分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物，所述引物包括引物对1和引物对2，所述引物对1包括引物F1和R1，所述引物对2包括引物F2和R2，其中引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1示，引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。该引物能在分子水平上鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅。本发明还公开了一种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，该方法快捷方便、准确可靠。
【专利说明】
分子鉴别四指马鲅和多鱗四指马鲅的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子鉴别形似近缘物种技术领域，具体涉及一种分子鉴别四指马鲅和 多鳞四指马鲅的引物及方法。
【背景技术】
[0002] 四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum)和多鱗四指马鲅（E .rhadinum)是觸形 目（1耶；11丨；1^01'11168)马鲅科(？〇171161]10丨(16&)四指马鲅属化16111：1161'01161]1&)的两个习见种，俗 名午鱼、马友，其脂肪含量高，肉质细嫩，蛋白质丰富，具有较高的食用价值和经济价值，是 名贵的高端海水鱼类。在我国，马鲅的人工繁育和养殖尚处起步阶段，成品鱼主要依靠捕 捞，随着近年来人们对高端名贵海产品的需求上升，马鲅的自然渔业资源正遭受过度捕捞 而日趋衰竭，渔获量难以满足市场的需求。
[0003] 马鲅科的很多种类外部形态相似、鉴别特征不显著、容易混淆，形态分类学上主要 是依据胸鳍下方的游离丝状鳍条数进行区别，如四指马鲅、六指马鲅、多指马鲅等。同属于 四指马鲅属的四指马鲅和多鳞四指马鲅，胸鳍下方均具4根游离丝状鳍条，除胸鳍颜色、侧 线鳞数目和犁骨齿板不同外，其他形态学特征几乎相同，常被误认为同一种鱼类。两种鱼类 不仅形态上非常相似，生境也相似，经常混栖于相同水域，体型很小的仔稚鱼就更难辨认， 给进一步研究它们的早期生活史及其补充动态造成了很大的困难，不利于资源的保护和管 理。因此，亟需一种快捷方便、准确可靠的鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物，该引 物能在分子水平上鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅。
[0005] 本发明的目的还在于提供一种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，该方法 快捷方便、准确可靠。
[0006] 本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种分子鉴别四指马鲅和多 鳞四指马鲅的引物，所述引物包括引物对1和引物对2,所述引物对1包括引物F1和R1，所述 引物对2包括引物F2和R2，其中引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1示，引物R1的核苷酸序 列如SEQ ID N0:2所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，引物R2的核苷酸序列如 SEQIDN0:4**。
[0007] 具体的，各引物从5 ' -3 '的核苷酸序列如下：
[0008] FI:5 '-GCTCCTCCTCAGAGTTCCG-3 '；
[0009] R1:5，-TCAATGATAATGCCCACCA-3，；
[0010] F2:5，-GGAAAGCGTGACATAGT-3，；
[0011] R2:5，-CAGTGAAGTCCAGGTAAT-3，。
[0012] 本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种分子鉴别四指马鲅和多 鳞四指马鲅的方法，包括以下步骤：
[0013] ⑴设计上述引物对1和引物对2;
[0014] (2)提取四指马鲅或多鳞四指马鲅的DNA;
[0015] (3)以步骤(2)中的DNA为模板，采用引物对1和引物对2进行PCR扩增，扩增反应结 束后，进行电泳检测，电泳结果显示在469bp和606bp附近处分别具有一条特异性DNA特异性 条带，此时所检测的样品为四指马鲅，若未在469bp或606bp附近处出现条带，则为多鳞四指 马鲅。
[0016] 在上述分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法中：
[0017] 步骤(2)中优选采用酚氯仿有机溶剂法提取四指马鲅或多鳞四指马鲅的DNA。
[0018] 酚氯仿有机溶剂法为常规酚氯仿有机溶剂法，具体方法可参考文献Sambroo J， Fritsch E F?Maniatis T.MOLECULAR CL0NING：A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989〇
