专利名称：有用物质生产方法和该生产方法中使用的表面活性剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及有用物质的生产方法和该生产方法中使用的表面活性剂。详细地说， 涉及在表面活性剂的存在下利用细菌进行有用物质的分泌生产的有用物质生产方法以及在该有用物质生产方法中使用的表面活性剂。
背景技术：
细菌被广泛用于生产氨基酸、蛋白质等有用物质。特别是近年来，已知一种使用通过基因工程学技术导入医药上/工业上有用的蛋白质的基因而进行了转化的细菌来有效地生产有用蛋白质的技术。作为用于蛋白质表达的细菌，作为革兰氏阴性菌的一种的大肠杆菌是通用的。将大肠杆菌用于蛋白质表达的技术的开发在逐渐发展，该技术被广泛用于工业用蛋白质、食品加工用蛋白质和医药品用蛋白质的生产中。作为提取使用大肠杆菌表达的蛋白质的方法，可列举出超声波、高压均质器和弗氏压碎器(French press)等物理破碎法，这些方法被广泛实用化。这些物理破碎法在取出蛋白质的同时会使大肠杆菌的细胞死亡。因此，为了增加所得到的蛋白质量，以下方法是有效的。1. 1增加单位细胞所表达的重组蛋白量的方法。2.增加细胞数的方法。但是，破坏大肠杆菌并从大肠杆菌中提取重组蛋白的物理破碎法等具有以下缺
点ο1.需要用于破碎大肠杆菌的设备。2.以同时被提取的基因组DNA为代表的核酸成分会使蛋白质提取液的增稠，因此为了使纯化过程进行，需要从蛋白质提取液中除去核酸成分。3.来自大肠杆菌的蛋白质或其他杂质大量混入到蛋白质提取液中，会导致毒性、 免疫原性。4.需要将大量混入的来自大肠杆菌的蛋白质从重组蛋白中分离的纯化工序。5.由于重组蛋白在大肠杆菌内蓄积，因而生产量受限。6.细菌的细胞内形成包涵体。7.重组蛋白被细胞内的蛋白酶分解，因此无法表达所需量的重组蛋白。为了消除这些缺点，需要一种大肠杆菌将重组蛋白分泌生产到培养液中的方法。通常，为了使用大肠杆菌将重组蛋白表达到细胞质外，通过将内膜移动所需要的信号肽序列与目标重组蛋白融合来进行。作为内膜移动所需要的信号肽序列，可列举出来自 PelB、OmpA, StII, PhoA, OmpF, PhoE, MalE, OmpC, Lpp、LamB, OmpT, LTB 和 TorA 等的信号肽序列或来自芽孢杆菌属(Bacillus)来源的木聚糖内切酶等的信号肽序列。融合了这些信号肽序列的重组蛋白通过大肠杆菌所具有的内膜移动机构％(3途径或TAT途径等被移动到周质。但是，由于由于大肠杆菌在内膜的外侧具有肽聚糖层、外膜，因而通常重组蛋白不会被分泌到培养液中。因此，为了将重组蛋白分泌生产到培养液中，公开了一系列方法(非专利文献1 7)。上述现有技术中记载的方法具有以下缺点中的至少一种。1.大肠杆菌容易死亡，因此不适于高密度或连续生产。2.只能适用于特定的重组蛋白的生产。3.由于重组蛋白以与膜蛋白等的融合蛋白的形式进行表达，因此融合蛋白可能会对活性的表达造成影响。因而，需要切断融合蛋白的工序，要花费费用。4.重组蛋白的表达量不充分。现有技术文献非专利文献非专利文献1 Jang 等，Bioproc. Eng.，21 (1999) 453-458非专利文献2 =Yang 等，Appl. Environ. Microbiol.，64 (1998) 2669-2874非专利文献3 Jeong 等，Appl. Environ. Microbiol.，68 (2002) 4979-4985非专利文献4 :Van der Wal 等，Appl. Environ. Microbiol.，64 (1998) 392-398非专利文献5 =Wan 等，Protein Expr. Purif.，14 (1998) 13-22非专利文献6 =Fernandez 等，Appl. Environ. Microbiol. ,66(2000)5024-5029非专利文献7 :Li 等，Gene, 25 (2002) 437-44
发明内容
发明所要解决的课题本发明所要解决的课题在于提供一种在表面活性剂的存在下使用大肠杆菌等细菌在工业规模下生产有用物质(蛋白质等)的生产方法以及在该有用物质生产方法中使用的表面活性剂。用于解决课题的方案本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果完成了本发明。S卩，本发明涉及一种有用物质生产方法和在该有用物质生产方法中使用的表面活性剂，所述有用物质生产方法为通过培养液中所含的细菌将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质生产方法，其中在培养液中含有表面活性剂(A)，以培养液的体积为基准的干燥菌体密度为1. 5g/L 500g/L。发明的效果本发明可实现以下效果。本发明的有用物质的生产方法能够实现有用物质的高生产量。另外，通过在使用细菌生产有用物质(蛋白质等)时添加本发明的表面活性剂，能够增大生产量和分泌量。
