方法构建成的载体。(TlucN-I) 5，AAGCTTGCCATGGTAAAGCGTGAGAAAAATGTC 3，(SEQ ID NO 9)(TlucN-2) 5' GGATCCTCCGCCTCCTCCGCCGTCGTCGATGGCCTC3' (SEQ ID NO :10)(GlucC-I) 5，aggCTCGAGTGGAGGCGGCGGAGGCTGGCTGCACTCTGGCGACTTC 3' (SEQ ID NO 11)(GlucC-2)5' cgcGGGCCCAGCTTAGAAGCCTTCTCCATCAGGGC 3' (SEQ ID NO :12)如图5所示，在plucN415-FKBP和pFRB_lucC394的组合下，能够获得比现有的 pTlucN-FKBP和pFRB-GlucC的组合强约30倍的发光强度。像这样，利用发光叩甲虫 荧光
10素酶，通过使用lucC394的C端片段及lucN412 lucN416的N端片段，进行荧光素酶分裂检测，能够获得比现有技术强约30倍以上的发光强度。<实施例2>在本实施例中，使用作为GPCR(G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor)) 的生长抑素受体(SSTR2 ；生长抑素受体 2 (somatostatin type2receptor)) (NM_000794)和 β-抑制蛋白(arrestin，beta 2) (NM_004313)代替FKBP和FRB。SSTR2为存在于细胞膜上的膜蛋白质，当生长抑素与GPCR的胞外域结合时，SSTR2的胞内域与存在于细胞质中的作为接合体分子的抑制蛋白结合，将信号输送到下游。因此，使SSTR2的C端与Eluc的 C端结合，使β -抑制蛋白的N端与Eluc的N端结合，在培养细胞内表达上述融合蛋白，向培养细胞中投入生长抑素，调查从细胞中发出的光。首先，以人脑cDNA文库(TAKARA)为模板，用下述所示的引物进行PCR，得到编码抑制蛋白(arrestin)、SSTR2 的 DNA 片段。ARRB2-nestF2 :AAAGGATCCATGGGGGAGAAACCCGGGACCAGGGTCT (SEQ ID NO :54)ARRB2-nestR-Eco :AAGAATTCCAGCAGAGTTGATCATCATAGT(SEQ ID NO :55)SSTR2_start_Bam TTGGATCCATGGACATGGCGGATGAGCCAC(SEQ ID NO :56)SSTR2_R1107end_XhoI :TTTCTCGAGCCGATACTGGTTTGGAGGTCTCCATTG(SEQ ID NO:
57)用BamHI和EcoRI酶切编码抑制蛋白的DNA，与用BamHI和EcoRI酶切的plucN415 连接，得到plucN415-抑制蛋白(plucN415-arrestin)。这里所使用的plucN415是从实施例1制得的plucN415-FKBP中用HindIII和BamHI酶切出编码lucN415的DNA，将其与用 HindIII和BamHI酶切的pcDNA3. l/myc-His(B)进行连接而获得的。此外，用BamHI和XhoI酶切编码SSTR2的DNA片段，插入pcDNA4/V5_His (B)的多克隆位点，得到PSSTR2。并且，用XhoI和SacII酶切编码接头(linker)长度扩增到22个氨基酸的 lucC394 的 DNA，插入到 pSSTR2 的 XhoI-SacII 部位，得到 pSSTR2_lucC394。并且，lucC394 的接头长度，首先以 pFRB-lucC394 为模板，用 linkerC12-F-XhoI(SEQ ID NO:
58)和PtGR-R542-SacII(SEQ ID NO :61)的引物进行 PCR扩增，然后用 XhoI 和 &icll 酶切， 插入到 pSSTR2 的 XhoI-SacII 部位，进而，以其为模板，用 linkerC17-F_XhoI (SEQ ID NO
59)和PtGR-R542-SacII(SEQ ID NO :61)进行 PCR扩增，然后用 XhoI 和 SacII 酶切，插入到 PSSTR2 的 XhoI-SacII 部位，最后，再以其为模板，用 linkerC22-F_XhoI (SEQ ID NO :60)和 PtGR-R542-SacII(SEQ ID NO :61)进行PCR扩增，然后用 XhoI 和 SacII 酶切，插入到 pSSTR2 的BioI-SacII部位，如此依次进行扩增，直至扩增到22个氨基酸为止。linkerC12-F-XhoI :AGGCTCGAGTGGCGGTGGAGGTAGTGGAGGCGGCGGAACAAA(SEQ ID NO 58)linkerC17-F-XhoI :AGGCTCGAGTGGTGGTGGGGGCAGTGGCGGTGGAGGTAGTGG(SEQ ID NO 59)linkerC22-F-XhoI :AGGCTCGAGTGGAGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGGGGCAGTGGCGGT(SEQ ID NO 60)PtGR-R542-Sac11 TTTCCGCGGCAGCTTAGAAGCCTTCTC(SEQ ID NO :61)将上述制得的pSSTR2-lucC394 和 plucN415_ 抑制蛋白(plucN415_arrestin)，用TtansIT转染试剂(TAKARA公司)转染到在96孔塑料培养皿上培养的HEK293细胞中。从转染起约40小时后，在含有1 μ M生长抑素的培养基中培养12分钟，添加ELA(T0Y0B0公司)，用TriStar LB941(伯托(Berthold Technologies)公司)进行发光测定。并且，用不添加生长抑素的细胞作为对照，同样进行发光测定，比较其结果。如图6所示，通过添加生长抑素，发光显著增强，其强度提高至8倍。接下来，使用6cm塑料培养皿，将用同样方法转染了 pluCN415-抑制蛋白 (plucN415-arrestin)的HEK293细胞在含有0. 8mg/mL G418的培养基中培养20天，从而制得永久表达 lucN415-抑制蛋白(lucN415-arrestin)的 HEK293 细胞株 HEK293-ARRB2。进而，向该细胞株中用同样方法转染pSSTR2-lucC394，然后在含有0. 8mg/mL G418和0. 04mg/ mL博来霉素(Zeocin)的培养基中培养20天，从而制得永久表达lucN415-抑制蛋白 (lucN415-arrestin)和 SSTR2_lucC394 的 HEK293 细胞株 HEK293-ARRB2-SSTR2。将上述细胞在96孔塑料培养皿上进行培养，用各种浓度的生长抑素或其类似物 (RIM23052或BIM23056)刺激12分钟后，用同样方法进行发光测定。根据获得的结果制成表示配体浓度与发光强度关系的剂量-效应曲线。