专利名称：一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种浮游微藻的培养方法，具体涉及一种芽孢杆菌调控浮游微藻 混合培养的方法。
背景技术：
水体环境中微藻群落结构的稳定不仅与微藻的生物量有关，还与其群落多样 性指数密切相关，目前对微藻调控或对于浮游微藻的人工定向培养，多针对单种 或两种优良微藻开展，在复杂的水体环境中，容易导致某一阶段个别微藻种类过 度繁殖，水体中的微藻群落多样性指数相对偏低，不利于水环境中微藻群落的稳 定，从而造成中前期藻相难培育、中期易突变、后期过旺盛的情况。
经调査在对虾养殖池中微绿球藻、隐藻和绿色颤藻均为优势微藻，其中前两 者多被认为是优良微藻，可有效调控和优化水体环境，颤藻作为蓝藻则多被认为 是水产养殖业的有害微藻。其实绿色颤藻在各种水产养殖模式中多为常见种，即 使在优良的水体环境和微藻群落结构中亦多有存在，在多种微藻共存生长情况下 存在一定数量的绿色颤藻，可维持水体中微藻种类和生态功能的平衡，但关键必 须将数量严格控制在一定的水平，以避免优势度水平过大，妨碍甚至抑制其他优 良微藻的生长。
水体环境中的微生物与微藻间具有极其密切的联系。某些细菌能够不断的向 细胞外分泌一些有机物质，如胞外糖肽类物质，有的细菌还可以分泌类维生素物 质，促进某些微藻生长；也有的细菌分泌能溶解藻细胞的酶物质或其他活性物质， 使某些种类的微藻生长受到抑制。基于细菌与藻类间所具有的特异性，可从特定 的环境中筛选有关菌种，并以之调控多种微藻的共同生长体系，使系统中不同种 类微藻以较优比例和数量进行生长。地衣芽孢杆菌作为微生态制剂均具有较强的 产胞外酶活性，能促进水环境中的物质和能量循环，并且还能产生多种抗菌物质， 抑制病源菌的生长。由于具有无毒、无副作用、无污染、无残留等特点，它被认为是安全有效的有益微生物，并已广泛应用与农业、医药、食品、饲料加工等行 业。
因此，在进行调控水产养殖应用微藻初期培养时，根据不同种类微藻的生态 特性、细菌与藻类间所具有的特异性关系，从菌藻协同调控的基础出发，在微藻 混合培养系统中引入有益微生物，提高微藻总体数量，稳定不同微藻数量比例， 从而为在中小型对虾养殖系统中引入高效稳定的多藻种藻液，促进和优化生产初 期水环境中的微藻结构，而目前关于此的研究正是急需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，该方法 使各微藻在混合培养中生长均衡，稳定性好，避免混合培养体系中藻相的生物多 样性单一，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势。
本发明提供的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，选取优势度大于0.15 的微藻置于氮浓度为12~16mg/L、磷浓度为2~6mg/L、铁浓度为0.10 0.20mg/L 的培养液中进行混合培养，在混合培养过程中采用地衣芽孢杆菌进行调控，培养 条件为温度26 28。C，盐度12 18%。， pH7.5~8.0，光照强度4000~5000Lx，光 暗比12h : 12h 14h : 10h。
在培养液中
氮源为硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾或尿素中的一种或几种。 磷源为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或过磷酸钙中的一种或几种。 铁源为柠檬酸铁。
所述的微藻为微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的混合。
所述的微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的投放比例为0.7~1.3 : 0.7 1.3 : 0.7~1.3， 各微藻的初始投放密度为104~105cdlS/mL。
所述的芽孢杆菌的初始投放密度为104~105 CFU/mL。
在养殖水体水色为鲜绿色、豆绿色或绿褐色，养殖水体浮游微藻生物多样性 指数大于1.60的养殖池中，筛选优出势度大于0.15的微藻种类进行混合培养。 本发明的有益效果是-
