TCCTTCTTCCACAGCTTCCTGAGCCGCA
[0066] SLG24 CCCGGTATCTCCCAGTAGCGGACGGTGGGGTTGATGTCGCTGCGGCTCAGGAAGCTGTGG
[0067] SLG25 CGCTACTGGGAGATACCGGGCGGCAGTTGGCGTCTGCCGCACGCCCTCCACGAGGGCCTG
[0068] SLG26 CGAGGCGGATCATGCGGTGCCCGAGCCGCACCTCGTCGCGCAGGCCCTCGTGGAGGGCGT
[0069] SLG27 GCACCGCATGATCCGCCTCGAATACCACGACCCCAGCCGCGACGCCGACCCCGAGGGCAC
[0070] SLG28 GGTCTCCACGGTCACGCCCCATCCGTCGGGTCCGACGGCGGTGCCCTCGGGGTCGGCGTC
[0071] SLG29 GGGGCGTGACCGTGGAGACCGTCGCCGAGAACGACCCGCAGGCCCCGCCTCGCCGGTGGA
[0072] SLG30 AGGGCGGAGAACGGGATGGTGACGATCGCCAGGTCCGCGGTCCACCGGCGAGGCGGGGCC
[0073] SLG31 ACCATCCCGTTCTCCGCCCTGCGCTTCGTGGAGATCGTCCCCTCGATGTCGTACAAGAAG
[0074] SLG32 TGGTGGCCGAGTCGTAGTGGGTCTCGACGATGGCGCGGCGCTTCTTGTACGACATCGAGG
[0075] SLG33 CCACTACGACTCGGCCACCAAGGTGCTGCTGGAGTTCAGCCACCGGTGGTGGGAGTTCAC
[0076] SLG34 CGGTGCGATCCTCTCCAGCTCCTCGCGCCAGTCGTCCTCGTGGTGGCCGAGTCGTAGTGG
[0077] SLG35 AGCTGGAGAGGATCGCACCGGGCGTCTACGAGTACTACCGGCTGGGCCCGGAGGCGGCCG
[0078] SLG36 GCGTCCGCCTCGGCGAGCGTGGGCATACGGGCGGGCTCGCCGGCCGCCTCCGGGCCCAGC
[0079] SLG37 ACGCTCGCCGAGGCGGACGCCGGCCTGCTCGGTGCCGCCGTCAAGGACAGCGGCGTCACC
[0080] SLG38 CGCGCAGCGGCATGGTGCTGCCGATCTGCCGCATCTCCTCGGTGACGCCGCTGTCCTTGA
[0081] SLG39 CAGCACCATGCCGCTGCGCGGTCCCGCCCTCCGCCCCGCCACTCACAGCTTCGGCGGGGG
[0082] SLG40 CGGGTAATACATGAACCGGTTGGGGTTGTCGGTGGCGGAGCCCCCGCCGAAGCTGTGAGT
[0083] SLG41 ACCGGTTCATGTATTACCCGTCGCACCGGGTCGAGGGCAGCACCGGCGGAGTGGTGCTCG
[0084] SLG42 GAGTCCCAGCGCGCGGCGTCGTCGGACCAGGAGTACGAGGCGAGCACCACTCCGCCGGTG
[0085] SLG43 GACGCCGCGCGCTGGGACTCGATGCGGAGCGCGGAGCGCTACGTCTACGCCCTGCGCAAC
[0086] SLG44 TGAAGAACACCTCGATGCGTCGGCCGTGCAGGGCCTGGAGGTTGCGCAGGGCGTAGACGT
[0087] SLG45 ACGCATCGAGGTGTTCTTCACCGGGCGCGGCGCCACCAAGAGCTGGGCCCGCGACCCGTA
[0088] SLG46 CATCTGGTGCGCGGTGTAGATCGCGGCCTCGCCGAAGGCGTACGGGTCGCGGGCCCAGCT
[0089] SLG47 TCTACACCGCGCACCAGATGACCAGCTTCCACCTGGACGCCTCCCGGCCCGAAGGCCCCG
[0090] SLG48 CATCTGGTGCGCGGTGTAGATCGCGGCCTCGCCGAAGGCGTACGGGTCGCGGGCCCAGCT
[0091] SLG49 TCAGGCCGTGTGGACCTCCAGGGCGCCCTCGATCCAGGCGTGCTTGAGGGAGGT
[0092] 以 SLG1-SLG12 ;SLG13-SLG24 ;SLG25-SLG36 ;SLG37-SLG48 为引物，利用 PCR 进 行扩增31^1、31^2、31^3、31^4片段，在5(^1反应体系中，其中内侧引物51^2-51^11、 SLG14-SLG23、SLG26-SLG35、SLG38-SLG47 引物的添加量为 2ng，外侧引物 SLG1、SLG12、 SLG13、SLG24、SLG25、SLG36、SLG37、SLG48 个引物添加量为 30ng，扩增条件为：94°C预热 Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，lmin。共25个循环。扩增片断通过琼脂糖凝胶回收，然后 作为模版进行拼接，扩增小片段SLG1、SLG2、SLG3、SLG4各1 μ g，以SLGl和SLG49为引物进 行 PCR 扩增，扩增条件为：94°C预热 Imin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，3min。共 25 个循环。
