利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法。白藜芦醇的生产主要依赖于从植物中直接提取，其中能够广泛用于生产的主要植物是中药材野生虎杖的根茎，严重地限制了该产业的发展。本发明将链格孢属CCTCC?No:M2011348菌株接种于液体培养基中培养后，过滤收集菌丝体，洗净研磨破碎，加入粗酶提取液，离心后收集上清液，加入固体硫酸铵，静置过夜后离心收集沉淀得粗酶液；取缓冲液，加入粗酶液，反应得到白藜芦醇。本发明利用链格孢属微生物的胞内酶为催化剂，以葡萄糖为底物，在温和的反应体系转化合成白藜芦醇，安全环保，生产效率高，可控性强，生产成本低，适合大规模工业生产。
【专利说明】利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于芪类化合物生产【技术领域】，具体涉及一种利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002]白藜芦醇是具有多种生理活性的植物芪类化合物，具有预防和减缓癌症、心血管疾病及缺血性损伤等多种疾病的功能，并有增强抗逆性和延长从酵母到脊椎动物多种生物生命的功效。同时，白藜芦醇是是生产酰化白藜芦醇、氧化白藜芦醇等其它功能活性物质的重要的前体，在功能食品加工和药物生产方面有着广泛应用，市场需求量大。
[0003]目前，白藜芦醇的生产主要依赖于从植物中直接提取。其中能够广泛用于生产的主要植物是中药材野生虎杖的根茎。随着大量生产的需要，虎杖原料已十分紧缺，严重地限制了该产业的发展。虽然白藜芦醇也可以通过化学合成方法获得，但其反应过程中涉及有毒有害物质的大量使用和残留，存在安全问题。生物合成法生产白藜芦醇主要局限于植物细胞和微生物培养法的应用，但是存在生产周期长，受生物细胞生产状态影响大，产量不稳定的问题。
[0004]酶法合成白藜醇属于生物合成方法，既可以避免有毒有害物质的残留问题，又可以摆脱生物细胞生长状态的影响，而且反应体系简单、反应速度快，生产过程可控制性强，生产周期短。同时，固定化酶还具有可重复利用的优点。具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种方法操作简单、转化速率快、环保、生产成本低、可工业化大规模生产白藜芦醇的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法。
[0006]本发明所采用的技术方案是:
利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:酶液的制备:
(1)将链格孢属CCTCCNo: M2011348菌株接种于液体培养基中，在28°C、120 rpm的条件下培养4天；
(2)取培养物用过滤法收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗干净；
(3)将所得菌丝体在液氮中研磨破碎，按每4.0 g菌丝体加入8 ml粗酶提取液的比例加入粗酶提取液，混合均匀后，在温度4°C、转速1000rpm的条件下离心lOmin，收集上清液；
(4)在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和浓度为75%，4°C静置过夜后在1000rpm转速下离心10 min，收集沉淀并用(3)中的粗酶提取液溶解后放入透析袋中，在4°C透析至无S042 —检出为至，透析袋中所得液体即为粗酶液；步骤二:生成白藜芦醇:
取100 mL缓冲液，加入步骤一得到的粗酶液5-50 mL,在温度37°C、转速120 rpm的条件下反应0.5~4 h,得到白藜芦醇。
[0007]步骤一(I)中，所述液体培养基为土豆汁葡萄糖液体培养基，配方为:20%的马铃薯浸汁1000mL,葡萄糖20 g，pH自然。
[0008]步骤一(3)中，所述粗酶提取液为磷酸盐缓冲溶液，摩尔浓度为50mmol/L，pH为7，其中含有0.lg/L硫酸镁、0.2g/L硫酸钙、0.6mmol/L DTT。
[0009]步骤一中，得到的粗酶液制备成固定化酶，具体步骤为:
在200mL烧杯中加入2g海藻酸钠和50ml蒸馏水，加热搅拌，使其完全混合，待冷却后，加入IOmL步骤一得到的粗酶液混合，用注射器滴入1%氯化钙溶液中，放置在4°C环境中固定化I h后，用蒸馏水清洗数遍放置于4°C蒸馏水中保存备用。
[0010]步骤二中，所述缓冲液为含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和0.5-10.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L的磷酸缓冲溶液、0.lmol/L柠檬酸缓冲溶液或50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，pH为3-7.5。
[0011]步骤二中，反应体系中分别加入0.2 mg/100 mL的丙二酰辅酶A、ATP、辅酶A、对-香豆酸或苯丙氨酸。
[0012]本发明具有以下优点:
本方法操作简单、生产时间短，利用链格孢属微生物的胞内酶为催化剂，以葡萄糖为底物，在温和的反应体系转化合成白藜芦醇，安全环保；利用酶法生物转化合成白藜芦醇，可在数小时之内完成反应，生产效率`高；利用酶法生物转化合成白藜芦醇，可以摆脱生物细胞生长状况对产物得率的影响，可控性强；利用酶法转化葡萄糖合成白藜芦醇，生产成本低；利用固定化酶法生物转化合成白藜芦醇，可以实现酶的重复利用，大大降低生产成本，同时能够有效提高I3DG的生产效率，为工业化生产提供新的思路和途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为反应体系在不同pH值条件下的白藜芦醇产量。