(1)筛选出了多种优势微藻进行混合培养，确保了微藻藻相的多样性，并通 过地衣芽孢杆菌在培养系统中的添加，直接或间接地调控了各种微藻的数量比例，使微藻达到了均衡生长的效果；
(2) 在芽孢杆菌和各种微藻细胞增长的相关性方面采用了相关分析法，并采 用了通径分析法评价芽孢杆菌对各种微藻的影响，通过实际验证，得出了藻相稳 定性培养的相关调控措施，保证了各种微藻生长的稳定性；
(3) 以地衣芽孢杆菌平衡调控不同种类微藻的共生性培养，进而优化藻相调 控的技术模式，这可利用于优化对虾养殖池塘的微藻生态环境，避免养殖过程中 因池塘内某个单一种类微藻过度繁殖或消亡造成的藻相生物多样性单一，水环境 变化剧烈，养殖水体环境质量恶化等情况，具备实际操作性；
(4) 本发明方法可用作一种调控水产养殖应用微藻初期培养的方法，其作用 是从菌藻协同调控的基础出发，在微藻混合培养系统中提高微藻总体数量，稳定 不同微藻数量比例，从而为将高效培养的微藻引入中小型对奸养殖系统中进行初 期藻相构建与优化提供了技术储备。
具体实施例方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实 施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范 围，均可实现本发明的目的。 实施例l
选择微绿球藻(iV"朋oc/z/oro/w" ocw/ato)、隐藻(C，romonos gm ")禾口绿色賣贞 藻(0如//^0/^ cWw/"e)进行混合培养，培养过程中应用地衣芽孢杆菌CBod//^ /Zc/zem/onw'力进行调控，使系统中的各种微藻按一定比例稳定增长。
培养液为全人工配置无机培养液，陈海水煮沸冷却后加入NaN03、 KH2P04 和柠檬酸铁，使N、 P和Fe的浓度分别达到15mg/L、 2mg/L和0.12mg/L。 培 养过程中每3d测定一次氮和磷的浓度，酌情加入NaN03和KH2P04，使总氮和 磷的浓度达到初始水平。
培养过程中各个培养组的相关条件一致，以恒温循环器水浴控温，温度为 26°C， pH8.2，光照强度5000Lx，光暗比为14h : 10h，营养液的盐度为16%。。
藻相中各微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的投放比例为0.8 : 1.1 : 1.0，各微藻的 初始投放密度为8xl04Cells/mL;芽孢杆菌细胞的初始投放细胞密度为 3xl04CFU/mL;培养容器为1M3的白色透光玻璃钢桶，以白色透光塑料薄膜覆盖桶口，进行充气培养，扩培过程按照上述调控措施对藻液培养进行管理，并及 时添加相应比例的培养液。
本方法实践表明在混合培养体系中，培养初期2~4d芽孢杆菌对微绿球藻有 促进作用，但当微绿球藻密度大于106ind/mL后芽孢杆菌则抑制微绿球藻的生长； 隐藻在整个混合培养过程中均可受芽孢杆菌的促生长作用，到培养6天以后，隐 藻细胞数较对照组提高了 55%以上；虽然芽孢杆菌针对颤藻的直接作用程度小， 但通过促进或调控混合培养系统中微绿球藻和隐藻的增长，加速体系中营养的消 耗从而间接控制微藻的数量。
在培养14d后系统中添加芽孢杆菌的微藻总细胞数为10.6X106ind/mL，而 微绿球藻的细胞数为4.8X 106ind/mL较不添加芽孢杆菌的降低了 40.6%，隐藻和 绿色颤藻则分别为3.3 X 106ind/mL和2.5 X 106ind/mL,较不添加芽孢杆菌的分别 升高了 21.0%和2.5%。可见，培养过程通过利用地衣芽孢杆菌的添加促进或调 控混合培养系统中各种藻的增长，或加速体系中营养的消耗从而间接控制微藻的 数量，有效调控各种微藻的数量比例，达到均衡生长的效果，避免某种微藻的数 量出现极端优势或劣势。 实施例2
选择^t敛绿球藻(A^""oc/2/oro/w/s ora/ato)、 隐藻(O3^to附0wtw erara)禾口绿色颜 藻(6^"7/ator/" cA/w7'we)进行混合培养，培养过程中应用地衣芽孢杆菌C^^'〃w /^^w/om^)进行调控，使系统中的各种微藻按一定比例稳定增长。
培养液为全人工配置无机培养液，陈海水煮沸冷却后加入NaN03、 KH2P04 和柠檬酸铁，使N、 P和Fe的浓度分别达到16nig/L、 3mg/L和0.14mg/L。 培 养过程中每3 d测定一次氮和磷的浓度，酌情加入NaN03和KH2P04，使总氮和 磷的浓度达到初始水平。