图1是关于比较例1和实施例1的结果，曲线图表示随时间推移的每Ig菌体的蛋
白质生产量。
图2是关于实施例7的结果，曲线图表示随时间推移的培养液中的干燥菌体密度和所生产的重组蛋白浓度。图3是表示培养液的浊度和干燥菌体密度的比例关系的曲线图，用于导出由培养液的浊度计算出干燥菌体密度的公式。
具体实施例方式本发明的有用物质的生产方法为通过培养液中所含的细菌将有用物质分泌生产到培养液中的有用物质的生产方法，培养液中含有表面活性剂(A)，以培养液的体积为基准的干燥菌体密度为1. 5g/L 500g/L。作为本发明中的细菌，可列举出以下细菌，但不限定于此。细菌包含真细菌和古细菌。真细菌包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。作为革兰氏阴性细菌，可列举出埃希氏菌属(Escherichia)、栖热菌属(Thermus)、根瘤菌属(Iihizobium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella) > iH|iiM (Vibrio)、沙门氏菌属(Salmonella)、 醋菌属(AcetcAacter)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)等。作为革兰氏阳性菌，可列举出芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Str印tmyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短芽 ？包杆菌属(Brevibacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)禾口链霉菌属 (Streptomyces)等中所含的细菌。其中，从有用物质的生产率的方面来看，优选为革兰氏阴性菌，进一步优选为埃希氏菌属，更优选为大肠杆菌。本发明中的有用物质没有特别限定，包含蛋白质(酶、激素蛋白、抗体和肽等)、寡糖和核酸等。作为蛋白质，可列举出酶{氧化还原酶(胆固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、抗坏血酸氧化酶和过氧化物酶等)、水解酶(溶菌酶、蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和葡糖淀粉酶等)、异构化酶(葡萄糖异构酶等)、转移酶(脂酰基转移酶和磺基转移酶等)、合成酶(脂肪酸合成酶、磷酸合成酶和柠檬酸合成酶等)和裂解酶(果胶裂解酶等) 等}、激素蛋白{骨形态生成蛋白(BMP)、干扰素α、干扰素β、白细胞介素1 12、生长激素、促红细胞生成素、胰岛素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、 利钠肽、凝血因子VIII、生长调节素、胰高血糖素、生长激素释放因子、血清白蛋白和降钙素等}、抗体{单链抗体、IgG大亚基、IgG小亚基等}、抗原蛋白{乙型肝炎表面抗原等}、功能性蛋白IPr0Nectin(注册商标)、抗冻肽、抗菌肽等}、荧光蛋白(GFP等)、发光蛋白(荧光素酶( >〉工，一)等)和肽(不特别限定氨基酸组成，寡肽、二肽和三肽等)等。作为寡糖，可列举出蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、棉子糖、潘糖、环糊精、低聚半乳糖和低聚果糖等。作为核酸，可列举出肌苷一磷酸、腺苷一磷酸和鸟苷一磷酸等。这些有用物质中，从制备有用物质的容易性的方面来看，优选为蛋白质，进一步优选为酶和激素蛋白。有用物质为蛋白质时，优选蛋白质具有以下性质蛋白质在细菌内表达后，一部分或全部向周质移动。进一步优选为向周质移动所需要的信号肽序列在ORF中编码的蛋白质。周质是指细菌的细胞质膜的外侧至细菌的最表面的空间。作为向周质移动所需要的信号肽序列，可列举出Sec分泌信号肽序列、TAT分泌信号肽序列等。本发明的有用物质的生产方法中使用的表面活性剂(A)为选自由两性表面活性剂(Al)、阴离子型表面活性剂(A2)、非离子型表面活性剂(A3)和阳离子表面活性剂(A4) 组成的组中的至少1种表面活性剂。作为两性表面活性剂(Al)，包含羧酸盐型两性表面活性剂(Al-I)、硫酸酯盐型两性表面活性剂(Al-幻、磺酸盐型两性表面活性剂(AH)和磷酸酯盐型两性表面活性剂 (Al-4)等。作为羧酸盐型两性表面活性剂(Al-I)，可列举出氨基酸型两性表面活性剂 (A1-1-1)、甜菜碱型两性表面活性剂(A1-1-2)和咪唑啉型两性表面活性剂(A1-1-3)等。