r>[0051] 2μ1 第一链 cDNA
[0052] 70 μ 1 蒸馏水
[0053] 10 μ I 10Χ Advantage? 2PCR 缓冲液
[0054] 2μ1 50 X dNTP混合物
[0055] 2 μ 1 5' PCR 引物（5' -TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3' SEQ ID No. 5)
[0056] 2 μ 1 3'PCR 引物（5,-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3' SEQ ID No. 6)
[0057] 10 μ 1 10 X溶解液（试剂盒自带成分）
[0058] 2 μ I 50 X Advantage 2 聚合酶混合物
[0059] 100 μ 1 总体积；
[0060] (3)扩增程序：95°C 30sec，36Cycles ;95°C IOsec ;68°C 6minb，68°C 5min ;扩增程 序每过一个循环时延伸时间增加5sec ;
[0061] (4)琼脂糖电泳分析（如图1);
[0062] (5)柱纯化后，将ds cDNA保存于-20°C待用。
[0063] 1.4 操作纯化 ds cDNA
[0064] (1)准备：LD-PCR 扩增 ds cDNA
[0065] 醋酸钠（3M)
[0066] 冰乙醇（95 - 100% );
[0067] (2)每 93ul 的 cDNA 样品使用一个 CHROMA SPIN TE-400 纯化柱
[0068] 颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀，
[0069] 移除顶端帽子，
[0070] 辦断柱底部的break away (分离板），
[0071] 将柱放置在2ml的收集管；
[0072] (3)700rpm，5min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix (基质）半干；
[0073] (4)将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul 的样本；
[0074] (5) 700rpm，5min 离心；
[0075] (6)将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀ds cDNA :
[0076] 加入1/10体积的3M醋酸钠；
[0077] 加入2. 5倍体积的冰乙醇（95 - 100% );
[0078] - 20 °C，Ihr 放置沉淀；
[0079] 14, OOOrpm，室温离心 20min ;
[0080] 弃上清；
[0081] 14,000rpm瞬时离心，去除残留的上清液；
[0082] 空气干燥IOmin ;
[0083] (7) 20 μ 1 去离子水重悬 ds cDNA。
[0084] 1. 5制备酵母感受态细胞
[0085] (1)试剂
[0086] IM LiCl(用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀 释）50% PEG3350(Sigma P3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子 分装）
[0087] 2mg/ml salmon sperm DNA/TE (IOmM Tris-Cl，ρΗ8· 0,1. OmM EDTA)-20°C保存；
[0088] (2)感受态毕氏酵母的制备
[0089] 接种酵母菌种到50ml YH)培养基中，30°C摇菌过夜（约24~28h)培养到OD值 为 0· 8 ~L 0 (约 108Cells/ml);
[0090] 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min ;
[0091] 重悬细胞于Iml IOOmM LiCl溶液中，将悬液转入I. 5ml离心管；
[0092] 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul IOOmM LiCl溶液中；
[0093] 按50ul/管分装，立即进行转化；
[0094] 注：不要将感受态酵母菌冰浴。
[0095] 1. 6酵母的转化
[0096] (1)煮沸Iml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA ;
[0097] (2)将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
[0098] (3)对于每一个转化，按以下顺序加入：
[0099] 50% PEG3350 240ul IM LiCl 36ul 2mg/ml 单链 Salmon SperniDNA 25ul 5 ~10ug/50ul H2O 醉丨li:质粒 DN A 50ul
[0100] (4)剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约lmin);
[0101] (5)30°〇水浴孵育3〇11^11;
[0102] (6) 42 °C 水浴热休克 20 ~25min ;
[0103] (7) 6000~8000rpm离心收集酵母菌体；
[0104] (8)重悬酵母于Iml YH)培养基，30°C摇床孵育；
[0105] (9) 1~4h后，取25~IOOul菌液铺选择性培养基平板，于30°C培养2~3天鉴 定；
[0106] L 7 建立 Mate&Plate 文库
[0107] (1)制备Y187酵母感受态细胞；
[0108] (2)按照转化操作1. 6转化酵母细胞
[0109] 20 μ I ds cDNA-2-5yg
[0110] 6 μ I pGADT7-Rec (0· 5 μ g/ μ I))
[0111] (3)将转化后的酵母细胞重悬于15ml 0. 9 % (w/v) NaCl中；
[0112] (4)将100 μ 1的1/10、1/100稀释液分别铺板于SD/ - Leu IOOmm固体培养基上， 30°C，孵育3d - 4d ;确定文库的库容，
[0113] 独立克隆数=No. of cfu/ml on SD/- Leu X 重悬液体积（15ml)
[0114] 这个值标示转化效率；
[0115] (5)将剩下的悬浮液铺板于150mm SD/- Leu选择培养基上
[0116] 每板150 μ 1悬浮液，约使用100板
[0117] 30°C 孵育 3d-4d;
[0118] (6)收获转化子：
[0119] (7)4°C，3 - 4hr冷却培养板，加入5ml的冻存液，使用无菌的玻璃珠将板中的菌落 分离下来。
[0120] (8)将所有的液体收集于无菌的单管中，用血球计数板来计算细胞密度。若细胞密 度小于<2xl0 7/ml，离心来减少悬浮液的体积。
[0121] 1. 8酵母cDNA文库进行双杂交
[0122] (1)参考 Clontch 的 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybird System 的说明，以步 骤I. 4中的DNA为模板，利用下述引物SEQ ID No. 7-8通过高保真DNA聚合酶的PCR反应 给GmCBL3加上接头，扩增出带接头的目的基因全长片段；
[0123] Pl (上游引物）：5' -CATGGAGGCCGAATTCATGGGAACTCAAGGATATGCAGCA-3'（SEQ ID No. 7)
[0124] P2(下游引物）：5'-GCAGGTCGACGGATCCTTATGGGAATGCAGTAGGAGTATGA-3'（SEQ ID No. 8)；
[0125] (2)取200 μ I PCR产物，利用天根公司的凝胶回收试剂盒，回收PCR产物；
[0126] (3)将回收的PCR产物和pGBKT7载体，分别用Takara公司的限制性内切酶BamHI 和EcoRI进行双酶切；
[0127] (4)将双酶切的PCR产物和pGBKT7载体按照5:1的体积比加入到新的离心管中， 然后用Takara公司的DNA连接试剂盒进行连接，构建pGBKT7-GmCBL3诱饵蛋白重组载体；
[0128] (5)取（4)中的反应液1 μ 1，进行大肠杆菌转化，并验证阳性；
[0129] (6)培养阳性克隆，提取并纯化其质粒；
[0130] (7)将（6)中的质粒加入步骤1. 5所述的酵母感受态中，通过步骤1. 6的方法进行 酵母转化，并获得阳性酵母菌株；
[0131] (8)将获得阳性酵母菌株与步骤1.7中所获得的酵母文库进行共培养，参考 Clontch 的 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybird System 的说明对上述酵母 cDNA 文库进行 双杂交，并获得GmCBL3的互作蛋白阳性单菌落。
[0132] 1.9DNA 测序
[0133] 挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp (氨苄西林，50mg/L)的液体LB培养基 摇菌过夜，然后送深圳华大基因有限公司测序，得到测序结果：基因 cDNA序列如序列表SEQ ID No. 1 所示，全长 627bp。
[0134] 经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与大豆蛋白激