专利名称：治疗肝硬化和肝纤维化的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因疗法领域，更特别的，涉及通过使用病毒载体治疗肝硬化和肝纤维化的方法。
背景技术：
肝移植是治疗罹患晚期肝硬化患者的唯一选择。由于手术禁忌症和器官稀缺，此方法只能够应用于少数患者。事实上，在美国等候名单上包括约12500患者，其进行移植的时间中数约为300天，在等候名单上有45%以上的患者超过两年，其中死亡率每年达130人 /1000 个患者(Freeman R. B.等，Am J. Transplant. 2008 ；8 :958-976)。胰岛素样生长因子I (IGF-I)是强效细胞保护和合成代谢激素。血清IGF-I主要源于肝，而且必然循环调节IGF-I生物活性的一组结合蛋白(IGFBPs) (Adamo M等，1989， Endocrinology,124 :2737-2744和 Mohan S等，2002，J. Endocrinol.，175 :19-31)。IGFBPs 的降解释放能够与IGF-I受体(IGF-IR)相互作用并活化的游离IGF-I。IGF-I还能够结合胰岛素受体，而胰岛素能够活化IGF-IR，但对它们的同源受体亲和度要高100至1000倍 (Nitert MD 等，2005，Mol. Cell. Endocrinol. 229 :31-37)。与 IGF-IR 的相互作用导致 MAP 激酶和PI3激酶级联的活化，其调节参与细胞存活、生长和分化的基因(Riedemarm J.等， 2006, Endocr. Relat. , Cancer. 13 Suppl 1 :S33_43)。在肝硬化中，由于肝细胞功能不全，IGF-I水平有明显减少。这种激素缺乏可以对存在于肝硬化中的全身代谢紊乱发挥作用(Conchillo M.等，2005 ;43 :630-636和 Lorenzo-Zuniga V.等，2006，Gut 55:1306-1312)。事实上，使用重组 IGF-I (rIGF-Ι)对肝硬化鼠的治疗促进了重量增加、氮贮留和营养物的肠吸收(Castilla-Cortazar I.等， 2000，Hepatology, 31 =592-600)。另外，已经示出rIGF-Ι在肝硬化鼠中发挥保肝护肝活性(Castilla-Cortazar I.等，1997，Gastroenterology，113 :1682-1691 禾口 Muguerza B, 等，2001，Biochim Biophys Acta. 1536 185-195)。而且，在肝硬化患者体内每日使用 10(^8/1^1^剂量的1~16 -1的近期临床试验试点导致了血清白蛋白的显著升高并提高了 Child-Pugh 评分(Conchillo Μ.等，2005，J. H印atol. 43 :630-636)。然而，因为需要大量 rIGF-I，在肝硬化中rIGF-I疗法的潜在优势被治疗的高额成本抵消。作为直接施用IGF-I的另一种可选方案，已经提出了使用包含编码IGF-I的多核苷酸的病毒载体。Vera Μ.等(Gene Ther. ,2007,14 =203-210)已经描述了将编码IGF-I 的重组猿猴病毒40载体注入健康鼠中能够保护肝脏不受CCl4诱导的肝损伤。Sobrevals 等(Molecular Therapy Volume 16，Supplement l，May 2008，S145)已经描述了施用编码 IGF-I的重组猿猴病毒40载体可以恢复CCl4诱导的肝硬化的部分效果。然而，并非所有涉及病毒载体的结果都提供了阳性结果。比如，Zaraitegui等(J. Physiol. Biochem.，2002， 58 :169-176)已经描述了对患有CCl4S导肝硬化的鼠进行肌肉内施用编码IGF-I的腺伴随病毒没有得到肝损伤的任何显著改善。因此，本领域中需要用于治疗肝硬化的改进的IGF-I递送。
发明内容
第一方面，本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列的病毒基因组，该序列可操作地与肝特异性启动子连接。第二方面，本发明涉及可通过根据本发明在合适的包装细胞内表达病毒基因组获得的病毒粒子。另一方面，本发明涉及根据本发明用作药物的病毒粒子。在还一些方面，本发明涉及包含如权利要求9所述的病毒粒子和药学上可接受的载体的药物组合物，以及用于治疗和/或预防肝硬化或肝纤维化的方法，其包含向对其所需的受试者施用权利要求8或9所述的病毒粒子。另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防肝硬化或肝纤维化的方法，其包含向需要其的受试者施用包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的重组细小病毒。另一方面，本发明涉及用于制备重组AAV病毒粒子的方法，包含以下步骤(i)使细胞接触(a)第一核酸序列，包含i.