作为氨基酸型两性表面活性剂(A1-1-1)，为分子内具有氨基和羧基的两性表面活性剂，可列举出下述通式(1)所示的化合物等。[R-NH- (CH2)n-COOlmM (1)通式(1)中，R是碳原子数为1 20的1价烃基。η是1以上的整数。m是1以上的整数。M是质子；或是碱金属、碱土金属、铵(包括来自胺和烷醇胺等的阳离子)和季铵等1价或2价的阳离子。另外，作为(A1-1-1)，具体地说，可列举出烷基氨基丙酸型两性表面活性剂(椰油基氨基丙酸钠、硬脂基氨基丙酸钠和月桂基氨基丙酸钠等)；烷基氨基乙酸型两性表面活性剂(月桂基氨基乙酸钠等)和N-月桂酰-N’ -羧甲基-N’ -羟乙基乙二胺钠等。甜菜碱型两性表面活性剂(Al-1-幻是分子内具有季铵盐型的阳离子部分和羧酸型的阴离子部分的两性表面活性剂。(A1-1-2)可列举出下述通式(2)所示的化合物。作为(Al-1-幻，具体地说，可列举出烷基二甲基甜菜碱(十八烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱和十二烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱等)、酰胺甜菜碱(椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜碱等(椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜碱等)和月桂酰胺丙基甜菜碱等)和烷基二羟基烷基甜菜碱(月桂基二羟基乙基甜菜碱等)、氢化椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜碱等。R-N+(CH3)2-CH2COCT(2)通式(2)中，R是碳原子数为1 20的1价烃基。作为咪唑啉型两性表面活性剂(A1-1-3)，可列举出2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉鐺甜菜碱等。作为其他两性表面活性剂，包含月桂酰甘氨酸钠、月桂基二氨基乙基甘氨酸钠、月桂基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐和二辛基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐等甘氨酸型两性表面活性剂；十五烷基磺基牛磺酸等磺基甜菜碱型两性表面活性剂；胆酰胺丙基二甲氨基丙磺酸内盐(CHAPS)、胆酰胺丙基二甲氨基-2-羟基丙磺酸内盐(CHAPSO)；月桂基二甲基氧化胺等烷基氧化胺型两性表面活性剂等。作为阴离子型表面活性剂(A》，可列举出醚羧酸(A2-1)及其盐、硫酸酯(A2-2)或其盐、醚硫酸酯(A2-》及其盐、磺酸盐(A2-4)、磺基琥珀酸盐(A2-5)、磷酸酯(A2-6)及其盐、醚磷酸酯(A2-7)及其盐、脂肪酸盐(A2-8)、酰化氨基酸盐以及天然来源的羧酸及其盐(鹅去氧胆酸、胆酸和脱氧胆酸等)等。作为醚羧酸(A2-1)或其盐，包含具有烃基(碳原子数为8 的醚羧酸及其盐。作为(A2-1)或其盐，具体地说，可列举出聚氧乙烯月桂基醚乙酸、聚氧乙烯月桂基醚乙酸钠盐、聚氧乙烯十三烷基醚乙酸钠盐、聚氧乙烯辛基醚乙酸钠盐和月桂基乙二醇乙酸钠
^Tt. ο作为硫酸酯(A2D及其盐，包含具有烃基(碳原子数为8 的硫酸酯及其盐。作为(A2-2~)及其盐，具体地说，可列举出十二烷基硫酸钠盐和十二烷基硫酸三乙醇胺
^Tt.O作为醚硫酸酯(A2-;3)及其盐，包含具有烃基(碳原子数为8 24)的醚硫酸酯及其盐。作为(A2-》及其盐，具体地说，可列举出聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐和聚氧乙烯月桂基醚硫酸三乙醇胺盐等。作为磺酸盐(A2-4)，可列举出十二烷基二苯基醚二磺酸钠盐、十二烷基苯磺酸钠盐和萘磺酸钠盐等。作为磺基琥珀酸盐(A2-5)，可列举出聚氧乙烯月桂基磺基琥珀酸二钠盐、月桂基磺基琥珀酸二钠盐和聚氧乙烯月桂酰乙醇酰胺磺基琥珀酸二钠盐等。作为磷酸酯(A2-6)，可列举出辛基磷酸二钠盐和月桂基磷酸二钠盐等。作为醚磷酸酯(A2-7)，可列举出聚氧乙烯辛基醚磷酸二钠盐和聚氧乙烯月桂基醚磷酸二钠盐等。作为脂肪酸盐(A2-8)，可列举出辛酸钠盐、月桂酸钠盐和硬脂酸钠盐等。作为非离子型表面活性剂(A3)，包含醇环氧烷烃(以下，将环氧烷烃简称为AO)加成物(A3-1)、烷基苯酚AO加成物(A31)、脂肪酸AO加成物(A3_;3)和多元醇型非离子型表面活性剂(A3-4)等。作为表示非离子型表面活性剂的亲水性和疏水性的标准，已知HLB。HLB的值越高，表示亲水性越高。本发明中的HLB是指利用下述式(1)计算而得到的数值(藤本武彦著、表面活性剂入门、142页、三洋化成工业株式会社发行)。