性淀粉 5g/L，大豆蛋白胨 5g/L，MgSO4 · 7H200. 2g/L，pH = 7. 0)中，30°C 下培养 3天，培养液以8000r/min速度离心5分钟，得到菌体沉淀。
[0028] 取0. 15g新鲜菌体于研钵（_20°C预冷）中，反复液氮研磨至细粉状，迅速装入 I. 5mL离心管中，加入TE缓冲液550 μ L，65°C预热的20% (w/v) SDS溶液30 μ L，斡旋震荡5 分钟，接着加入浓度为20mg/mL的蛋白酶Κ20 μ L，混匀，37°C水浴1小时，加等体积的苯酚： 氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1，v/v)抽提，轻轻颠倒混勾，10000r/min速度离心10分钟；吸 取上清至新离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24 : l，v/v)抽提，10000r/min速度离心 5分钟，吸取上清与等体积异丙醇（4°C预冷）混勾，10000r/min速度离心5分钟，弃上清。 沉淀用70% (v/v)酒精冲洗，干燥，加40 μ L TE缓冲液溶解，所得总DNA于-20°C保存。
[0029] 以抽提的总DNA为模板，利用细菌的16s rRNA特异性引物进行扩增。扩增的引 物为 P16SF :5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 和 P16SR :5' -AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'。以 KODPlus (Toyobo 日本）为Taq DNA 聚合酶，扩增条件依次为：94°C 30s，55°C 30s，72°C 120s， 扩增30个循环。PCR结束后，I % (w/v)琼脂糖凝胶回收，取10 μ L直接与T/A载体相连（宝 生物工程（大连）有限公司），4°C连接过夜。将连接产物转化入大肠杆菌在DH5a感受态 细胞中，获得阳性克隆，测序。测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比 分析，得到菌株与淀粉酶产色链霉菌中的16s rRNA有99%的同源性，说明该菌株为淀粉酶 产色链霉菌。
[0030] 实施例3淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取
[0031] 根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物：
[0032] Primer A :5' -AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3' 和
[0033] Primer B :5' -GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3' 为扩增引物，以总 DNA 为模板，获得 一段984bp的PCR片段。PCR反应条件为：94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s，扩增30个循环。 用1 %琼脂糖胶回收片段，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4°C连 接过夜，在DH5a感受态中高效转化，获得阳性克隆，测序。以此序列为基础，采用Genome Walking Kit试剂盒（大连宝生物公司）获取其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框， 从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。
[0034] 为扩增 5 ' 端未知序列，设计引物：FSPI : 5 ' -AGTTGCCGCGCTTGTCGGGTTCAC-3 '， FSP2 :5 ' -TGAAGGAGGTGTACGTCACCG-3 ' 和 FSP3 :5 ' -AGTCCGAGCTTGTCGACGAG-3 '。以总 DNA 为 模板，FSPl和试剂盒中的AP3Primer为引物，进行第一轮PCR反应。反应条件为：94°C lmin， 98。〇111^11;[94。0308,68。0111^11，72。0211^11(5个循环）];94。〇3〇8,25。〇311^11，72。〇211^11 ; [94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min，94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min，94°C 30s，44°C lmin， 72°C 2min(15 个循环）];72°C lOmin。
[0035] 取第一轮PCR反应产物I以1^乍为模板，以？5?2和试剂盒中的4?3?1^1^1'为引物， 进行第二轮 PCR 反应。反应条件为：[94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min，94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min，94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min(15 个循环）];72°C lOmin。
[0036] 取第二轮PCR反应产物I以1^乍为模板，以？5?3和试剂盒中的4?3?1^1^1'为引物， 进行第三轮 PCR 反应。反应条件为：[94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min，94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min，94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min(15 个循环）];72°C lOmin。将第三轮 PCR 反应 的产物用I %琼脂糖胶回收，测序，获得5'端未知序列682bp。