包含编码IGF-I或其同功能变体的序列的表达框，该序列可操作地与肝特异性启动子连接，和ii.位于⑴中定义的表达框的两侧的AAV 5，-ITR和3，-ITR(b)编码AAV rep蛋白的第二核酸序列(c)编码AAV cap蛋白的第三核酸序列，和任选地，(d)编码AAV依赖其复制的病毒和/或细胞功能的第四核酸序列和(ii)从细胞中回收重组AAV病毒粒子。在还另一方面，本发明涉及用于制备重组SV40病毒粒子的方法，包含-使细胞与包含复制缺陷的SV40基因组的多核苷酸接触，该基因组包含表达框， 其包含编码IGF-I或其同功能变体的序列，该序列可操作地与肝特异性启动子连接，而且其中在足以使所述多核苷酸进入细胞内的条件下细胞表达SV40基因，该SV40基因补足所述多核苷酸的复制缺陷，和-从细胞中回收重组SV40病毒粒子。
图1.建立的肝硬化模型的分析。A.用于模型分析而施行的实验的示意图。B.转氨酶的分析。在标明的时间上从健康鼠或肝硬化对照动物的血清中评估转氨酶(AST、ALT 和ALP)。C和D.肝纤维化的评定。在标明的时间上使用天狼猩红(C)染色和由图像分析 (D)定量细胞外沉积。图2.用于评估dsAAVIGF-I在肝硬化中的效果而施行的实验的示意图。诱导8周的肝硬化，处死动物，并在施用载体4天、2周、8周、16周和1年后评估血样。图3.在IGF-I治疗的肝和对照中IGF-I表达的分析。通过qRT_PCR(A)或 ELISA(B和C)从健康或肝硬化对照动物(Ci)或从标明的时间上用dsAAVLuc (Ci+Luc)或 dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治疗的动物中获得的肝(A和B)或血清(C)定量IGF-I mRNA(A)和蛋白(B和C)。同样通过RT-PCR对来自用于上述IGF-I的动物组的肝进行定量。图4.来自IGF-I治疗的鼠和对照的血清参数的分析。在来自健康鼠、来自肝硬化对照动物(Ci)或来自标明的时间上用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治疗的肝硬化动物的血清中评估转氨酶(AST、ALT和ALP) (A)、胆红素⑶和白蛋白(C)。图5.在IGF-I治疗的鼠和对照中肝纤维化的评定。使用天狼猩红㈧染色和通过图像分析(B)定量细胞外沉积。通过qRT-PCR定量I型胶原(C)和IV型胶原(D) mRNA。所有样品从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从标明的时间上用dsAAVLuc (Ci+Luc) 或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)治疗的肝硬化动物中获得。图6.在IGF-I治疗的肝和对照中MMPs和MMP活性表达的分析。使用荧光底物 (A)测量MMP活性，通过ELISA定量MMP2⑶和MMP9 (C)蛋白，并通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量匪P 1⑶、2 (E)、9 (F)、14 (G)mRNA和TIMP2 (H)。图7.在IGF-I治疗的动物和对照中致纤维性因子(profibrogenic factor)、 TNFa和IL6的分析。通过免疫组织化学(A)检测或通过qRT-PCR(B)从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量a SMA蛋白㈧和mRNA⑶。在这些动物中，在肝(C和D)或血液 (E)中也分析了 TGF β mRNA (C)和蛋白(D 和 E)，并通过 qRT-PCR 定量肝 CTGF(F)、PDGF (G)、 VEGF(H)、双调蛋白(AR、I)、TNF a (J)和 IL6 (K)mRNA。图8.在IGF-I治疗的动物和对照中HGF、HNF4 α和WT的分析。通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+Luc)或dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量HGF (A)、HNF4 α⑶和WT-ImRNA (C)。图9.在IGF-I治疗的动物和对照中增殖的分析。从组织学样品(A)中定量 Κ 67染色，并通过qRT-PCR从健康肝或从对照动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+Luc)或 dsAAVIGF-I (Ci+IGF-I)在标明的时间上治疗的动物中获得的硬化肝中定量PCNA mRNA。图10.在用SVIGF-I、dsAAV-IGF_I治疗的鼠和对照中肝纤维化的评定。用天狼猩红染色并通过图像分析(A和B)定量细胞外沉积。通过qRT-PCR定量I型胶原(C)mRNA和IV 型胶原(D)mRNA。