[0019] 步骤(3)中采用引物对1和引物对2进行PCR扩增时，20yLPCR反应体系中优选包含 DNA 2yL、引物对 1 或引物对2 10yL、预混Taq、dNTP、MgCl2的PCR buffer 2yL，ddH20 6yL。
[0020] 步骤(3)中采用引物对1和引物对进行PCR扩增时，可以分别采用引物对1和引物对 2进行PCR扩增，也可以同时采用引物对1和引物对2进行PCR扩增，如果用一对引物扩增，四 指马鲅会出现一条带469bp(引物F1和R1)或606bp(引物F2和R2)，而多鳞四指马鲅不会出现 条带。如果同时用两对引物扩增，四指马鲅会同时出现两条带469bp (引物F1和R1)和606bp (引物F2和R2)，而多鳞四指马鲅不会出现条带。
[0021] 步骤(3)中采用引物对1进行PCR扩增时，PCR反应程序推荐是:首先95 °C 5min，再94 °〇3〇8、661€3〇8、721€45共32个循环，再72°(：1〇1^11;采用引物对2进行?0財广增时，？0?反应程 序推荐是：首先 95°C5min，再 941€3〇8、561€3〇8、721€45共32个循环，再72°(：1〇11^11。
[0022]步骤(3)中进行电泳检测时，优选采用质量百分含量为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检 测，并加入Redsafe后在紫外光下观察。
[0023]本发明具有如下优点：
[0024] (1)本发明首次设计了分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物，该引物能在分 子水平上鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅；
[0025] (2)本发明方法是国内外首次建立的一种在分子水平上鉴别四指马鲅和多鳞四指 马鲅的新方法，它利用4条特异性引物，完成了一个PCR反应就可以鉴别四指马鲅和多鳞四 指马鲅；
[0026] (3)相比较与形态学鉴别方法，本发明方法无需依赖鱼类分类学的专业知识，更为 重要的是，不仅可鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅成品鱼，还可以鉴别它们的仔稚鱼、鱼卵甚 至是加工后的海产品，具有简便快捷、准确稳定、客观公正、经济实用的特点。
【附图说明】
[0027]图1为实施例2中采用引物F1和R1扩增的四指马鲅的特征谱带，其中Μ是DNA marker(DL2000)，S是四指马鲅，D是多鳞四指马鲅；
[0028]图2为实施例2中采用引物F2和R2扩增的四指马鲅的特征谱带，其中Μ是DNA marker(DL2000)，S是四指马鲅，D是多鳞四指马鲅；
[0029]图3为实施例3中采用引物F1和R1扩增的四指马鲅的电泳检测结果，其中Μ是DNA marker(DL2000)，1-4是四指马鲅样品；
[0030]图4为实施例3中采用引物F2和R2扩增的四指马鲅的电泳检测结果，其中Μ是DNA marker(DL2000)，dl_d4是多鳞四指马鲅样品。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细描述。
[0032] 实施例1
[0033] 本实施例提供的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物，引物包括引物对1和 引物对2，引物对1包括引物F1和R1，引物对2包括引物F2和R2，其中引物F1的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1示，引物R1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，引物R2的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0034] 各引物5 ' -3 '的核苷酸序列具体如下：
[0035] F1:5 '-GCTCCTCCTCAGAGTTCCG-3 '；
[0036] R1:5 '-TCAATGATAATGCCCACCA-3 '；
[0037] F2:5，-GGAAAGCGTGACATAGT-3，；
[0038] R2:5 '-CAGTGAAGTCCAGGTAAT-3 '。
[0039] 本发明中的引物对1和引物对2通过以下方式获取:先以10bp的随机引物作为引物 对四指马鲅和多鳞四指马鲅进行PCR扩增(PCR扩增条件可以同实施例2)，通过筛选出随机 引物扩增得到的特异性片段，克隆测序后再以测序一端10~20bp序列加上原来10bp随机引 物序列设计引物，再次PCR扩增筛选出可以出特异性条带的引物(如上文中所示）。
[0040] 实施例2
[0041]根据专业形态学鉴定后，选取已知品种的多个四指马鲅和多鳞四指马鲅，采用常 规酚氯仿有机溶剂法提取其DNA后，采用4种引物，对其基因组进行PCR扩增。
[0042] 20yLPCR反应体系中包含DNA 2yL，引物(Fl/Rl，F2/R2)10yL;预混Taq、dNTP、MgCl2的PCR buffer 2yL，ddH20 6yL〇
[0043] PCR反应程序是 95°C5min，[94°C30sec-66°CGI*Fl，Rl)S56°CGI*F2，R2) 308θ(3-72Γ458θ。] X32个循环-72Γ?0π?η。
[0044] PCR反应结束，取5yL产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，加入Redsafe后在紫外 光下观察。