[0014]图2为反应体系在不同反应时间时的白藜芦醇产量。
[0015]图3为反应体系在不同葡萄糖浓度时的白藜芦醇产量。
[0016]图4为反应体系在不同酶用量时的白藜芦醇产量。
[0017]图5为在反应体系中添加丙二酰辅酶A、辅酶A、ATP、对-香豆酸和苯丙氨酸时的
白藜芦醇产量。
[0018]图6为固定化酶在Tris-HCl反应体系中的白藜芦醇产量。
[0019]图7为固定化酶在添加有辅酶A、ATP和对-香豆酸的反应体系中的白藜芦醇产量。
【具体实施方式】
[0020]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0021]本发明所涉及的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，由以下步骤实现:步骤一:酶液的制备:
(I)将链格孢属CCTCC No: M2011348菌株接种于液体培养基中，在28°C、120 rpm的条件下培养4天。
[0022]其中，液体培养基为土豆汁葡萄糖液体培养基，配方为:20%的马铃薯浸汁1000mL,葡萄糖20 g, pH自然。
[0023]所述的链格孢属(Alternaria sp.)菌株于2011年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏编号为CCTCC No: M2011348。
[0024](2)取培养物用过滤法收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗干净。
[0025](3)将所得菌丝体在液氮中研磨破碎，按每4.0 g菌丝体加入8 ml粗酶提取液的比例加入粗酶提取液，混合均匀后，在温度4°C、转速1000rpm的条件下离心lOmin，收集上清液。
[0026]其中，粗酶提取液为磷酸盐缓冲溶液，摩尔浓度为50mmol/L，pH为7，其中含有0.lg/L 硫酸镁、0.2g/L 硫酸钙、0.6mmol/L DTT。
[0027](4)在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和浓度为75%，4°C静置过夜后在1000rpm转速下离心10 min，收集沉淀并用(3)中的粗酶提取液溶解后放入透析袋中，在4°C透析至无S042 —检出为至，透析袋中所得液体即为粗酶液。
[0028]得到的粗酶液可直接使用，也可制备成固定化酶，具体步骤为:
在200mL烧杯中加入2g海藻酸钠和50ml蒸馏水，加热搅拌，使其完全混合，待冷却后，加入IOmL步骤一得到的粗酶液混合，用注射器滴入1%氯化钙溶液中，放置在4°C环境中固定化I h后，用蒸馏水清洗数遍放置于4°C蒸馏水中保存备用。
[0029]步骤二:生成白藜芦醇:
取100 mL缓冲液，加入步骤一得到的粗酶液5-50 mL,在温度37°C、转速120 rpm的条件下反应0.5~4 h,得到白藜芦醇。
[0030]其中，缓冲液为含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和0.5-10.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L的磷酸缓冲溶液、0.lmol/L柠檬酸缓冲溶液或50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，pH 为 3-7.5。
[0031]反应体系中还可分别加入0.2 mg/100 mL的丙二酰辅酶A、ATP、辅酶A、对-香豆酸或苯丙氨酸。
[0032]实施例1:
步骤一:酶液的制备:
将链格孢属CCTCC No: M2011348菌株接种于土豆汁葡萄糖液体培养基(20%的马铃薯浸汁1000mL,葡萄糖20 g，pH自然)中，在28°C、120 rpm的条件下培养4天。取培养物用过滤法收集菌丝体,并用蒸馏水冲洗干净。将所得菌丝体在液氮中研磨破碎,按每4.0 g菌体加入8 ml粗酶提取液的比例加入酶提取液(50mmol/L pH = 7的磷酸盐缓冲溶液、0.lg/L硫酸镁、0.2g/L硫酸钙、0.6mmol/L DTT)。混合均匀后,在4°C、1000rpm的条件下离心IOmin,收集上清液。在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和浓度为75%，4°C静置过夜后在1000rpm离心10 min，收集沉淀并用上述酶提取液溶解后放入透析袋中，在4°C透析至无SO42 一检出为至。透析袋中所得液体即为粗酶液。[0033]步骤二:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和I mmol/L葡萄糖的50 mmol/L的磷酸缓冲溶液或0.lmol/L柠檬酸缓冲溶液体系各100 mL (缓冲液的pH分别为3、4、5、6、7、7.5)，然后加入5 mL粗酶液，在37°C、120 rpm的条件下反应4 h。然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中的白藜芦醇产量。
[0034]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:
质谱条件:使用ES1-离子源，选用多级反应负离子模式进行监测并采集数据(MRM)。毛细管温度320°C，碰撞气体为氩，气体体积流量为35 L/h。正极电压4 kV，电流100 μ A，毛细管电压为40 V。负极电压4.5 kV,电流100 μ A,毛细管电压为-20 V。运行时间为60分钟，液相条件同上，进样流速为0.5 mL/min，进样量为10 μ L。对照标品对产物进行质谱分析。高效液相色谱条件:取待测样液，用100ml乙酸乙酯浸提24h，收集乙酸乙酯相与旋转蒸发仪中，40°C蒸干，溶解至2ml甲醇中，待测。使用C18柱，采用二元梯度洗脱，流动相A为乙腈,B为水。起始为5% A，95% B，保持5min ;到28min时A为60%，B为40% ；33min时A为85%，B为15%，保持2min ;到40 min时A为5%，B为95% ;平衡柱子，进下一个样。流速为1.0mL/min,柱温为30°C，检测波长为306nm ;进样体积为20 μ L。将浓缩样品经0.45 μ m微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。根据白藜芦醇标准品色谱峰的保留时间和峰面积值计算样品中反式白藜芦醇的含量。
[0035]实验结果:
磷酸盐缓冲液体系中的白藜芦醇pH 6-7.5时，反应体系中的白藜芦醇产量较高，同一pH时，磷酸盐缓冲体系中的白藜芦醇显著高于柠檬酸缓冲液体系。
[0036]实施例2:
步骤一:酶液的制备:
同实施例1。
[0037]步骤二:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸韩和I mmol/L葡萄糖的50 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液100 mL，加入5 mL粗酶液，在37°C、120 rpm的条件下反应0.5~4 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析不同时间时的反应液中白藜芦醇产量。
[0038]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。
[0039]实验结果:
反应0.5 1!和4.0 h时的白藜芦醇含量均远远高于其它反应时间，说明仅需0.5 h即可得到较高的白藜芦醇产量。极大地提高了反应效率。
[0040]实施例3:
步骤一:酶液的制备:
同实施例1。
[0041]步骤二:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和不同浓度葡萄糖(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、
5.0,10.0 mmol/L)的 50 mmol/L pH 7.0 磷酸缓冲溶液 100 mL，加入 5 mL 粗酶液，在 37°C、120 rpm的条件下反应0.5 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中白藜芦醇产量。[0042]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。
[0043]实验结果:
葡萄糖浓度为2.0 mmol/L时，白藜芦醇产量最高。
[0044]实施例5:
步骤一:酶液的制备:
同实施例1。
[0045]步骤二:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和2.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液100 mL，分别加入5、10、20、30、40、50 mL粗酶液，在37°C、120 rpm的条件下反应0.5 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中白藜芦醇产量。
[0046]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。
[0047]实验结果:
粗酶液加量为40 mL以上时，白藜芦醇产量最高。
[0048]实施例6:
步骤一:酶液的制备:` 同实施例1。
[0049]步骤二:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和2.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液100 mL，加入5 mL粗酶液，再分别加入0.2 mg/100 mL的丙二酰辅酶A、ATP、辅酶A、对-香豆酸、苯丙氨酸，在37°C、120 rpm的条件下反应0.5 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中白藜芦醇产量。
[0050]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。
[0051]实验结果:
在反应体系中加入丙二酰辅酶A、ATP、辅酶A、对-香豆酸、苯丙氨酸均能显著提高白藜芦醇得率，其中以添加ATP的效果最为明显。
[0052]实施例7:
步骤一:酶液的制备:
同实施例1。
[0053]步骤二:固定化酶的制备:
在200 mL烧杯中加入2 g海藻酸钠和50ml蒸馏水，加热搅拌，使其完全混合，待冷却后，加入10 mL粗酶液混合，用注射器滴入1%氯化钙溶液中，放置在4°C环境中固定化I h后，用蒸馏水清洗数遍放置于4°C蒸馏水中保存备用。