HLB = 20X {亲水基团的分子量/表面活性剂的分子量} (1)从分泌效率的方面来看，非离子型表面活性剂(Α； )的HLB优选为0 13，进一步优选为5 12，更进一步优选为8 12。作为醇AO加成物(A3-1)，包含聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚。作为(A3-1)，具体地说，包含碳原子数为8 M的高级醇(癸醇、十二烷醇、椰油烷基醇、十八烷醇和油醇等)的环氧乙烷(以下，环氧乙烷简称为E0) 0 20摩尔和/或环氧丙烷(以下，环氧丙烷简称为P0) 1 20摩尔加成物(包含嵌段加成物和/或无规加成物。以下相同)[例如，癸醇的EO 8摩尔/PO 7摩尔嵌段加成物]。作为(A3-1)，更具体地说，可列举出月桂醇EO 7 摩尔加成物(HLB = 12. 4)、油醇EO 5摩尔加成物(HLB = 9. 0)、油醇E06摩尔加成物(HLB =10. 2)、油醇EO 7摩尔加成物(HLB= 11.0)和油醇EO 10摩尔加成物(HLB = 12. 4)、1， 2-十二烷二醇单氧乙烯加成物等。作为烷基苯酚AO加成物(A3-2)，包含具有碳原子数为6 M的烷基的烷基苯酚 AO加成物。作为(A3-2)，具体地说，可列举出辛基苯酚的EO 1 20摩尔和/或PO 1 20摩尔加成物以及壬基苯酚的EO 1 20摩尔和/或PO 1 20摩尔加成物等。另外，TRITONtmX-I 14 (HLB = 12. 4)、ig印al CA_520 (HLB = 10. 0)和 ig印al CA_630 (HLB = 13. 0) 等能够容易从市场获得。作为脂肪酸AO加成物(A3-3)，包含碳原子数为8 对的脂肪酸(癸酸、月桂酸、 肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和椰油脂肪酸等)的EO 1 20摩尔和/或POl 20摩尔加成物。作为(A3-3)，具体地说，可列举出油酸EO 9摩尔加成物(HLB= 11. 8)、二油酸EO 12摩尔加成物(HLB = 10. 4)、二油酸EO 20摩尔加成物(HLB = 12. 9)和硬脂酸EO 9摩尔加成物(HLB = 11.9)等。作为多元醇型非离子型表面活性剂(A3-4)，包含碳原子数为3 36的2 8元多元醇(甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨聚糖等)的EO和/或PO加成物；所述多元醇的脂肪酸酯及其EO加成物、以及蔗糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺(椰油脂肪酸二乙醇酰胺等)和它们的AO加成物。作为(A3-4)，具体地说，可列举出山梨聚糖四油酸酯 EO加成物(HLB = 11.4)和山梨聚糖六油酸酯EO加成物(HLB = 10. 2)等。作为阳离子表面活性剂(A4)，包含胺盐型阳离子表面活性剂(A4-1)和季铵盐型阳离子表面活性剂(A4-2)等。作为胺盐型阳离子表面活性剂(A4-1)，包含将伯 叔胺用无机酸(盐酸、硝酸、硫酸、氢碘酸等)或有机酸(乙酸、甲酸、草酸、乳酸、葡糖酸、己二酸、烷基磷酸等)中和而得到的物质。例如，作为伯胺盐型的阳离子表面活性剂，可列举出脂肪族高级胺(月桂胺、硬脂胺、鲸蜡基胺、氢化牛脂胺、松香胺等高级胺)的无机酸盐或有机酸盐；低级胺类的高级脂肪酸(硬脂酸、油酸等)盐等。作为仲胺盐型的阳离子表面活性剂，可列举出例如脂肪族胺的环氧乙烷加成物等的无机酸盐或有机酸盐。另外，作为叔胺盐型的阳离子表面活性剂， 可列举出例如脂肪族胺(三乙胺、乙基二甲基胺、N, N, N’，N’ -四甲基乙二胺等)、脂肪族胺的环氧乙烷0摩尔以上)加成物、脂环式胺(N-甲基吡咯烷、N-甲基哌啶、N-甲基环己亚胺、N-甲基吗啉、1，8_ 二氮杂双环(5，4，0)-7_十一碳烯等)、含氮杂环芳香族胺(4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑、4，4’ -联吡啶等)的无机酸盐或有机酸盐；三乙醇胺单硬脂酸酯、硬脂酰胺乙基二乙基甲基乙醇胺等叔胺类的无机酸盐或有机酸盐等。作为季铵盐型阳离子表面活性剂(A41)，包含通过叔胺类与季铵化剂(氯甲烷、 溴甲烷、氯乙烷、氯化苄、二甲基硫酸等烷基化剂；环氧乙烷等)的反应而得到的物质。例如，可列举出月桂基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、二辛基二甲基溴化铵、硬脂基三甲基溴化铵、月桂基二甲基苄基氯化铵(苯扎氯铵)、氯化十六烷基吡啶鐺、聚氧乙烯三甲基氯化铵、硬脂酰胺乙基二乙基甲基甲硫酸铵等。