培养过程中各个培养组的相关条件一致，以恒温循环器水浴控温，温度为 28°C， pH7.8，光照强度4800Lx，光暗比为14h : 10h，营养液的盐度为18%。。
藻相中各微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的投放比例为0.8 : 1.1 : 1.2，各微藻的 初始投放密度为10Vells/mL;芽孢杆菌细胞的初始投放细胞密度为104 CFU/mL。 培养容器为1M3的白色透光玻璃钢桶，以白色透光塑料薄膜覆盖桶口，进行充 气培养；扩培过程按照上述调控措施对藻液培养进行管理，并及时添加相应比例 的培养液。本方法实践表明在混合培养体系中，培养初期l~4d芽孢杆菌对微绿球藻有 促进作用，但当微绿球藻密度大于6.0xl0Sind/mL后芽孢杆菌则抑制微绿球藻的 生长；隐藻在整个混合培养过程中均可受芽孢杆菌的促生长作用，到培养5天以 后，隐藻细胞数较对照组提高了 50%以上；虽然芽孢杆菌针对颤藻的直接作用程 度小，但通过促进或调控混合培养系统中微绿球藻和隐藻的增长，加速体系中营 养的消耗从而间接控制微藻的数量。
在培养14d后系统中添加芽孢杆菌的微藻总细胞数为8.0xl06 ind/mL，而微 绿球藻的细胞数为3.2xl04nd/mL较不添加芽孢杆菌的降低了 38.0%,隐藻和绿 色颤藻则分别为2.8xl06ind/mL和2.0x106ind/mL，较不添加芽孢杆菌的分别升高 了 18%和2.5%。可见，培养过程通过利用地衣芽孢杆菌的添加促进或调控混合 培养系统中各种藻的增长，或加速体系中营养的消耗从而间接控制微藻的数量， 有效调控各种微藻的数量比例，达到均衡生长的效果，避免某种微藻的数量出现 极端优势或劣势。
实施例3
选择池塘水色为鲜绿色、豆绿色或绿褐色，养殖水体浮游微藻生物多样性指 数大于1.60，生产性能优良的对虾海水养殖池塘进行全程跟踪分析，筛选优势度 大于0.15以上的微绿球藻(jVa朋oc/z/ora戸^ ocw/",")、 隐藻(O，纖卵"x erara)禾口
绿色颤藻(O""toto"a CWW!'股)进行混合培养，培养过程中应用地衣芽孢杆菌
(5od//^ //c/^wz/ww的进行调控，使系统中的各种微藻按一定比例稳定增长。培 养过程中采用简单相关分析法分析芽孢杆菌和各种微藻细胞增长的相关性；以通 径分析法评价芽孢杆菌对各种微藻的影响。
培养液为全人工配置无机培养液，陈海水煮沸冷却后加入KN03、Ca(H2P04)2 和柠檬酸铁，使N、 P和Fe的浓度分别达到14mg/L、 2mg/L和0.14mg/L。 培 养过程中每3 d测定一次氮和磷的浓度，酌情加入KN03和Ca(H2P04)2，使总氮 和磷的浓度达到初始水平。
培养过程中各个培养组的相关条件一致，以恒温循环器水浴控温，温度为 26~28°C， pH7.8，光照强度4000Lx，光暗比为12h : 12h，营养液的盐度为15%。。
藻相中各微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的投放比例为1.0 : 1.0 : 1.0，各微藻的 初始投放密度为7X104Cells/mL;芽孢杆菌细胞的初始投放细胞密度为5X104 CFU/mL。培养容器为1MS的白色透光玻璃钢桶，以白色透光塑料薄膜覆盖桶口 ，进行充气培养。
扩培过程按照上述调控措施对藻液培养进行管理，并及时添加相应比例的培 养液。培养过程通过利用地衣芽孢杆菌的添加促进或调控混合培养系统中各种藻 的增长，或加速体系中营养的消耗从而间接控制微藻的数量，有效调控各种微藻 的数量比例，达到均衡生长的效果，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势。
本方法实践表明在混合培养体系中，培养初期l~4d芽孢杆菌对微绿球藻有 促进作用，但当微绿球藻密度大于6.5X 105ind/mL后芽孢杆菌则抑制微绿球藻的 生长；隐藻在整个混合培养过程中均可受芽孢杆菌的促生长作用，到培养6天以 后，隐藻细胞数较对照组提高了 51.6%;虽然芽孢杆菌针对颤藻的直接作用程度 小，但通过促进或调控混合培养系统中微绿球藻和隐藻的增长，加速体系中营养 的消耗从而间接控制微藻的数量。