[0054]步骤三:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和2.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L pH 7.0Tris-HCl缓冲溶液100 mL，加入5 mL粗酶液的固定化酶，在37°C、120 rpm的条件下反应
0.5 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中白藜芦醇产量。反应结束后，过滤收集固定化酶，用蒸馏水冲洗干净后再进行下一次同样的反应。对照为未固定化粗酶液的第一次反应结果。
[0055]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。[0056]实验结果:
虽然酶在固定化后的反应效率稍低于未固定化的酶(对照，ck)，但其在反复使用4次以内，仍然具有较高的反应活性，说明其酶活稳定性较高。
[0057]实施例8:
步骤一:酶液的制备:
同实施例1。
[0058]步骤二:固定化酶的制备:
同实施例7。
[0059]步骤三:生成白藜芦醇:
取含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和2.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L pH 7.0Tris-HCl缓冲溶液100 mL，加入0.2 mg/100 mL的ATP、辅酶A、对-香豆酸和5 mL粗酶液的固定化酶，在37°C、120 rpm的条件下反应0.5 h，然后用质谱和高效液相色谱法定性定量分析反应液中白藜芦醇产量。反应结束后，过滤收集固定化酶，用蒸馏水冲洗干净后再进行下一次同样的反应。对照为固定化酶在未加ATP、辅酶A、对-香豆酸的体系中的第一次反应结果。
[0060]采用质谱和高效液相色谱法定性定量分析白藜芦醇的产量:同实施例1。
[0061]实验结果:`
在反应体系中加入0.2 mg/100 mL ATP、辅酶A、对-香豆酸能够有效提高固定化酶的反应效率和稳定性，可使固定化酶在连续使用5次后仍然具有很高的催化活性。
[0062]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:酶液的制备: (1)将链格孢属CCTCCNo: M2011348菌株接种于液体培养基中，在28°C、120 rpm的条件下培养4天； (2)取培养物用过滤法收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗干净； (3)将所得菌丝体在液氮中研磨破碎，按每4.0 g菌丝体加入8 ml粗酶提取液的比例加入粗酶提取液，混合均匀后，在温度4°C、转速1000rpm的条件下离心lOmin，收集上清液； (4)在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和浓度为75%，4°C静置过夜后在1000rpm转速下离心10 min，收集沉淀并用(3)中的粗酶提取液溶解后放入透析袋中，在4°C透析至无S042 —检出为至，透析袋中所得液体即为粗酶液； 步骤二:生成白藜芦醇: 取100 mL缓冲液，加入步骤一得到的粗酶液5-50 mL,在温度37°C、转速120 rpm的条件下反应0.5~4 h,得到白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 步骤一(I)中，所述液体培 养基为土豆汁葡萄糖液体培养基，配方为:20%的马铃薯浸汁1000mL,葡萄糖20 g, pH自然。
3.根据权利要求2所述的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 步骤一(3)中，所述粗酶提取液为磷酸盐缓冲溶液，摩尔浓度为50mmol/L，pH为7，其中含有0.lg/L硫酸镁、0.2g/L硫酸钙、0.6mmol/L DTT。
4.根据权利要求3所述的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 步骤一中，得到的粗酶液制备成固定化酶，具体步骤为: 在200mL烧杯中加入2g海藻酸钠和50ml蒸馏水，加热搅拌，使其完全混合，待冷却后，加入IOmL步骤一得到的粗酶液混合，用注射器滴入1%氯化钙溶液中，放置在4°C环境中固定化I h后，用蒸馏水清洗数遍放置于4°C蒸馏水中保存备用。
5.根据权利要求4所述的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 步骤二中，所述缓冲液为含有0.1 g/L硫酸镁、0.2 g/L硫酸钙和0.5-10.0 mmol/L葡萄糖的50 mmol/L的磷酸缓冲溶液、0.lmol/L柠檬酸缓冲溶液或50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，pH为3-7.5。
6.根据权利要求5所述的利用链格孢属微生物胞内酶转化葡萄糖生成白藜芦醇的方法，其特征在于: 步骤二中，反应体系中分别加入0.2 mg/100 mL的丙二酰辅酶A、ATP、辅酶A、对-香豆酸或苯丙氨酸。
【文档编号】C12P7/22GK103484505SQ201310359908
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】师俊玲, 车金鑫 申请人:师俊玲