作为表面活性剂(A)，从分泌效率的方面来看，优选为两性表面活性剂、阴离子型表面活性剂和HLB为0 13的非离子型表面活性剂，进一步优选为羧酸盐型两性表面活性剂(Al-I)、醚羧酸(A2-1)、磺酸盐(A2-4)、高级醇AO加成物(A3-1)和多元醇型非离子型表面活性剂(A3-4)，特别优选为聚氧乙烯十三烷基醚乙酸钠盐(聚氧乙烯十三烷基醚乙酸(A2-1)的钠盐)、椰油脂肪酸二乙醇酰胺(A3-4)、椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜碱(Al-H)、l，2-十二烷二醇单氧乙烯加成物(A3-1)、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱 (A1-1-2)、氢化椰油脂肪酸酰胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜碱(A1-1-2)、椰油基氨基丙酸钠 (A1-1-1)、十二烷基二苯基醚二磺酸钠盐(A2-4)、聚氧乙烯月桂基醚乙酸钠盐(聚氧乙烯月桂基醚乙酸(A2-1)的钠盐)、高级醇EO加成物(A3-1)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐(聚氧乙烯月桂基醚硫酸(A2-3)的钠盐)、癸醇EO加成物(A3-1)。本发明中，关于表面活性剂(A)，可以直接使用表面活性剂(A)，也可以根据需要与水混合，作为水性稀释液(水溶液状或水分散液状)使用。水性稀释液中的表面活性剂㈧的总浓度根据对象微生物、生理活性物质的种类和提取方法的种类适当选择，从有用物质的分泌性和操作性的方面来看，以水性稀释液的重量为基准计，优选为0. 1重量％ 99重量％，更优选为1重量％ 50重量％。从生产率的方面来看，使用本发明的表面活性剂进行有用物质的生产时的分泌效率(％ )优选为1 100，进一步优选为5 100，更进一步优选为10 100，特别优选为 50 100。表面活性剂的分泌效率表示通过表面活性剂而使细菌内的有用物质分泌到细菌外(培养液中)。需要说明的是，本发明中，分泌效率由下式定义。分泌效率(%) = 100X {(X/Y)-Z}X 利用离心分离除去菌体后残留的培养液中的有用物质Y 培养液中的全部有用物质Z 表示溶菌的细菌的比例，由下式定义。Z = Ζ1/Ζ2Zl 利用离心分离除去菌体后残留的培养液中的细胞质内存在物质Ζ2 培养液中的全部细胞质内存在物质需要说明的是，细胞质内存在物质是指存在于细胞质内的物质，指通过溶菌而溶解到培养液中的物质。关于分泌效率，例如若使在细菌内生产的蛋白质更加向周质移动，则分泌效率提高，若更加不使蛋白质向周质移动，则分泌效率降低。另外，通过筛选来选择分泌效率高的表面活性剂，能够提高分泌效率。本发明的有用物质的生产方法中使用的表面活性剂(A)的用量(重量％ )根据对象微生物、所生产的有用物质的种类和提取方法的种类适当选择，从分泌效率和难以使蛋白质变性的方面来看，以培养液的重量为基准计，优选为0.0001 10，进一步优选为 0. 005 10，更进一步优选为0. 1 5。表面活性剂(A)除了预先与培养液混合后使用以外，也可以之后添加到悬浮有微生物的培养液中。与培养液的混合可以通过以下方式进行在4°C 99°C下向培养液中添加表面活性剂(A)，用搅拌桨或搅拌子等进行搅拌。之后混合时，可以一边用搅拌桨等搅拌一边添加，从而进行混合。使用表面活性剂(A)时，除了单独使用上述表面活性剂以外，也可以将多种混合使用。本发明中干燥菌体密度表示，在有用物质的分泌生产中，从培养开始时至培养结束时为止的任意时刻在IL培养液中所含有的细菌的重量。需要说明的是，该细菌的重量是指干燥状态的细菌的重量。干燥菌体密度由下述步骤(1) (5)求得。步骤(1):预先测定容器(离心管)的重量。
步骤O)将IOOml培养液加入到步骤(1)中测定了重量的容器中，进行离心分离 (4，000G、15分钟、4°C )，除去上清，收集细菌。步骤(3)利用0. 9重量％ NaCl水溶液[与步骤⑵中使用的培养液相同体积] 清洗容器中的收集的细菌，再次离心分离0，0006、15分钟、4°0，除去上清，收集细菌。步骤⑷将步骤(3)中得到的细菌以装入容器中的状态在105°C下干燥10小时后，测定容器和细菌的总重量。步骤(5)在步骤(4)之后再在105°C下干燥2小时，然后测定容器和细菌的总重量，确认无重量变化。进而若重量减少，则在105°C下持续干燥至无重量变化。将步骤( 和步骤(1)的测定值与步骤( 中使用的培养液的体积(L)代入下式， 由此求得干燥菌体密度。干燥菌体密度(g/L)=([步骤(5)的测定值]-[步骤(1)的测定值])/0. 1以培养液的体积为基准计，本发明的有用物质的生产方法中的干燥菌体密度为 1. 5g/L 500g/L，优选为3g/L 200g/L，进一步优选为4g/L 100g/L。