反相胶体晶体膜制备方法及其在分离蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及反相胶体晶体膜技术领域，具体涉及一种反相胶体晶体膜的制备方法 及所述反相胶体晶体膜在分离蛋白中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着生命科学、生物技术及制药工业的迅速发展，对于多肽、酶、蛋白质等活性生 物的分离与纯化要求日益提高，膜色谱技术因具有快速高效等特点，能满足生物大分子高 效分离与纯化的需要，已逐渐受到人们的关注。膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质，连 接配基，利用膜配基与蛋白质之间的相互作用进行分离纯化。当料液以一定的流速流过膜 的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，至处理 完成后在用洗脱液将目标分子洗脱下来。普通的微滤膜作为膜色谱吸附材料，吸附率低，以 胶体晶体为模板制备的三维有序大孔材料，孔的排列周期有序，孔径大小可控，表面积大， 吸附能力强，分离蛋白效果显著，因此受到广泛关注，在催化、制药、过滤吸附及光子晶体方 面有着广泛的应用前景。
[0003] 目前关于疏水膜色谱法分离蛋白的方法很多，一些报道如下：（I)Sasagawa等 《Journal of Chromatography A》杂志 1999, 848(1)，161-168 通过射线引发接枝获得 GMA 膜，先在中空纤维膜上接入环氧基团，然后通过亚硫酸钠接入SO3H基团，再与镁离子交联， 制成离子交换膜介质，用于从蛋清中分离溶菌酶，该膜比表面积相较小，分离效果较差。（2) Zeng等在《Journal of membrane science》杂志1998, 148, 195-205甲壳素膜上偶联乙烯基 乙二醇二缩水甘油醚（EGDE)，获得了非常稳定的离子交换膜，可在酸或碱溶液中保持强度。 他们采用三种低Pl值的蛋白质（卵白蛋白、人血清白蛋白、胰岛素抑制剂）和两种高Pl的 蛋白质（溶菌酶、细胞色素 C)作为目标蛋白，分离两组中任意两对蛋白质的混合物，获得了 很高纯度的产物，通过该膜仅能分离PI差别较大的蛋白。（3)Tennikova等在《Journal of Chromatography A》杂志1993, 646, 279-288以十二烷基甲基丙烯酸酯-GMA-EDMA共聚物 (体积比15:35:50)为基质，经0. lmL/L磺酸在80°C条件下处理5h，获得了疏水膜介质，用 于分离肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶。该膜的孔径为微米级别，应用范围小。（4) Castilho 等在《Journal of Membrane Science》杂志 2000, 172, 269-277 报道了在尼龙微 孔膜表面交联葡聚糖（Mr ~ 6000和40000)和聚乙烯醇（Mr ~ 72000)，获得了具有足够活 化位点和较低的蛋白质非特异性吸附的膜基质，同时膜的透过性也得到了提高。在膜上偶 联蛋白A后可用于亲和分离人免疫球蛋白IgG，该膜的通透性较差。
[0004] 上述疏水色谱膜的比表面积小，孔分布不是三维有序，通透性不好，工艺复杂，制 备流程繁琐，操作条件苛刻，因而限制了它们的应用。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术膜比表面积小，孔排列不规整，通 透性差，分离效率低的问题，进而提供一种反相胶体晶体膜的制备方法以及采用这种反相 胶体晶体膜在分离蛋白中的应用，本发明采用垂直排列自组装法、刻蚀模板制得反相胶体 晶体膜，显著提高蛋白IgG的分离效果。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种反相胶体晶体膜的制备方法，包括下述步骤：
[0008] Sl :制备娃球分散液
[0009] Sll :将正硅酸乙酯加入到乙醇中，混合均匀后得第一溶液；
[0010] S12 :将水、以见13计浓度为10-16mol/L的浓氨水与乙醇混合均匀后得第二溶液；
[0011] S13 :将第一溶液和第二溶液混合，持续搅拌15-30小时，得到二氧化硅微球分散 液；
[0012] S2:制备单分散硅球模板
[0013] 将至少两片基片置于二氧化硅微球分散液中1-4天，相邻所述基片之间的二氧化 硅微球在毛细管力的作用下在所述相邻基片的相对面上形成单分散硅球排列的三维有序 的模板；相邻所述基片之间的间距为25-100 μπι;
[0014] S3 :制备反相胶体晶体膜
