猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因svep1的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因SVEP1的分子标记及其应用。本发明利用SVEP1基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第44581bp处，该位点为A/G的碱基突变，导致Sfc Ⅰ?RFLP多态性。这个碱基突变位于SVEP1基因第3内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位点附近设计引物，得到分子标记序列SEQ ID NO.2，从而鉴定猪背膘厚和肌内脂肪性状。本发明利用现有的PCR?RFLP技术，在SVEP1基因第44581bp处发现一个A/G突变，且发现此多态位点与背膘厚和肌内脂肪性状(极)显著相关，对猪生长性状和肉质性状的研究有一定帮助。
【专利说明】
猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因 SVEP1的分子标记及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基 因 SVEP1的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 畜牧业在现代农业发展中占据着非常重要的地位，其在农业生产中所占有的比值 通常用来衡量一个国家和地区发展程度的重要指标。猪肉作为我国最主要的肉类来源，生 猪养殖产业在我国畜牧业中占据着举足轻重的地位。在20世纪80年代中期，我国肉类产量 约2000万吨，猪肉约占85%，2012年猪肉产量达到了5335万吨，约占肉类总量63.63%。虽然 猪肉所占比重逐渐下降，但其始终占据主导地位。
[0003] 随着社会的发展和消费水平的提高，消费者对猪肉品质的要求日益增高，使猪肉 生产者和猪育种者要更加关注胴体品质和肉质性状的改良。背膘薄、肌内脂肪含量高一直 以来都是猪育种工作中的重点目标性状，随着百年来的育种工作进展，肉品质优良成为我 国地方猪种的优良特性之一。
[0004] 我国地方猪种甚至含地方猪种血统的培育品种及杂交品系都因其优良的肉品质， 广受消费者欢迎。但是这些猪种多数都为脂肪型猪，其显著特点是背膘厚度大，我国地方猪 种及含有地方猪血统的品种背膘厚平均在3厘米以上。背膘沉积过多不仅导致生长缓慢，同 时也不符合当前形势对于节粮的要求。此外，肌内脂肪会显著影响猪肉风味，高的肌内脂肪 含量的猪肉具有更好的风味(黄业传，贺稚非等.皮下脂肪和肌内脂肪对猪肉风味的作用： [J].中国农业科学，2011,44(10): 2118-2130)。然而绝大多数胴体性状和肉质性状只能依 靠屠宰法进行性能测定，传统选育方法很难取得较大遗传进展，分子标记辅助育种是肉质 改良的有效途(刘欣.猪胴体性状全基因组关联分析及背膘厚主要基因筛选研究：[D].北 京：中国农业大学，2014)。尽管目前A超、B超在测定活体猪背膘厚方面有一定应用，但该测 定结果易受到各方面影响，如:猪只无法完全保定、易受测量环境影响而产生应激等等，而 且刘炜等研究已明确发现该方法测定猪背膘厚的扩展不确定度高达11.8%，因此在规模化 育种工作中利用此类方法会引入大量不准确因素，最终影响选育效果(杨秀娟，邓斌等.猪 背膘厚与眼肌厚活体A超测量技术研究：[J].西北农林科技大学学报，2014,42(5):23-27; 刘炜，吴昊昊等.猪活体背膘厚和眼肌面积不确定度评定：[J].上海畜牧兽医通讯，2013，6: 77)。此外，肌内脂肪性状更是只能通过屠宰法进行测定，给育种工作带来了极大的工作量。
[0005] SVEP1基因在2006年被Shur I等发现在骨骼组织、骨膜、骨髓以及骨髓间叶基质细 胞中表达，在肌肉和软骨中表达很低或不表达，可作为CAMs的组分调节细胞间黏附作用 (Shur I,Socher R,Hameiri M,Fried A,Benayahu D.Molecular and cellular characterization of SEL-〇B/SVEPlin osteogenic cells in vivo and in vitro[J].J Cell Physiol ,2006Feb;206(2) :420-7)。随后，Glait-Santar C等发现SVEP1 基因参与间叶 细胞的粘附过程，可以传导微环境中与细胞活性相关的信号，该基因在肌原细胞融合和肌 管形成过程中表达，表达量随着肌管成熟而减少(Shefer G，Benayahu D.SVEPlis a novel marker of activated pre-determined skeletal muscle satellite cells[J]. Stem CellRev·2010Mar;42-9)。2012年，Glait-SantarC等发现SVEPlmodule在骨骼组织和各种 乳腺癌细胞中表达，参与调控骨骼微环境的交互网络，是骨小生境中生理病理交互的调节 因子（Glait-Santar C，Pasmanik-Chor Μ , Benayahu D . Expression pattern of SVEPlalternatively-spliced forms[J] .Gene · 2012Aug; 137-45)。最新研究表明，SVEP1 基 因参与到脂肪酸储存以及葡萄糖代谢过程(Kokosar M，Benrick A，Perfilyev A，Fornes R,Nilsson E,Maliqueo M,Behre CJ,Sazonova A,0hlsson C,Ling C,Stener-Victorin E.Epigenetic and Transcriptional Alterations in Human Adipose Tissue of Polycystic Ovary Syndrome[J].Sci Rep.2016Mar 15;6:22883)，推测SVEP1 可能通过调 节脂肪酸和葡萄糖代谢进而影响脂肪沉积等过程。