[0045] 结果发现多个四指马鲅样品均同时出现一条大小为469bp (引物F1和R1)和606bp (引物F2和R2)的特异性DNA条带，具体如图1 -2中所示。
[0046] 相反多个多鳞四指马鲅样品均未出现大小为469bp(引物F1和R1)和606bp(引物F2 和R2)的特异性DNA条带，如图1-2中所示，说明当采用引物对1和引物对2分别PCR扩增时，当 在469bp(引物F1和R1)和606bp(引物F2和R2)同时出现特异性条带时，为四指马鲅样品，反 之则为多鳞四指马鲅样品。
[0047] 实施例3
[0048] 本实施例提供的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，包括以下步骤：
[0049] (1)设计上述引物对1和引物对2,具体过程参阅实施例1;
[0050] (2)各选用8尾成熟个体的四指马鲅或多鳞四指马鲅，采用常规酚氯仿有机溶剂法 提取四指马鲅或多鳞四指马鲅的DNA;
[0051] (3)以步骤(2)中的DNA为模板，采用引物对1和引物对2分别进行PCR扩增。
[0052] 20yLPCR反应体系中包含DNA 2yL，引物(Fl/Rl，F2/R2)10yL;预混Taq、dNTP、MgCl2的PCR buffer(缓冲液）2yL，ddH20 6yL。
[0053] PCR反应程序是 95°C5min，[94°C30sec-66°CGI*Fl，Rl)S56°CG_F2，R2) 308θ(3-72Γ458θ。] X32个循环-72Γ?0π?η。
[0054] PCR反应结束，取5yL产物用质量百分含量为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，加入 Redsafe后在紫外光下观察。
[0055]结果发现4份形态学鉴定为四指马鲅的样品均同时出现一条大小为469bp(引物F1 和R1)或606bp (引物F2和R2)的特异性DNA条带，表明样品为四指马鲅，如图3-4所示。
[0056] 4份形态学鉴定为多鳞四指马鲅的样品不出现条带，表明样品为多鳞四指马鲅，这 一结果与形态学鉴定的结果完全一致，如图3-4所示。
[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的引物，其特征是:所述引物包括引物对1和 引物对2，所述引物对1包括引物F1和R1，所述引物对2包括引物F2和R2，其中引物F1的核苷 酸序列如SEQ ID N0:1示，引物R1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，引物F2的核苷酸序列 如SEQ ID N0:3所示，引物R2的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。2. -种分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，其特征是包括以下步骤： (1) 设计权利要求1中的引物对1和引物对2; (2) 提取四指马鲅或多鳞四指马鲅的DNA; (3) 以步骤⑵中的DNA为模板，采用引物对1和引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后， 进行电泳检测，电泳结果显示在469bp和606bp附近处分别具有一条特异性DNA特异性条带， 此时所检测的样品为四指马鲅，若未在469bp或606bp附近处出现条带，则为多鳞四指马鲅。3. 根据权利要求2所述的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，其特征是：步骤 (2) 中采用酚氯仿有机溶剂法提取四指马鲅或多鳞四指马鲅的DNA。4. 根据权利要求2所述的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，其特征是：步骤 (3) 中采用引物对1和引物对2进行PCR扩增时，20yLPCR反应体系中包含DNA 2yL、引物对1或 引物对2 10yL、预混Taq、dNTP、MgCl2的PCR buffer 2yL，ddH20 6yL。5. 根据权利要求2所述的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，其特征是：步骤 (3)中采用引物对1进行PCR扩增时，PCR反应程序是：首先95°C5min，再94°C30s、66°C30s、72 °C45共32个循环，再72°C10min;采用引物对2进行PCR扩增时，首先95°C5min，再94°C30s、56 °C30s、72°C45 共 32 个循环，再 72°C10min。6. 根据权利要求2所述的分子鉴别四指马鲅和多鳞四指马鲅的方法，其特征是：步骤 (3)中进行电泳检测时，采用质量百分含量为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并加入Redsafe 后在紫外光下观察。
【文档编号】C12N15/11GK105838802SQ201610300523
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】蒙子宁, 李活, 杨翌聪, 陈国清, 庞德彬, 林浩然
【申请人】中山大学, 茂名市金阳热带海珍养殖有限公司