2000rpm离心5min;取上清液到新的离心管中；加入1. 5倍体积的缓冲液 LP3,立即充分振荡混匀15sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复上一步操作；将 吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于温室放置数 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸 附膜的中间部位悬空滴加150μ1洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶 液收集到离心管中。DNA溶解后，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和紫外分光光度 法检测DNA样品的浓度。
[0037] 按照Michelmore等（1991)给出的方法构建用于分离群体分组分析的抗、感池。各 取1μ1的10个抗病家系的DNA混合于一个新的离心管中，构建成抗池。感池构建参照抗 池构建方法。
[0038] 3、利用SSR标记定位齐茶豆1号的抗病基因
[0039] 大豆SSR标记序列来自http://soybase.org。随机选取SSR标记在亲本和抗感池 间进行PCR扩增。将在亲本和抗病、感病池之间具有多态性的SSR标记进行群体验证。PCR 反应体系为1〇μ1，大豆基因组DNA模板浓度（50ng/yl)0. 5yl，2XPCRMasterMix4μ1， 引物F和R(10μΜ)各0. 2μ1，用ddH20补足至10μ1。PCR反应扩增程序：94°C预变性3分 钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环；72°C10分钟，4°C保存。 扩增产物在8%聚丙稀酰胺凝胶中进行电泳和分析。用mapmaker3. 0软件分析SSR标记与 抗病基因的连锁关系。使用MapDraw软件构建遗传连锁图谱，确定抗性基因RpsQ的定位区 间。
[0040] 随机选取的大豆上的SSR标记，有4对来自第3号染色体上的标记在亲本和抗感 池间具有多态性（表1)。进一步用210个F2:3家系对4个标记验证，使用mapmaker3. 0软 件分析表明，这4对多态性SSR标记与RpsQ均连锁（表1)。使用MapDraw软件绘制遗传连 锁图谱，RpsQ被定位在标记BARCS0YSSR_03_0165和BARCS0YSSR_03_0176之间，遗传距离 分别为〇. 6cM和0. 9cM(结果见图2)。
[0041] 表1与RpsQ⑶1连锁的多态性SSR标记引物序列信息
[0042]
[0043] 4、候选基因的预测和共分离标记的发现
[0044] 在http://soybase.org数据库内进行分析比对可知，在标记BARCS0YSSR_03_016 5和BARCS0YSSR_03_0176之间有20个预测的基因模型（表2)，13个具有功能注释，其中 有一个基因模型Glyma. 03g027200编码抗病相关的富含亮氨酸重复的类蛋白激酶结构。 通过设计重叠引物对齐茶豆1号和吉科豆2号中的Glyma. 03g027200位点及其上、下游 lOOObp序列进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序。比对齐茶豆1号和吉科豆2号中 Glyma. 03g027200的位点发现存在多个SNP位点、插入和缺失。根据其齐茶豆1号的编码区 域内一段144bp的插入序列设计上、下游引物开发InDel标记Insertl44,用于特异性PCR 扩增分子标记Insertl44的引物对为：
[0045] 上游引物F:5' -TGGAATGAGTCTTAGGGGAAGC-3'（SEQIDNo. 2)
[0046] 下游引物R:5' -ACCGGTGATTGAATTGTTGGAG-3'（SEQIDNo. 3)
[0047] 用InDel标记Insertl44进行群体验证，通过mapmaker3. 0软件计算遗传连锁 距离，使用MapDraw构建遗传连锁图谱（图2)。Insertl44与RpsQ的遗传距离为OcM，标记 Insertl44为RpsQ共分离分子标记，Glyma. 03g027200可能为控制齐茶豆1号抗性的候选 基因模型。
[0048] 进行群体验证包括以下步骤：
[0049] 1)提取待测大?的基因组DNA;
[0050] 2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用上述引物，进行PCR扩增反应；
[0051] 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出581bp(SEQIDNo. 1)的产物，则判定待测 大豆为抗疫病品种。
[0052] 其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μ1计为：大豆基因组DNA模板浓度 (50ng/yl)0.5yl，2XPCRMasterMix4μ1，引物F和R(10yM)各 0·2μ1，用ddH20 补足 至 10μ1〇
[0053] PCR扩增反应使用的反应条件为：94°C3分钟；94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒， 共35个循环；72°C10分钟。
[0054] 本发明中涉及的大豆抗疫病基因RpsQ候选基因RpsQ-Ι及其吉科豆2号等位候选 基因rpsjk-Ι核苷酸序列分别如SEQIDNo. 4和5所示。
[0055] 表 2 大豆 3 号染色体上BARCS0YSSY_03_0165 和BARCS0YSSR_03_0176 之间的基因
[0056]
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种大豆抗疫病基因RpsQ的分子标记Insertl44,其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记与大豆抗疫病基因 RpsQ共定位于大豆3号染色体，且与RpsQ的遗传距离为OcM。3. 权利要求1或2所述分子标记的PCR引物，其特征在于，上游引物序列如SEQID No. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。4. 一种鉴定大豆抗疫病基因RpsQ的方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA 作为模板，用权利要求3所述的PCR引物进行PCR扩增，能扩增出SEQIDNo.1所示片段的 植株样品为含有大S抗疫病基因RpsQ的植株。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测大?的基因组DNA; 2) 以待测大豆的基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增反应； 其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μ1计为：0. 5μ1浓度为50ng/μ1的大豆基 因组DNA模板，4μ1的2XPCRMasterMix，浓度为10μΜ的上、下游引物各0· 2μ1，用ddH20 补足至10μ1 ; PCR扩增反应使用的反应条件为：94°C3分钟；94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒，共35 个循环；72°C10分钟； 3)结果鉴定：能扩增出SEQIDNo.1所示片段的植株样品为含有大豆抗疫病基因RpsQ 的植株。6. 用于PCR检测抗疫病大豆的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求3所述 的PCR引物。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚 合酶、Mg'PCR反应缓冲液和标准阳性模板中的一种或多种。8. 分子标记Insertl44在鉴定抗疫病大豆品种中的应用。9. 分子标记Insert144在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为大豆抗疫病基 因RpsQ。10. 权利要求4或5所述的方法在大豆育种改良中的应用。
【专利摘要】本发明公开了与大豆抗疫病基因RpsQ紧密连锁的分子标记Insert144，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，该分子标记与大豆抗疫病基因RpsQ的遗传距离为0cM。检测分析表明该分子标记能准确跟踪所述大豆抗疫病基因RpsQ，预测大豆的抗疫病特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定大豆抗疫病基因RpsQ的方法，利用本发明所提供的方法可以实现对大豆抗疫病植株的快速鉴定检测。
【IPC分类】C12N15/29, C12Q1/68, C12N15/11, A01H5/00
【公开号】CN105349550
【申请号】CN201510737729
【发明人】朱振东
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月3日