一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法，该 方法是通过对snap标签蛋白进行拆分所得的两部分片段，分别与被研究的一对蛋白进行 融合；若被研究的蛋白之间存在相互作用，则融合蛋白被snap标签蛋白底物共价修饰，通 过英光成像或斑点免疫印迹的方法检测蛋白质之间的相互作用。该方法具体涉及snap标 签蛋白在41位、75位的拆分及与被研究相互作用的蛋白质的融合，融合蛋白的纯化，和检 测蛋白相互作用的实验方法。被研究相互作用的蛋白质对为；一、FKBP蛋白和FRB蛋白，由 雷帕霉素（rapamycin)介导相互作用；二、亮氨酸拉链（leu-zipper)。
【背景技术】
[0002] 蛋白质相互作用在很多生物过程中，和许多疾病中（例如癌症）都扮演者不可或缺 的角色，例如DNA的复制等都是由大量的蛋白质相互作用参与联系的。蛋白相互作用形式 多样：蛋白质可能会持续相互作用很长时间，来组成更加复杂的蛋白质复合体；也可能作 为转运蛋白，携带另一种蛋白，例如蛋白的跨膜运输；或者短暂的与其他蛋白质相互作用一 下，例如一种蛋白激酶给另一个目标蛋白的添加磯酸基团。蛋白质相互作用目前正从生物 化学、量子化学、分子动力学、化学生物学、信号转导和其他代谢性或遗传/表观遗传网络 等角度进行研究。也正说明蛋白质相互作用是任何活细胞该个生命过程的核也。
[0003] 正因为蛋白相互作用研究的重要性，蛋白相互作用检测模型一直W来得到的广大 的开发和应用。蛋白相互作用检测模型也在不同层面开发出很多的工具。蛋白相互作用检 测的生物学方法通常包含W下几种：
[0004] (1)酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术。该两种方法，可W提供较快的方式 进行蛋白质相互作用的鉴别。但是在绘制蛋白质相互作用网络中具有很大的局限性。酵 母双杂交技术具有很高的假阳性率；而串联亲和纯化需要在体外进行，破坏了蛋白所 处的原始环境。并且两种方法均不能提供相互作用的亚细胞定位信息（Fields, S. and 0. Song(1989). "A novel genetic system to detect protein-protein interactions. "N ature340 (6230):245-246. )(Rigaut, G., et al. , A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol, 1 999. 17(10) :p. 1030-2. )〇
[0005] (2)能量共振转移技术，它是基于两个英光团之间的激发能量转移形成的，当该 两个英光团处于足够近的空间位置和相对宽松的方向时，就能够发生。该技术的优势在于 能够直观观测蛋白质相互作用的情况，并且不会破坏蛋白质所处于的原始环境。由于英 光团需要足够距离的接近才能够产生能量共振转移现象，因此，该技术还能够在一定程度 上指示相互作用蛋白质之间的相对距离（Sourj;Lk, V. and H. C. Berg(2004). "F^mctional interactions between receptors in bacterial chemotaxis. "Nature428(6981):437-4 41.)，也由于此产生假阳性结果，该技术无法判别蛋白是直接相互作用，还是在一个蛋白复 合体上。
[0006] ( 3 )蛋白质片段互补技术，它被用来研究在活细胞内生物学相关蛋白的相互作用。 其原理是：一个蛋白，通常是一个酶或英光蛋白，被拆分为两个片段，该两个片段单独都不 会有功能而且该两个片段不能自发重装配，拆分的片段分别被融合在可能发生相互作用的 蛋白质上，由相互作用引发的拆分片段重装配会导致蛋白质功能的恢复，该可W通过蛋白 质活性或英光进行检测（Michnick, S. W. Protein fragment complementation strategies for biochemical network mapping. Curr. Opin. Biotechnol. 2003. 14:610-7.)。目前，许 多蛋白被用来进行拆分和重装配实验，包括目-内醜胺酶，英光素酶，二氨叶酸还原酶，绿 色英光蛋白及其突变体例如黄色英光蛋白。
[0007] 该技术与之前所描述的技术相比有许多优点；有越来越多的蛋白和酶可供选择。 拆分e -半乳糖巧酶依赖酶促反应，信号能够被放大，该方法灵敏度很高（Eglen，R. M. and Singh, R. P -Galactosidase enzyme fragment complementation as a novel technology for high-throughput screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 2003. 6:381-7.)。 拆分目-内醜胺酶除了具有拆分目-半乳糖巧酶模型一样的优点外，还在真核生物和 原核细胞没有直系同源（Galarneau, A. , Primeau, M. , Trudeau, L. E. and Michnick, S. W. P-Lactamase protein fragment complementation assays as in vivo and in vitro sensors of protein-protein interactions. Nat. Biotechnol. 2002. 20:619-22.)，降低 了模型检测时的背景信号。但是，该些技术均不能反映出蛋白质相互作用在细胞中的定位 信息。