由于脂肪酸及葡萄糖代谢与背膘厚和肌 内脂肪性状密切相关，因此可以研究SVEP1基因是否对猪生长和肉质性状产生影响，这对改 良猪的经济性状和分子标记辅助育种有重要作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因 SVEP1的分子标记及 其应用。随着分子标记辅助育种的发展，越来越多的分子标记被用于大群体中目标性状的 选择，该方法具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。本发明中，我们发现SVEP1基因中 的一个SNP位点，该位点与猪背膘厚以及肌内脂肪含量显著相关，因此可以用作群体育种的 分子标记，提高育种效率。本发明利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间背膘 厚以及肌内脂肪含量的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为背膘厚与肌内脂肪 性状的可靠标记。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供的一种猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因 SVEP1的 分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，其中，该分子标记的核苷酸序列的340bp处还 有一个SNP位点G/A。
[0008] 本发明还提供了一种用于获得上述分子标记的引物对，其特征在于:所述引物对 为：
[0009] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0010] 反向引物：
[0011] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '。
[0012] 本发明还提供了一种上述分子标记的获得方法，以具有SVEP1基因的猪基因组DNA 为模板，采用以下引物对：
[0013]正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0014]反向引物：
[0015] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0016]进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID N0.2。
[0017] 本发明还提供了一种利用分子标记鉴定猪高的背膘厚和肌内脂肪性状的方法，以 待测猪的基因组DNA为模板，采用以下引物对：
[0018] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0019] 反向引物：
[0020] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0021] 进行PCR扩增，其中，具有579bp条带的猪，其具有SVEP1基因，如SEQ ID N0.1。
[0022] 上述具体方法如下：
[0023] -种与猪背膘厚以及肌内脂肪性状相关的分子标记的获得：
[0024] 1)猪SVEP1基因的引物设计与部分DNA序列扩增
[0025] 用猪SVEP1基因序列信息(GenBank收录号:ENSSSCG00000005455)作为引物设计的 模板序列，利用生物学引物设计软件01ig〇7.0设计引物，引物序列如下：
[0026] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0027]反向引物：
[0028] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0029] 2)PCR扩增反应：
[0030] 利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公司）从纯种美系大 白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金林育种场，）（屠宰测定与采样分成21个批次进行， 测定个体数量共计201头，全部为美系纯种大白阉割公猪)耳组织中提取基因组DNA，具体操 作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。
[0031] PCR反应:PCR反应总体积1 Ομ 1，其中猪基因组DNA模板1 μ 1，正反向引物各0.2nmo 1 / yl，PCRmix 5μ1，最后加入去离子水至总体积10yl;PCR反应条件为:95°C预变性5min后，循 环31次95°C变性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?产物经2%的琼脂 糖凝胶电泳检测，获得了部分SVEPl片段，长度为579bp，其序列为SEQINN0.2所示。
[0032] 3)PCR产物的纯化、测序
[0033] PCR产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入 1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克公司）纯化PCR产物。将纯化后 的DNA溶液送至铂尚生物技术有限公司正反向测序。
[0034]用引物扩增猪基因组DNA得到了 579bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结 果发现该片段所在的SVEP1基因 （SEQ ID N0.1所示）的第44581位置发现一个A-G转换(如图 3所示），造成一个Sfcl酶切位点WTRY_AG