所有样品从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)、SVLuc (Ci+SVLuc)或 SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)在标明的时间上治疗的肝硬化动物中获得。图11.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中IGF-I表达的分析。通过Elisa(A和B)或qRT-PCR(C)从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) ,SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)在标明的时间上治疗的肝硬化动物中获得的肝中定量总㈧和游离(B) IGF-I蛋白以及mRNA(C)。图12.用SVIGF-I、AAV-IGF-I治疗的鼠和对照中活化的HSC的分析。通过免疫组织化学㈧检测并通过qRT-PCR⑶从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc) ,SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治疗 4 天(Α 和 B)或8周⑶的肝硬化动物中获得的肝中量化a SMA蛋白㈧和mRNA (B)。图 13.用 SVIGF-I、dsAAV-IGF-I 治疗的鼠禾Π 对照中 TGF β、CTGF 禾Π VEGF 分析。通过qRT-PCR㈧或ELISA(B和C)从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治疗 4 天或 8 周的肝硬化动物中获得的肝(A和B)或血清(C)中定量TGFiimRNA㈧和蛋白(B和C)。图14.用SVIGF-I、dsAAV-IGF-I治疗的鼠和对照中HGF和HNF4 α的分析。从健康鼠、对照肝硬化动物(Ci)或从用 dsAAVLuc (Ci+AAVLuc)、SVIGF-I (Ci+SVIGF-I)或 dsAAVIGF-I (Ci+AAVIGF-I)治疗4天或8周的肝硬化动物中分离的肝中定量HGFmRNA (A)和 HNF4α mRNA(B)。图15.肝IGF-I表达和活性分析。A 在治疗后4天或8周在肝提取物中IGF-ImRNA 的表达水平。B 在施用载体(低剂量4. 8x IO10Vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF-I mRNA的表达水平。C 在肝提取物中IGF-I蛋白水平。D和E 治疗后4天定量总血清IGF-I⑶和游离血清IGF-I (E)水平；在ssAAVLuc的情况下，示出的IGF-I水平对应高剂量1. 2x 1012vp/ 鼠和极低剂量9. 7x IO9Vp/鼠。F 在治疗后4天或8周在肝提取物中IGF_IBP3mRNA的表达水平。G 在施用载体(低剂量4. 8x IO10Vp/鼠)后16周在肝提取物中IGF_IBP3mRNA的表达水平。H 在肝提取物中IGF-I受体(IGF-IIOmRNA的表达水平。通过qRT-PCR定量所有mRNA表达水平，并通过ELISA定量IGF-I蛋白水平。三角形表明剂量递减。图16.血清转氨酶的分析。在施用载体后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量转氨酶水平(AST、ALT和ALP)。在第12周，示出的水平对应于低剂量载体 (4. 8x IO10Vp/鼠)。在第1年，示出的水平对应于高剂量载体(1. 2x 1012vp/鼠)。三角形表明剂量递减。图17.血清胆红素的分析。在施用载体后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量胆红素水平。在第12周，示出的水平对应于低剂量载体(4. 8x IO10Vp/鼠)。 在第1年，示出的水平对应于高剂量载体(1. 2x IO12Vp/鼠)。三角形表明剂量递减。图18.血清白蛋白的分析。在施用载体后4天㈧、8周(B)、12周(C)和1年⑶ 在血清中定量白蛋白水平。在第12周，示出的水平对应于低剂量载体(4. 8x IO10Vp/鼠)。 在第1年，示出的水平对应于高剂量载体(1. 2x IO12Vp/鼠)。三角形表明剂量递减。图19.肝纤维化的评定。通过在用天狼猩红(A和C)染色的组织样品中细胞外沉积的图像分析定量；通过qRT-PC在肝组织中I型胶原(B和D)和IV型胶原(C和F)mRNA 的表达水平定量来评估肝纤维化。示出的数据对应于治疗后8周(A至C)和治疗后16周 (D至F)采集的样品。在后一种情况下，示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF_I。 三角形表明剂量递减。图20. MMPs和MMP抑制剂的分析。