[0008] 而拆分英光蛋白，能够通过英光直观的反映出相互作用的蛋白质的亚细胞定位 信息（Hu, C. D. , Y. Chinenov, and T. K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4) :p. 789-98.)。目前该技术广泛应用于蛋白质相互 作用研究中。但是，由于拆分的英光蛋白需要较长的时间才能恢复英光特性，低的时间分辨 力限制了其在研究相互作用上的应用。
[0009] SNAP标签蛋白是DNA修复酶06-焼基鸟嘿岭-DNA焼基转移酶的突变体，大 小约20kD，它的底物是焼基鸟嘿岭，苯甲基鸟嘿岭及其衍生物（Damo i seaux，R.，Kepp 1 er, A. fejohnsson, K. Synthesis and applications of chemical probes for human 06_a化ylguanine-DNA a化yltransferase.QiemBioQiem. 2001.2:285-287. )。Snap 标签蛋 白作为研究蛋白质的一类多功能的蛋白标签，由肥B公司推出。该蛋白可通过形成融合蛋 白的方式，标记或纯化所要研究的目的蛋白质。
[0010] Snap标签蛋白在生物学研究中，具有W下优点。通过对其底物共辆基团的替换(包 括英光团，生物素和磁珠)，可使用多种实验方法对目的蛋白进行研究。其底物与snap标签 蛋白特异性的共价结合，合成底物与snap标签蛋白的反应速率与原始底物一样且具有很 快的反应速率，在蛋白质研究时具有较好的时空分辨力。该蛋白能为活细胞或固定细胞提 供简单的并且多样的蛋白质成像方法。同时，它也能用W体外蛋白质的研究。
[0011] Masayasu Mie 等人于 2012 年发表 了其研究成果（Mie, M. , T. P'Jaoki, et al. (2012). "Development of a split SNAP-tag protein complementation assay for visualization of protein-protein interactions in living cells. "Analystl37(20): 4760-4765.)，它们成功开发了一种利用snap标签蛋白来检测蛋白质相互作用的方法。但 是该方法并没有解决在检测中会出现假阳性结果的问题，在没有蛋白相互作用的介导下， snap标签蛋白片段浓度在0. InM时，还有很明显的检测信号。
[0012] 不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认该些参考文献是本发明 的现有技术。
【发明内容】
[0013] 为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰 标记检测蛋白相互作用的方法，还提供了两种snap标签蛋白拆分方法，该方法能使拆分后 所得的两部分片段通过双分子互补具有完整snap标签蛋白的活性。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在体外检测蛋 白相互作用的方法。
[0015] 本发明的第H个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在大肠杆菌中 检测蛋白相互作用的方法。
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种基于双分子互补的共价修饰标记在哺乳动物细 胞中检测蛋白相互作用的方法。
[0017] 为实现上述目的，本发明技术方案：
[0018] 本发明提供的一种基于双分子互补的共价修饰标记来检测蛋白相互作用的方法， 其特征在于，所述方法利用对snap标签蛋白的拆分所得的两部分片段，分别与被研究的一 对蛋白进行融合形成融合蛋白；若被研究的蛋白之间存在相互作用，则融合蛋白被snap标 签蛋白底物共价修饰标记，通过英光成像或斑点免疫印迹的方法在体外或在大肠杆菌、哺 乳动物细胞中检测蛋白质之间的相互作用。
[0019] 根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法，所述对snap标签蛋白拆分得到两 部分氨基酸片段，其拆分位点在snap标签蛋白的41位或75位。
[0020] 根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法，所述在体外检测蛋白质之间的相互 作用包括W下步骤：
[0021] (1)构建编码所述融合蛋白核酸序列的表达载体；
[0022] (2)在宿主细胞中表达所述融合蛋白；
[0023] (3)使用亲和纯化或蛋白质变性和复性的实验方法得到所述融合蛋白；
[0024] (4)在体外进行融合蛋白的双分子互补和共价修饰标记；
[0025] (5)通过凝胶电泳和英光成像检测蛋白质的相互作用。
[0026] 根据本发明提供的检测蛋白相互作用的方法，所述在大肠杆菌中检测蛋白质之间 的相互作用包括W下步骤：
[0027] (1)构建