[0037] 用同样的方法扩增3'端未知序列，设计引物：
[0038] RSPI : 5 ' -TGGAGACCGTCGCCGAGAACG-3 '，RSP2 :5 ' -ATCGTCACCATCCCGTTCTCCG-3 ' 和 RSP3 :5' -TACGACTCGGCCACCAAGGTGCT-3'。对第三轮PCR反应的片段进行测序，获得3'端 未知序列759bp。
[0039] 对三段序列进行拼接和分析，寻找阅读编码框，其中包含了一个1974bp的阅读 框，即为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因，其序列如SEQ ID No. 1所示，其编码的氨基酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0040] 在阅读框的左右两侧设计引物：Pr imer C : 5 ' -GGATCCATGACCGAGACTCCACGG和 Primer D :5'-GAGCTC TCAGGCCGTGTGGACCTCC 为扩增引物，以总 DNA 为模板，对 1974bp 的阅 读框进行PCR扩增。将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接。
[0041] 实施例4基因合成法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因
[0042] 通过基因合成方法（Nucleic Acids Research，2004, 32，e98)合成本发明的淀粉 酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，所用的引物如下：
[0043] SLGl ATGACCGAGACTCCACGGGACAACTCCGCCACCCGTGCACGCTGGCAGACGTGTCTCAAG
[0044] SLG2 CCTTGTCGTCCGGCCCGACGAGGAGGAGTTCGCGGGCGAGCTTGAGACACGTCTGCCAGC
[0045] SLG3 CGTCGGGCCGGACGACAAGGACCTCAAACTCAGCTATCTCCACACCCTGATCGACACGGG
[0046] SLG4 GAGGATCTTCTTGCGTGGGTGGTGGGTGGGGCCGAGGCGGCCCGTGTCGATCAGGGTGTG
[0047] SLG5 ACCCACGCAAGAAGATCCTCGTCATCGGCGCCGGCATCACCGGCCTCGTCGCCGGCCGCC
[0048] SLG6 GCCTCGATGATGGTGACGTCGTAGCCGGCGTCCTTGAGCAGGCGGCCGGCGACGAGGCCG
[0049] SLG7 GACGTCACCATCATCGAGGCCAATGAAAGCCGCGTCGGCGGACGCATCAAGACCTTCCGC
[0050] SLG8 ACTGGGCGGCGTCGTCGAAGGGCTGGTGGTGCTTGGTGGCGCGGAAGGTCTTGATGCGTC
[0051] SLG9 CTTCGACGACGCCGCCCAGTACGCGGAGGCCGGCGCCATGCGGCTGCCCGACTTCCACCC
[0052] SLGlO TCGGCCGAGTCCGAGCTTGTCGACGAGGGCGAGGACGAGCGGGTGGAAGTCGGGCAGCCG
[0053] SLGll ACAAGCTCGGACTCGGCCGACGCCAGTTCTACAACGTGGACGTGGGCCCCTCCACCGGCA
[0054] SLGI2 GAGGTGTACGTCACCGGGGGTACGGGGACCTCGGGGCCGCTGCCGGTGGAGGGGCCCACG
[0055] SLGI3 CCCCCGGTGACGTACACCTCCTTCACCGGCCAGACGTGGACCAACGGCGACGACAGTCCC
[0056] SLGI4 GGATCCAGGAGTTGCCGCGCTTGTCGGGTTCACGGAAGTCGGGACTGTCGTCGCCGTTGG
[0057] SLGI5 GCGCGGCAACTCCTGGATCCGCGCCAACCGCGTCCAGGTGCGGAGGGCCGACTACACCGC
[0058] SLGI6 GCCGGTGAGGTGGAAGCCCTCGTTGATCCGCTCAGGACTCGCGGTGTAGTCGGCCCTCCG
[0059] SLGI7 AGGGCTTCCACCTCACCGGCGACGAGGTCCGCGCCCCCGTCGTGAAGATGGTCGACGACG
[0060] SLGI8 TCGACGACGTCGGAGTAGTAGTCGCGCACGCTCTCCAGCGCGTCGTCGACCATCTTCACG
[0061] SLGI9 TACTACTCCGACGTCGTCGACGGCAAGCGTGTCAACAAGCCGTTCGACGAGTGGGTCGAG
[0062] SLG20 TGGAGTAGCCGTCGAAGTCGCGGATCACCCGGGCCCAGCCCTCGACCCACTCGTCGAACG
[0063] SLG21 CGACTTCGACGGCTACTCCATGGGCGGCTTCCTGCGCGACCACGCCGGGCTCAGCGACGA
[0064] SLG22 TGAGGACGTGTTCTCCAGGGTTCCGACGGCCTCGATCGCCTCGTCGCTGAGCCCGGCGTG
[0065] SLG23 CCCTGGAGAACACGTCCTCACGGCTGCATCTC