[0015] 将单分散硅球模板干燥后置于紫外聚合反应体系中，在紫外光照射条件下进行聚 合反应后，刻蚀掉单分散硅球模板和基片即得。
[0016] 所述步骤Sll中每50ml乙醇中添加2. 08~6. 23g正硅酸乙酯；所述步骤S12中 水、浓氨水与乙醇的质量比为（〇. 12~3) : (3. 85~10) :40 ;所述步骤S13中第一溶液和第 二溶液的质量比为（41. 58~45. 73) : (35. 11~43. 40)。
[0017] 所述的乙醇为无水乙醇，所述的水为去离子水。
[0018] 所述的紫外聚合反应体系包括聚合反应单体和光引发剂，所述聚合反应单体为二 甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA)，甲基丙烯酸丁酯（HBMA)或甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA)中的一 种或其中几种的混合物，所述的光引发剂为安息香异丁醚（BIE)。
[0019] 聚合反应单体的预处理为：将聚合反应单体通过装有中性氧化铝的过滤柱2-4 次，以去除外聚合反应单体中的阻聚剂。
[0020] 所述的步骤S2中的基片为硅片，所述的硅片用过氧化氢和硫酸的混合液进行前 处理，所述过氧化氢和硫酸的体积比为I: (1~3)。
[0021] 所述二氧化娃微球的粒径为35_835nm。
[0022] -种所述反相胶体晶体膜在分离蛋白中的应用。
[0023] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0024] (1)本发明的反相胶体晶体膜的制备方法先以正硅酸乙酯在氨水溶液中水解的方 法合成SiO2微球，然后采用垂直排列自组装法使微球排列规整，待溶剂挥发后将其浸入HF 溶液中刻蚀模板及硅基片，制得反相胶体晶体膜。反相胶体晶体膜的孔径均一，结构规整， 比表面积大，吸附能力强，IgG分离效果可达普通PVDF膜的10. 2倍。
[0025] (2)本发明提供的方法中所述步骤S2中可以通过调整相邻两硅片间聚合空间的 大小控制膜的厚度25-100微米这是两硅基片间距越小，毛细力越大，胶体晶体模板越规 整，形成的膜越薄，孔结构就越规整。作为优选方案。所述的硅基片间距为25-100微米。
[0026] (3)本发明制备得到的反相胶体晶体膜分离蛋白时，工艺简单，重复性好，孔呈三 维有序排列，分离效率高，降低成本。
[0027] (4)采用本发明制备的反相胶体晶体膜可广泛用于光子晶体、生物传感器、制药、 过滤等领域。
【附图说明】
[0028] 图1是为垂直排列法制备胶体晶体模板的示意图；
[0029] 图2为溶剂蒸发后的胶体晶体模板示意图；
[0030] 图3为实施例2所得二氧化娃微球分散液的透射电镜图；
[0031] 图4为实施例2所得的单分散硅球模板的电场发射扫描电镜图；
[0032] 图5为实施例2胶体晶体模板置于紫外聚合反应体系中的示意图；
[0033] 图6为实施例2反相胶体晶体膜的结构示意图；
[0034] 图7为实施例2所得的胶体晶体模板置于紫外聚合反应体系中的电场发射扫描电 镜图；
[0035] 图8为实施例2所得的反相胶体晶体膜的电场发射扫描电镜图；
[0036] 图9为实施例7所得的反相胶体晶体膜的俯视电场发射扫描电镜图；
[0037] 图10为实施例7所得的反相胶体晶体膜的横截面电场发射扫描电镜图；
[0038] 图11为实施例4所得反相胶体晶体膜的俯视电场发射扫描电镜图；
[0039] 图12为实施例4所得反相胶体晶体膜的横截面电场发射扫描电镜图；
[0040]图13为普通PVDF膜俯视的电场发射扫描电镜图；
[0041]图14为普通PVDF膜横截面的电场发射扫描电镜图；
[0042] 图15为疏水膜分离蛋白时的紫外吸收变化图。
[0043] 其中：1_聚酯薄膜；2-单晶硅片；3_Si02颗粒；4-二氧化硅微球分散液。
【具体实施方式】
[0044] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实 施方式作进一步地详细描述。
[0045] 本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。 相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给 本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
[0046] 透射电子显微镜图由JEM-1200EX型扫描电镜测得。
[0047] 电场发射扫描电镜图由JSM-6500F型场发射扫描电镜测得。
[0048] 疏水膜的紫外吸收变化曲线由Axta FPL