干燥菌体密度小于1. 5g/L时，有用物质的生产量差，若该值超过500g/L，则难以实施有用物质的生产。从能够实施有用物质的生产的方面来看，以培养液的体积为基准计，细菌为大肠杆菌时的干燥菌体密度为1. 5g/L 500g/L，优选为3g/L 100g/L，进一步优选为10g/L 50g/L，最优选为 12g/L 27g/L。本发明的有用物质的生产方法中，若干燥菌体密度在上述范围内，则干燥菌体密度越大，有用物质的生产量越增加。本发明的有用物质的生产方法中，从有用物质的生产量的方面来看，干燥菌体密度在上述范围内的时间优选为分泌有用物质的工序所需要的时间的10%以上，进一步优选为50%以上。关于干燥菌体密度，例如通过在充分的通气条件下使用半分批培养法以适当的速度进行流加，能够增加干燥菌体密度，通过在受限的通气条件下进行分批培养，能够减少干燥菌体密度。另外，通过延长从培养开始至加入表面活性剂为止的时间，能够增加干燥菌体密度，通过缩短从培养开始至加入表面活性剂为止的时间，能够减少干燥菌体密度。另外， 若减缓表面活性剂的投入速度，则能够增加干燥菌体密度，若加快表面活性剂的投入速度， 则能够减少干燥菌体密度。本发明的有用物质的生产方法中，进行有用物质的分泌生产的生产方法含有包括下述工序(a)和(b)的细胞外分泌生产方法。下述工序中，分泌生产有用物质的工序为工序(a)。工序(a)使培养生产有用物质的细菌(革兰氏阴性细菌等)的培养液和表面活性剂同时存在，将有用物质分泌到细胞外(培养液中)的工序。工序(b):在工序(a)后，从培养液分离有用物质的工序。以下，示出本发明的使用表面活性剂的有用物质的生产方法的一个例子。(i)基因重组(i-1)从表达目标蛋白质的细胞分离信使RNA (mRNA)，由该mRNA合成单链的cDNA， 接着合成双链DNA，将该双链DNA重组到噬菌体DNA或质粒中。将所得到的重组噬菌体或质粒转化到宿主大肠杆菌中，制作cDNA文库。
(i-2)作为筛选含有目标DNA的噬菌体DNA或质粒的方法，可列举出噬菌体DNA或质粒与编码目标蛋白质基因或互补序列的一部分的DNA探针的杂交法。(i-3)从筛选后的噬菌体或质粒切出作为目标的克隆化DNA或其一部分，将该克隆化DNA或其一部分连接到表达载体中的启动子的下游，从而能够制作目标基因的表达载体。也可以同时连接编码进行内膜移动的信号肽序列(在周质表达目标物质的信号肽序列)的DNA。(ii)培养(ii-Ι)用表达载体转化宿主细菌，制作重组细菌，并对重组细菌进行前培养。关于前培养，在琼脂培养基上、通常15°C 43°C下进行3小时 72小时。(ii-2)对于用于有用物质的生产的培养液，在121°C下进行20分钟高压釜灭菌， 在其中培养用琼脂培养基进行了前培养的重组细菌。培养通常在15°C 43°C下进行12小时 72小时。需要说明的是，与培养开始同时使用表面活性剂(A)的情况下，将表面活性剂 (A)和培养液混合并均勻化，将所得到的物质用作培养液并进行相同的操作。另外，在培养后6小时至72小时后加入表面活性剂(A)的情况下，加入表面活性剂后继续培养1小时 1000小时。(iii)纯化(iii-1)对于分泌到培养液中的蛋白质，利用离心分离、中空纤维分离、过滤等分离微生物和微生物残留。(iii-2)对于含有蛋白质的培养液，反复进行离子交换柱、凝胶过滤柱、疏水柱、亲和柱和超滤柱等柱处理，根据需要适当进行乙醇沉淀、硫酸铵沉淀和聚乙二醇沉淀等沉淀处理，从而分离纯化。对于(iii-Ι)中分离的宿主细胞，之后供给新的培养液，从而能够进一步培养。将其培养液等进一步供给到(iii)的工序进行纯化，反复培养，从而能够进行有用物质的连
续生产。作为上述(iii)的蛋白质的分离/取出工序中的柱色谱法中使用的填充剂，可列举出氧化硅、葡聚糖、琼脂糖、纤维素、丙烯酰胺和乙烯基聚合物等，市售品系列、S印hacryl系列、S印harose系列(以上由Pharmacia公司制造)、Bio_Gel系列(Bio-Rad 公司制造)等。通过使用本发明的有用物质的生产方法，能够在短时间内获得高收量，因此能够实现高生产量。另外，本发明的有用物质的生产方法中，有用物质被分泌到培养液中，因此有用物质的纯化容易。由本发明的生产方法得到的有用物质是通过上述方法获得的，因此与以往相比， 其比活性高。本发明的有用物质生产方法包括以下工序使表面活性剂和细菌同时存在，将有用物质分泌到培养液中。该工序中，推测只要细菌存活，则细菌能够制作有用物质并将其分泌到培养液中。此外推测，只要细菌具有制备有用物质的能力，则无论所制备的有用物质的种类如何，均能够使用本发明的生产方法。在细菌内制作的有用物质移动到细菌的周质时，本发明的有用物质生产方法特别有效。通过有用物质移动到周质，有用物质容易被分泌到培养液中。