[0035]本发明还提供了一种上述分子标记在猪背膘厚与肌内脂肪性状相关分子标记辅 助育种中的应用，具体应用方法如下：
[0036]采集样品的背膘厚、失水率、PH1均值、肌内脂肪、平均日增重及剩余采食量6项指 标。根据采集样品的群体结构，运用混合模型来统计分析SVEP1基因 SNP位点的基因型效应 及其与上述6项性状之间的关系：
[0037] Yij = y+genotypei+eij+G
[0038]其中，Yij为处理后性状值，μ为总体均值，eij为随机误差，G为批次效应，假定服从N (0,〇2)分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用R语言软件 (vers ion: 3.2.3)进行数据处理与统计分析。
[0039]统计分析发现该基因的A>G突变基因型，其中AA型与GG型的不同、AG型与GG型的不 同均与背膘厚极显著相关(？ = 〇.〇〇497，？ = 0.00133)4六型与66型的不同与肌内脂肪显著 相关(P = 〇. 0276)，与失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不显著相关。通过最小二 乘均数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG型基因型个体背膘厚极显著 高于AA型和AG型基因型个体，AA型基因型与AG型基因型之间无显著差异，且GG型基因型个 体肌内脂肪显著高于AA型基因型个体，AG型基因型个体与其他两种基因型个体之间无显著 差异。
[0040] 本发明还提供了一种上述分子标记的引物对在猪背膘厚与肌内脂肪性状相关分 子标记辅助育种中的应用。
[0041] 本发明还提供了一种鉴定含有SVEP1基因的猪的方法，其特征在于，包括以下步 骤:1)引物对：
[0042] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0043]反向引物：
[0044] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0045] 2)PCR扩增条件
[0046] PCR反应总体积10μ1，其中待测猪基因组DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmolAU， PCRmix 5μ1，最后加入去离子水至总体积10μ1;
[0047] 3)PCR反应条件为:95°C预变性5min后，循环31次95°C变性30s、60°C退火30s、72°C 延伸36s;最后72 °C延伸5min; PCR产物经2 %的琼脂糖凝胶电泳检测；
[0048] 4)RFLP 检测
[0049] PCR产物酶切反应体积是10μ1，其中PCR产物2μ1，去离子水6.6μ1，10 X buf f er 1μ 1，限制性内切酶Sfcl为0.4μ1，将样品混匀后离心，36°C培养箱放置2h，用2%的琼脂糖凝胶 电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；
[0050] SEQ ID N0.2序列中存在两个酶切位点，一个固有酶切位点位于178bp处，另外一 个由于SNP突变产生的酶切位点位于340bp处。酶切产生三种基因型，AA基因型有178bp和 401bp两条带，杂合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40比？四条带（由于162匕?和178匕？片 段长度相差很小，这两条带会混合在一起，所以在紫外灯下拍照只显示出三条带，但不影响 分辨基因型），GG基因型有162bp、178bp和239bp三条带（由于162bp和178bp片段长度相差很 小，这两条带会混合在一起，所以在紫外灯下拍照只显示出两条带，但不影响分辨基因型）。 [0051 ] 本发明原理SVEP1基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID N0.1的 第44581bp处，该位点为A/G的碱基突变，导致SfcI-RFLP多态性。这个碱基突变位于SVEP1基 因第3内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。故在SVEP1基因序列的SNP位点附近设计引 物，得到分子标记序列SEQ ID N0.2,从而鉴定猪背膘厚和肌内脂肪性状。
[0052]与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0053] 本发明利用现有的PCR-RFLP技术，在SVEP1基因第44581bp处发现一个A/G突变，且 发现此多态位点与背膘厚和肌内脂肪性状显著相关，对猪生长性状和肉质性状的研究有一 定帮助。
【附图说明】
[0054]图1为本发明的技术流程图。
[0055]图2为猪SVEP1基因基因组扩增电泳结果示意图。
[0056] M:DL2000分子量标记。
[0057]图3为本发明中猪SVEP1基因测序发现的A>G突变。
[0058] 图4为猪SVEP1基因外显子的SfcI-RFLP的三种基因型（AA GG AG)电泳结果示意 图。
[0059] M:2000bp DNA分子量标记。
【具体实施方式】
[0060] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0061 ] 实施例1:
[0062] -种与猪背膘厚和肌内脂肪性状相关的分子标记的获得：
[0063] 1)猪SVEP1基因的引物设计与部分DNA序列扩增
[0064] 用猪SVEP1基因序列信息(GenBank收录号:ENSSSCG00000005455)作为引物设计的 模板序列，利用生物学引物设计软件01ig〇7.0设计引物，引物序列如下：