在培养16d后系统中添加芽孢杆菌的微藻总细胞数为8.5X106ind/mL,而微 绿球藻的细胞数为2.9X10、nd/mL较不添加芽孢杆菌的降低了 43.5%，隐藻和绿 色颤藻则分别为2.9X 106ind/mL和2.7X 106ind/mL，较不添加芽孢杆菌的分别升 高了 19.2%和3.1%。
总体而言，通过在培养体系中添加芽孢杆菌一方面既可有效提高个别种类微 藻的增长，又可有效调控各种微藻的数量比例，达到均衡生长的效果，避免某种 微藻的数量出现极端优势或劣势。
权利要求
1、一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征在于，选取优势度大于0.15的微藻置于氮浓度为12～16mg/L、磷浓度为2～6mg/L、铁浓度为0.10～0.20mg/L的培养液中进行混合培养，在混合培养过程中采用地衣芽孢杆菌进行调控，培养条件为温度26～28℃，盐度12～18‰，pH7.5～8.0，光照强度4000～5000Lx，光暗比12h∶12h～14h∶10h。
2、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，培养液中氮源为硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾或尿素中的一 种或几种。
3、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，培养液中磷源为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或过磷酸钙中的一种或几种。
4、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，培养液中铁源为柠檬酸铁。
5、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，所述的微藻为微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的混合。
6、 根据权利要求5所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，所述的微绿球藻、隐藻和绿色颤藻的投放比例为0.7-1.3 : 0.7~1.3 : 0.7 1.3， 各微藻的初始投放密度为104 105CellS/mL。
7、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，所述的芽孢杆菌的初始投放密度为104~105CFU/mL。
8、 根据权利要求1所述的芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，其特征 在于，在养殖水体水色为鲜绿色、豆绿色或绿褐色，养殖水体浮游微藻生物多样 性指数大于1.60的养殖池中，筛选出优势度大于0.15的微藻种类进行混合培养。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，选取优势度大于0.15的微藻置于氮浓度为12～16mg/L、磷浓度为2～6mg/L、铁浓度为0.10～0.20mg/L的培养液中进行混合培养，在混合培养过程中采用地衣芽孢杆菌进行调控，培养条件为温度26～28℃，盐度12～18‰，pH7.5～8.0，光照强度4000～5000Lx，光暗比12h∶12h～14h∶10h。采用该方法在混合培养体系中使用芽孢杆菌对各微藻进行混合培养发现，各微藻生长均衡，稳定性好，可避免混合培养体系中藻相的生物多样性单一，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势。
文档编号C12R1/10GK101531977SQ200910038908
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者文国樑, 曹煜成, 李卓佳, 杨莺莺, 王少沛 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所