在治疗后8周(A至H)或16周(I-M)获得肝提取物样品。ssAAVIGF-I的E和F示出数据对应于高剂量和极低剂量。在后一种情况下， 示出的数据对应于低剂量(4. 8x IO10Vp/鼠)ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量 MMP1(A，I)、MMP2(B，J)、MMP9(C，K)、MMP14(D，L)和 TIMP_2(E，M)的 mRNA 表达。通过 ELISA 定量MMP2(F)和MMP9(G)蛋白水平。还评估了总MMP活性(H)。三角形表明剂量递减。图21.肝星状细胞(HSCs)的分析。在治疗后8周(A-B)或16周(C)获得的肝样品中分析α SMA表达。在后一种情况下，显示的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。 A 通过α SMA特异性免疫组织化学定位肝组织中的α SMA。B和C 通过qRT-PCR定量α SMA mRNA。三角形表明剂量递减。图22.炎症和致纤维性因子的分析。在治疗后8周(A、C、E、G、I、K和M)或16周(B、D、F、I、J、L和N)获得肝提取物样品。在后一种情况下，示出的数据对应于低剂量 ssAAVLuc 和 ssAAVIGF-L· 通过 qRT-PCR 定量 TGF β ,TNFa、IL-6、CTGF、VEGF、PDGF 和双调蛋白(AR)mRNA的表达水平。三角形表明剂量递减。图23.肝细胞生长因子HGF的分析。在治疗后4天(A-B)、8周(C-D)和16周(E) 获得肝提取物样品。A和B示出的ssAAVIGF-I数据对应于高剂量和极低剂量。在后一种情况下，示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量HGF mRNA表达(A、C和E)；通过ELISA定量HGF蛋白水平(B和D)。三角形表明剂量递减。图24.分化因子的分析。在治疗后4天㈧、8周(B，D)和16周(C，E)获得肝提取物样品。第4天示出的ssAAVLuc剂量对应于极低剂量。第16周示出的数据对应于低剂量ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。通过qRT-PCR定量成熟因子HNF4a(A、B和C)和分化因子 WT-I (D和E)mRNA的表达水平。三角形表明剂量递减。图25.增殖的分析。在治疗后4天获得的肝组织样品中Ki67染色细胞核的定量。 B、C和D 通过qRT-PCR在治疗后4天⑶、8周(C)或16周⑶获得的肝提取物样品中定量增殖因子PCNA mRNA的表达水平。第4天示出的ssAAVLuc数据对应于极低剂量。第16 周示出的数据对应于低剂量的ssAAVLuc和ssAAVIGF-I。三角形表明剂量递减。发明详述本发明的作者已经观察到，对患有既定肝硬化的鼠施用编码IGF-I的病毒载体 (其中编码IGF-I的多核苷酸在肝特异性启动子的控制下)激活了强大的组织修复程序，其特征在于刺激纤维分解、下调致纤维性因子并诱导细胞保护分子。这些改变与肝结构和肝细胞功能的明显改善有关。这些发现表明，用AAV载体将IGF-I基因向硬化肝的转移可以是患者的潜在治疗选择，所述患者罹患晚期肝硬化而不能接受肝移植或在等候移植的名单上病情恶化。病毒基因组本发明的作者已经观察到，使用病毒载体(其中编码IGF-I的序列在肝特异性启动子的控制下)将IGF-I转移到硬化肝中导致肝功能改善并降低肝纤维化(参见本发明的实施例3和10)。因此，第一方面，本发明涉及包含编码IGF-I或其同功能变体的核苷酸序列(其可操作地与肝特异性启动子连接)的病毒基因组。如本文所使用的，术语“病毒基因组”是指包含一个或多个异源性核苷酸序列的重组病毒基因组(即病毒DNA)。优选地，所有其他结构性和非结构性编码序列都不存在于病毒载体中，因为它们能够通过载体，如质粒或通过将序列稳定并入包装细胞系中反式提供。 载体可以用于在体外、在体内或在活体外将DNA转移到细胞中。在本发明中适合使用的病毒基因组包括但不限于，腺病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体，包括基于痘病毒的载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体或杆状病毒载体、小核糖核酸病毒载体、 疱疹病毒载体，包括EBV载体(包括慢病毒载体、基于MMLV的载体)。本文中使用的术语“核苷酸序列，，与“多核苷酸”可交换使用，涉及任何长度的由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成的任何聚合形式的核苷酸。此术语包括单链和双链多核苷酸以及修饰的多核苷酸(甲基化的、保护的，等等)。如本文所使用的，术语“IGF-I”与术语“胰岛素样生长因子I”和生长调节素C可交换使用，涉及多肽家族，其特征在于该多肽家族示出了胰岛素样效果和胰岛素样结构，与胰岛素共享近50%的氨基酸同源性。