如图7所示，在使用生长抑素的情况下，从3X 10_9到3X 1(ΓΜ的浓度内发光增强， 即使增加生长抑素至该浓度以上，发光也不会增强。在使用生长抑素的类似物的情况下，在相同浓度下没有检测出发光增强。本发明的荧光素酶分裂检测适用于受体及细胞内结合因子中，通过使用这种检测系统，能够定量测定相对于受体的配体活性。并且，用1 X KT6M生长抑素刺激HEK293-ARRB2-SSTR2后，在3分钟、6分钟、12分钟、15分钟、30分钟、40分钟、50分钟、90分钟时，根据经过时间测定发光，如图8所示，在5 分钟时达到最大发光水平的90%，12分钟时达到最大发光水平。然后，发光逐渐降低，但即使在90分钟后也维持在最大发光水平的80%。这样，使用本发明的荧光素酶分裂检测的检测系统，与目前的检测蛋白质相互作用的体系相比，能够更快速地检测出结合。并且，本发明的荧光素酶分裂检测也可适用于除SSTR2以外的GPCR中，S卩，可适用于 ADRB2 (肾上腺素 β 2 受体(adrenergic beta2 receptor)，表面(surface)) (NM_000024)、AGTRLl (血管紧张素 IIl 型受体相关受体(apelin receptor)) (NM_00516)、 EDNRB (内皮素受体 B(endothelin receptor type B)) (NM_000115)、CCKBR(胆囊收缩素 B 受体(cholecystokinin B receptor)) (NM_17685)中，在同样的实验体系中，可获得如图9 所示的结果。工业实用性根据本发明，能够提供一种检测灵敏度显著提高的利用分裂荧光素酶的检测系统。
权利要求
1.具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列的融合蛋白。
2.具有选自SEQID NO :2 6所示的氨基酸序列的融合蛋白。
3.一种复合物，其为具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的融合蛋白与具有选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列的融合蛋白的复合物。
4.编码选自SEQID NO :1 6所示氨基酸序列的DNA。
5.含有编码选自SEQID NO :1 6所示氨基酸序列的DNA的载体。
6.一种试剂盒，其包括含有编码SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的DNA的载体以及含有编码选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列的DNA的载体。
7.—种检测具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤使该融合蛋白与结合融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤，所述结合融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列且可与该融合蛋白结合；以及检测从所述复合物中释放出的光的步骤。
8.—种检测具有选自SEQ ID NO :2 6所示氨基酸序列的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤使该融合蛋白与结合融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤，所述结合融合蛋白具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列且可与该蛋白质结合；以及检测从所述复合物中释放出的光的步骤。
9.一种检测复合物的方法，所述复合物为第一融合蛋白与结合融合蛋白的复合物，所述第一融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；所述结合融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列且可与第一蛋白质结合，其特征在于，该方法包括检测从所述复合物释放出的光的步骤。
10.一种检测具有相互结合能力的第一融合蛋白与第二融合蛋白间的结合的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，第二融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，形成复合物的步骤·’以及检测从所述复合物释放出的光的步骤。
11.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤使SEQID NO 1所示的氨基酸序列与第一蛋白质融合，制备第一融合蛋白的步骤；以及使选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列与第二蛋白质融合，制备第二融合蛋白的步骤。
12.—种从蛋白质文库中筛选可与第一融合蛋白结合的结合融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，包含于蛋白质文库中的多个第二融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用的步骤；以及通过检测释放出的光，对与第一融合蛋白形成复合物的结合融合蛋白进行鉴定的步
13. —种筛选可与第一融合蛋白结合的结合融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤第一融合蛋白具有选自SEQ ID NO :2 6所示的氨基酸序列，多个第二融合蛋白具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用的步骤；以及通过检测释放出的光，对与第一融合蛋白形成复合物的结合融合蛋白进行鉴定的步马聚ο
全文摘要
本发明的目的在于提供一种检测灵敏度显著提高的利用分裂荧光素酶的检测系统。作为一个实施方式，在检测具有相互结合能力的第一蛋白质与第二蛋白质间的结合时，使第一蛋白质与由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列组成的肽融合，制得第一融合蛋白；使第二蛋白质与由选自SEQ ID NO2～6所示的氨基酸序列组成的肽融合，制得第二融合蛋白；使第一融合蛋白与第二融合蛋白相互作用，形成复合物，然后调查该复合物的发光活性。
文档编号C12Q1/26GK102449147SQ20108002349
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月28日 优先权日2009年5月29日
发明者三泽直美, 三浦研二, 冈本将, 增田兼治, 小泽岳昌, 西井重明 申请人:东洋纺织株式会社, 国立大学法人东京大学, 株式会社谱乐贝可思