[0093] 实施例5 L-谷氨酸氧化酶基因的大肠杆菌表达
[0094] 将实施例4合成的L-谷氨酸氧化酶基因用BamH I和Sac I酶切后，与载体 pET-28a(NEB公司）连接得到重组质粒pET-pGOX，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3) (Novagen 公司），将转化子涂布于LB固体培养基中37°C培养16h。挑取单菌落接种于50mL含氨苄 (终浓度l〇〇mg/L)的LB液体培养基中，37°C振荡培养5h，0D_约为0. 6时，加入终浓度为 0. 5mM的IPTG，25°C诱导12h。将所得发酵培养液9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取 湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于PH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液中（Ig湿细胞 /IOml缓冲液）得悬浮液，用超声波处理悬浮液（功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99 轮），9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分 之一当量的Factor Xa蛋白酶（New England Biolabs公司）在4°C下处理6h，获得具有活 性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
[0095] 经SDS-PAGE电泳检测，前体蛋白大小约70kDa，用Factor Xa蛋白酶处理后得三个 亚基α、β、γ，分子量分别约为42kDa，16kDa和10kDa，与预测值相符（参看图1)。
[0096] 实施例6 L-谷氨酸氧化酶基因的酶活测定
[0097] L-谷氨酸氧化酶活力测定：反应体系为1ml，包含pH6. 5、IOOmM磷酸钠缓冲液，ImM 的4-氨基安替安替吡啉，IOmM的L-谷氨酸，IOmM的苯酚，2000U/L的辣根过氧化物酶）在 30 °C下反应，使用分光光度计测定505nm处吸光值。酶活定义为，每分钟反应生成Ipmol过 氧化氢所需的酶量为一个酶活单位U。蛋白含量采用Brandford法测定。
[0098] 采用上述方法测定实施例5所得经Factor Xa蛋白酶处理后L-谷氨酸氧化酶活 力，结果为：L-谷氨酸氧化酶的反应活力为29. 8U/mg。
[0099] 实施例7、L-谷氨酸氧化酶的底物谱
[0100] 反应体系为Iml :取实施例5制得的经Factor Xa蛋白酶处理后的L-谷氨酸氧化 酶10 μ L，加入包含pH6. 5、IOOmM磷酸钠缓冲液，ImM的4-氨基安替安替吡啉，IOmM的苯酚， 2000U/L的辣根过氧化物酶的反应液中，分别加入各种底物（IOmM)，30°C下反应2min，使用 分光光度计测定505nm处吸光值。结果如表1所示。
[0101] 表1 L-谷氨酸氧化酶的底物谱
【主权项】
1. 一种源于淀粉酶产色链霉菌（Streptomycesdiastatochromogenes)的L-谷氨酸氧 化酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如 SEQIDNo. 2 所示。
3. 权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因的制备方法，其特征在于，是将淀粉酶 产色链霉菌中的L-谷氨酸氧化酶基因利用基因合成法制备而成。
4. 权利要求1或2所述的L-谷氨酸氧化酶基因在L-谷氨酸含量检测中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用，具体涉及一种从土壤中筛选获得的淀粉酶产色链霉菌克隆、编码L-谷氨酸氧化酶基因，将该基因人工合成并重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有L-谷氨酸氧化酶活性的重组菌。所述的L-谷氨酸氧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1，全长1974bp，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2。该基因所编码L-谷氨酸氧化酶能特异性的催化L-谷氨酸，可作为L-谷氨酸含量检测用酶，应用于食品工业和临床生化检测领域。
【IPC分类】C12Q1-26, C12N15-53, C12N9-06, C12N15-10
【公开号】CN104726471
【申请号】CN201410255789
【发明人】王丽娟, 姚泉洪, 王荣谈, 彭日荷, 李大伟, 严培兰, 丁卫星, 朱波, 高建杰, 王波, 袁忠谊
【申请人】上海瑞丰农业科技有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年6月10日