[0065] 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ；
[0066] 反向引物：
[0067] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0068] 2)PCR扩增反应：
[0069] 利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公司）从纯种美系大 白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金林育种场）（屠宰测定与采样分成21个批次进行， 测定个体数量共计201头，全部为美系纯种大白阉割公猪)耳组织中提取基因组DNA，具体操 作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。
[0070] PCR反应:PCR反应总体积1 Ομ 1，其中猪基因组DNA模板1 μ 1，正反向引物各0.2nmo 1 / yl，PCRmix 5μ1，最后加入去离子水至总体积10yl;PCR反应条件为:95°C预变性5min后，循 环31次95°C变性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?产物经2%的琼脂 糖凝胶电泳检测，获得了部分SVEPl片段，长度为579bp，其序列为SEQINN0.2所示。
[0071] 3)PCR产物的纯化、测序
[0072] PCR产物的纯化:在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入 1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克公司）纯化PCR产物，按照试剂 盒说明书操作，具体步骤是按照l〇〇mg胶块加入400μ1 GS Buffer的比例加入GS Buffer，置 50°C温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次;将溶化的胶液转入到离 心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，lOOOOrpm离心30s，弃去废液;将离心吸附柱 置回废液收集管中，加入500μ1 Wash Buffer于离心吸附柱中，lOOOOrpm离心30s，弃滤液。 以同样的方法再用500yl Wash Buffer溶液洗涤一次;将离心吸附柱置会废液收集管中，最 高速度离心lmin;小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中 央加入30μ1双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心lmin;取出离心吸附柱，将1.5ml离 心管(DNA溶液)置于-20°C保存备用。将纯化后的DNA溶液送至铂尚生物技术有限公司正反 向测序。
[0073] 用引物扩增猪基因组DNA得到了 579bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结 果发现该片段所在的SVEP1基因 （SEQ ID N0.1所示）的第44581位发现一个A-G转换（如图3 所示），造成一个Sf cI酶切位点(CTTRYA_G_):。
[0074] 实施例2
[0075] -种基于与猪背膘厚和肌内脂肪性状相关的分子标记的检测方法，其步骤如下：
[0076] PCR-RFLP诊断方法建立
[0077] 1)引物序列
[0078] 正向引物：5'-TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3' ；
[0079] 反向引物：
[0080] 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '；
[0081 ]该引物扩增片段长度579bp，其序列为SEQIDN0.2所示。
[0082] 2)PCR扩增条件
[0083] PCR反应总体积10μ1，其中待测猪基因组DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmolAU， PCRmix 5μ1，最后加入去离子水至总体积10μ1 WCR反应条件为:95°C预变性5min后，循环31 次95°C变性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸368;最后72°(：延伸51^11;?0?产物经2%的琼脂糖凝 胶电泳检测。
[0084] 3)RFLP 检测
[0085] PCR产物酶切反应体积是10μ1，其中PCR产物2μ1，去离子水6.6μ1，10 X buf f er 1μ 1，限制性内切酶Sfcl为0.4μ1，将样品混匀后离心，36°C培养箱放置2h，用2%的琼脂糖凝胶 电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；
[0086] SEQ ID N0.2序列中存在两个酶切位点，一个固有酶切位点位于178bp处，另外一 个由于SNP突变产生的酶切位点位于340bp处。酶切产生三种基因型，AA基因型有178bp和 401bp两条带，杂合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40比？四条带（由于162匕?和178匕？片 段长度相差很小，这两条带会混合在一起，所以在紫外灯下拍照只显示出三条带，但不影响 分辨基因型），GG基因型有162bp、178bp和239bp三条带（由于162bp和178bp片段长度相差很 小，这两条带会混合在一起，所以在紫外灯下拍照只显示出两条带，但不影响分辨基因型）。 [0087] 实施例3