本发明的另一方式为本发明的有用物质生产方法中使用的表面活性剂。本发明的表面活性剂在使用细菌生产有用物质(蛋白质等)时添加。本发明的表面活性剂难以破坏细菌，细菌能够连续地生产有用物质，能够飞跃性
地提高生产量。通过使用本发明的表面活性剂进行细菌的培养，能够不使细菌死亡地培养，因此能够达到足够工业水平的生产的菌体密度，并且能够进行有用物质的分泌生产。其结果，纯化容易且能够达到高生产量。作为本发明的表面活性剂，为上述表面活性剂(A)。实施例通过以下的实施例、比较例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不限定于此。 需要说明的是，只要没有特别记载，则份表示重量份。菌株的制作、菌体重量的测定、ELISA测定和SDS-PAGE等根据本领域技术人员所进行的标准方法来进行。〈制造例1>使用引物1和2 (表4)，通过PCR法扩增大肠杆菌株W3110的碱性磷酸酶(phoA) 基因。利用限制酶NdeI和BamHI处理PCR片断后，连接到pET_2^质粒(Novagen公司)的 NdeI限制酶切位点和BamHI限制酶切位点。之后使用λ DE3溶源化试剂盒(Novagen公司制造)，将该质粒转化到对大肠杆菌株AGl (ToYoBo (东洋纺绩株式会社制造)进行修饰而制作的AG1(DE3)大肠杆菌株中，制作碱性磷酸酶表达株(α)。根据METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121页的方法分析并确认所表达的碱性磷酸酶存在于周质部分。〈制造例2>使用引物3和4 (表4)，通过PCR法扩增大肠杆菌株W3110的torA基因。利用限制酶NdeI和BamHI处理PCR片断后，连接到pET_2^质粒(Novagen公司制造)的NdeI限制酶切位点和BamHI限制酶切位点。之后将该质粒转化到AGl (DE3)大肠杆菌株中，制作 TorA表达株(β )。根据METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121页的方法分析并确认所表达的TorA存在于周质部分。〈制造例3>使用引物5和6(表4)，通过PCR法扩增大肠杆菌株W3110的pdxA基因。利用限制酶NdeI和BamHI处理PCR片断后，连接到pET_2^质粒(Novagen公司制造)的NdeI限制酶切位点和BamHI限制酶切位点。之后将该质粒转化到AGl (DE3)大肠杆菌株中，制作 PdxA表达株(Y )。根据METHODS IN ENZYM0L0GY 353卷2002年121页的方法分析并确认所表达的PdxA存在于细胞质部分。〈分泌效率的筛选〉<A-0>根据下述(1) G)，求出不使用表面活性剂时的大肠杆菌(α)和(β)的分泌效率。(1)将制造例1 3中得到的大肠杆菌(α )、( β )和(γ )分别接种到ImL LB培养液(细菌用胰化蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、NaCl 10g/L、氯霉素30mg/L)中，在37°C 下振荡培养一晚，制作培养液。
(2)使用离心机进行菌体收集(4，000G、4°C、15分钟)，重悬浮于ImL TB培养液 (Difco公司制造)中，加入氯霉素(30mg/L)和IPTG(100 μ M)，在37°C下振荡培养3小时， 从而进行phoA、torA或pdxA的表达诱导。(3)之后再次使用离心机进行菌体收集(4，000G、4°C、15分钟)，重悬浮于2. 5mL 的 Tris-NaCl 缓冲液(50mM Tris (pH7. 5) UOOmM NaCl)中，进行 25 μ L 分注，与 25 μ L 的 Tris-NaCl缓冲液混合。(4)之后在37度保温1小时。取出上清液，用Tris-NaCl缓冲液稀释成适当的浓度后，通过使用了抗His标签抗体的ELISA测定进行重组蛋白量的定量。对于(3)的离心分离前的样品，也在超声波处理O00WU0分钟)后同样地进行ELISA测定，对重组蛋白进行定量。使用大肠杆菌(Y)计算出溶菌的细菌的比例，通过下式计算出大肠杆菌(α)和大肠杆菌(β)的重组蛋白的分泌效率，归纳于表1。需要说明的是，表1中，“0”表示分泌效率为0%，“_”表示没有进行分泌效率的测定。分泌效率(％) = 100Χ {(Χ/Υ)-Ζ}X 使用大肠杆菌(α )或(β )的情况下通过离心分离除去菌体后残留的培养液中的重组蛋白的量Y:使用大肠杆菌(α)或(β)的情况下培养液中的全部重组蛋白的量Z 通过大肠杆菌(Y)求出的溶菌的细菌的比例Z = Ζ1/Ζ2Zl 使用大肠杆菌(Y)的情况下通过离心分离除去菌体后残留的培养液中的重组蛋白的量Ζ2 使用大肠杆菌(Y)的情况下培养液中的全部重组蛋白的量<大肠杆菌(α )的分泌效率的测定>“X”是使用大肠杆菌(α )进行上述⑴ ⑷时的重组蛋白量的测定值，为0. 