此外，通过三维建模，已经示出了 IGF的结构与作为单链肽的胰岛素原相似，通过三个二硫桥键交联并由B链样氨基末端部分(B域)、连接肽 (C域)和A链样部分(A域)组成。另外，存在在胰岛素原中未发现的羧基端延伸(D域)。 IGF-I多肽还包含另一个在胰岛素原中未发现的羧基末端延伸，已经命名为E域。用于本发明的合适的IGF-I分子包括但不限于-在NCBI上以登录号NP_001104753(SEQID NO 1)描述的多肽的氨基酸1至158、 49至158或49至116，分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型1。-在NCBI上以登录号NP_0011047M(SEQID NO :2)描述的多肽的氨基酸1至137、 33至137或33至102，分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型2。-在NCBI上以登录号NP_001104755(SEQID NO :3)描述的多肽的氨基酸1至195、 49至195或49至118，其分别对应于预前IGF-I、前IGF-I或成熟IGF-I的人同工型3。本发明还仔细考虑了来自不同动物种的编码IGF-I的多核苷酸的用途，如但不限于马鹿胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA(GenBank登录号TO2106)；马胰岛素样生长因子 I前体(IGF-I)mRNA，(GenBank登录号U28070)；山羊mRNA胰岛素样生长因子I (GenBank登录号D11378)；兔胰岛素样生长因子I前体(IGF-I) mRNA，(GenBank登录号U75390)；猪胰岛素样生长因子I (PlGF-I) mRNA，(GenBank登录号M31175)；绵羊胰岛素样生长因子I (IGF-I) mRNA, (GenBank登录号M89787)；人胰岛素样生长因子(IGF-I) IA和IB基因，外显子1， (GenBank登录号MU659和M77496)；鼠胰岛素样生长因子I (IGF-I) mRNA，(GenBank登录号 M15480)；鸡胰岛素样生长因子(IGF-I)mRNA，(GenBank登录号M32791和]\C9720)；大马哈鱼胰岛素样生长因子I(IGF-I)mRNA，(GenBank登录号M32792)；非洲爪蟾胰岛素样生长因子 I (IGF-I) mRNA，(GenBank 登录号]\C9857)。技术人员将会理解的是，IGF-I以前体形式合成，一旦进入分泌途径便通过信号肽酶首先经历裂解步骤裂解产生前IGF-I，然后通过其C端区域的内切蛋白酶解处理而变为成熟IGF-I。因此，本发明载体中存在的核苷酸序列可以编码全长前体形式，其然后应该通过基于IGF-I内源性信号肽存在的靶细胞机制处理。可选地，还可能包括编码融合于异源信号序列的前IGF-I的多核苷酸。如本文所使用的，表述“信号序列”是指在结构基因5' 端的DNA序列，其与该基因一起转录并翻译。前导序列通常使蛋白质具有η端肽延伸，有时称为前序列。对指定分泌到细胞外介质或膜的蛋白，该信号序列将蛋白引入内质网中，其从当中释放到适当的终点。前导序列正常地由人造地源于不同基因序列或从不同基因序列分离的所需的核酸编码。适于作信号序列用于促进本发明的多核苷酸分泌的合适的异源性序列包括凝溶胶蛋白、白蛋白、血纤蛋白原的信号序列，除了别的以外，来自组织纤维蛋白溶酶原活化因子、胰岛素和神经生长因子(NGF)的信号肽。技术人员还会理解的是，只要病毒基因组的长度不超过病毒衣壳的包装大小限度，本发明的病毒基因组可以包含编码IGF-I的部分或全部基因组序列，在此情况下， IGF-I的编码区将被内含子区域隔开。本发明还仔细考虑了病毒基因组，其包含编码本领域已知的IGF-I变体和片段的序列，如由 Sara, V. R.等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,83 :4904-4907)、Ballard, F. J. φ (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 149 :398-404) ；Bayne φ (J. Biol. Chem. 1988,263 :6233-6239) ；Sara V. R.等(Biochem.Biophys. Res. Commun. ,1989,165 :766-771) ；Forsberg 等，1990，Biochem. J. 271 :357-363)；美国专利号 4，876，242 和 5，077，276 ；和国际专利
发明者卢西亚诺马蒂亚斯·索夫雷维斯, 哈拉尔德·佩特里, 玛丽亚普里菲卡西·福特斯阿隆索, 艾瑞克雅各布斯胡贝图斯·蒂默曼斯, 赫苏斯玛丽亚·普列托巴尔图埃彻 申请人:西马生物医学计划公司