0， 其通过取出上述的上清液并用Tris-NaCl缓冲液稀释成适当的浓度后利用使用了抗 His标签抗体的ELISA测定(利用分光光度计“SUNRISE THERMO”、Wako (和光纯药工业株式会社制造)进行了定量)求得。“Y”是使用大肠杆菌(α )进行上述⑴ ⑷时的重组蛋白量的测定值，为2. 5， 其通过对进行上述(3)的离心分离前的样品进行超声波处理(200W、10分钟)后，进行与 “X”中的操作相同的ELISA测定而求得。“Ζ1”是使用大肠杆菌(Y)进行上述⑴ (4)时的重组蛋白量的测定值，为0.0， 其通过取出上述的上清液并用Tris-NaCl缓冲液稀释成适当的浓度后进行与“X”中的操作相同的ELISA测定而求得。“Ζ2”是使用大肠杆菌(Y)进行上述⑴ (4)时的重组蛋白量的测定值，为1. 1， 其通过对进行上述(3)的离心分离前的样品进行超声波处理O00WU0分钟)后，进行与 “X”中的操作相同的ELISA测定而求得。由ELISA测定求得的测定值在与蛋白质量成比例的浓度范围内进行测定。还能够由ELISA测定的测定值求出蛋白质量的定量值。由这些蛋白质量的测定值求出未使用表面活性剂时的大肠杆菌(α)的分泌效率。
大肠杆菌(α)的分泌效率=100Χ{(0. 0/2. 5)-(0. 0/1. 1)} =0<A-1>对于大肠杆菌(α)和大肠杆菌(β )，分别在A-O的(3)中将大肠杆菌重悬浮于缓冲液中后，立即加入以菌体悬浮液的重量为基准计为1重量％的聚氧乙烯(3摩尔)十三烷基醚乙酸钠作为表面活性剂(A)，除此之外与上述同样地进行培养，根据上述定义计算出分泌效率，归纳于表1。<Α-2 Α-82>对于大肠杆菌(α)和大肠杆菌(β)，在A-I中将聚氧乙烯(3摩尔)十三烷基醚乙酸钠变更为表1所述的表面活性剂和量，除此之外与A-I同样地计算出分泌效率，归纳于表1 3。需要说明的是，表2和表3中，“0”表示分泌效率为0%，“_”表示未进行分泌效率的测定。另外，测定大肠杆菌(β)的分泌效率是为了确认即使大肠杆菌生产的蛋白质的种类发生变化，通过表面活性剂(A)的添加，大肠杆菌也表现出同样的分泌效率的倾向。对于大肠杆菌(β)的分泌效率，分别对使用Α-1、Α-3或Α-6的表面活性剂作为表面活性剂 (A)的情况进行了测定。[表1]
权利要求
1.一种有用物质生产方法，所述有用物质生产方法通过培养液中所含的细菌将有用物质分泌生产到培养液中，其中培养液中含有表面活性剂(A)；以培养液的体积为基准的干燥菌体密度为1. 5g/L 500g/L。
2.如权利要求1所述的有用物质生产方法，其中，表面活性剂(A)为选自由两性表面活性剂、阴离子型表面活性剂和HLB为0 13的非离子型表面活性剂组成的组中的至少1 种。
3.如权利要求1或2所述的有用物质生产方法，其中，有用物质为蛋白质。
4.如权利要求3所述的有用物质生产方法，其中，在细菌内表达的蛋白质为具有向周质移动的性质的蛋白质。
5.如权利要求1 4的任一项所述的有用物质生产方法，其中，细菌为大肠杆菌。
6.如权利要求1 5的任一项所述的有用物质生产方法，其中，以培养液的重量为基准计，表面活性剂的用量为0. 0001重量％ 10重量％。
7.如权利要求1 6的任一项所述的有用物质生产方法，其中，表面活性剂的分泌效率为 100%。
8.一种表面活性剂，其在权利要求1所述的有用物质生产方法中使用。
9.如权利要求8所述的表面活性剂，其中，表面活性剂(A)为选自由两性表面活性剂、 阴离子型表面活性剂、HLB为0 13的非离子型表面活性剂组成的组中的至少1种。
10.如权利要求8或9所述的表面活性剂，其中，有用物质为蛋白质。
11.如权利要求8 10的任一项所述的表面活性剂，其中，细菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种在表面活性剂的存在下使用大肠杆菌等细菌在工业规模下生产有用物质(蛋白质等)的生产方法以及在该有用物质生产方法中使用的表面活性剂。本发明所涉及的有用物质生产方法和在该有用物质生产方法中使用的表面活性剂中，所述有用物质生产方法通过培养液中所含的细菌将有用物质分泌生产到培养液中，所述培养液中含有表面活性剂(A)，以培养液的体积为基准的干燥菌体密度为1.5g/L～500g/L。进一步优选的有用物质生产方法中，表面活性剂(A)为选自由两性表面活性剂、阴离子型表面活性剂和HLB为0～13的非离子型表面活性剂组成的组中的至少1种。
文档编号C12P21/02GK102449160SQ20108002278
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月26日 优先权日2009年5月29日
发明者山口俊一郎, 柳原芳充 申请人:三洋化成工业株式会社