[0088] -种与猪背膘厚和肌内脂肪性状相关的分子标记在不同猪群体多态性检测中的 应用，其步骤是：
[0089]利用PCR-SfcI-RFLP检测了纯种美系大白阉割猪实验群体(该群体来源于湖北金 林育种场）（201个美系纯种大白阉割公猪群体）。该突变位点在实验群体中的基因型和基因 频率如表1所示，检测结果显示，SVEP1基因在实验群体中存在三种基因型，其中AA型个体有 71头，AG型个体有97头，GG型个体有33头，酶切分型的检测结果与测序结果相符，本发明的 检测方法可靠。此结果表明SVEP1基因在纯种美系大白阉割猪实验群体中等位基因 A占优 势。
[0090] 实施例4
[0091] -种与猪背膘厚和肌内脂肪性状相关的分子标记与部分生长性状及肉质性状的 关联分析
[0092] 本实施例的猪群来自本湖北金林育种场纯种美系大白阉割猪，屠宰测定与采样分 成21个批次进行，测定个体数量共计201头，全部为美系纯种大白阉割公猪。
[0093] 所分析的性状主要是部分生长性状及与饲料转化效率性状相关的性状，包括:背 膘厚、失水率、PHI均值、肌内脂肪、平均日增重及剩余采食量6项指标。根据采集样品的群体 结构，
【申请人】运用混合模型来统计分析SVEP1基因 SNP位点的基因型效应及其与部分生长和 肉质性状的关系：
[0094] Yi j =y+genotypei+￡ij+G
[0095]其中，Yi j为处理后性状值，μ为总体均值，ε i j为随机误差，G为批次效应，假定服从 N(0,〇2)分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用R语言软件 (vers ion: 3.2.3)进行数据处理与统计分析。
[0096]对猪SVEP1基因 SfcI-RFLP多态性位点与部分生长及饲料转化效率性状进行关联 分析，由表1知:在201个个体中AA型个体有71头，AG型个体有97头，GG型个体有33头。
[0097]本实施例采用R语言软件中的广义线性模型对猪SVEP1基因的A>G突变位点的多态 在美系大白阉割猪群体中对部分生长及肉质性状进行了初步的关联分析。初步分析结果见 表1。统计分析发现该基因的A>G突变基因型，其中AA型与GG型的不同、AG型与GG型的不同均 与背膘厚极显著相关(？ = 〇.〇〇497，？ = 0.00133)4六型与66型的不同与肌内脂肪显著相关 (P = 0.0276)，与失水率、PH1均值、平均日增重及剩余采食量不显著相关。通过最小二乘均 数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG型基因型个体背膘厚极显著高于 AA型和AG型基因型个体，AA型基因型与AG型基因型之间无显著差异，且GG型基因型个体肌 内脂肪显著高于AA型基因型个体，AG型基因型个体与其他两种基因型个体之间无显著差 异。
[0098]表1 SVEP1基因多态性位点基因型与部分生长性状及肉质性状的关联分析检测 [0099]
[0100]注:表中的性状均值为平均数土标准差。
[0101] RFI:剩余采食量。
[0102] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种猪背膘厚与肌内脂肪性状相关基因 SVEP1的分子标记，其特征在于:其核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示，其中，该分子标记的核苷酸序列的340bp处还有一个SNP位点G/A。2. 用于获得权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于:所述引物对为： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '。3. 按权利要求1或2所述分子标记的获得方法，其特征在于：以具有SVEP1基因的猪基因 组DNA为模板，采用以下引物对： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID NO.2。4. 按照权利要求1所述的分子标记鉴定猪背膘厚与肌内脂肪性状的方法，以待测猪的 基因组DNA为模板，采用以下引物对： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 进行PCR扩增，其中，具有579bp条带的猪，其具有SVEP1基因，如SEQ ID N0.1。5. 权利要求1所述的分子标记在猪部分生长性状及肉质性状相关分子标记辅助育种中 的应用。6. 权利要求2所述的分子标记的引物对在猪部分生长性状及肉质性状相关分子标记辅 助育种中的应用。7. -种鉴定含有SVEP1基因的猪的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 引物对： 正向引物：5 ' -TGTCGCATGTGCTTGGTAGAT-3 ' ； 反向引物： 5 '-GAACCTGGACTTCAAGGGACCATTCTTCCTCTCAGC-3 '； 2. PCR扩增条件 PCR反应总体积10μ1，其中待测猪基因组DNA模板ΙμL，正反向引物各0.2nmol/yl， PCRmix 5μ1，最后加入去离子水至总体积10μ1; 3. PCR反应条件为:95°C预变性5min后，循环31次95°C变性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸 36s;最后72°C延伸5min;PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测； 4. RFLP检测 PCR产物酶切反应体积是10μ1，其中PCR产物2μ1，去离子水6.6μ1，10 X buf f er ΙμL，限 制性内切酶Sfcl为0.4μ1，将样品混匀后离心，36°C培养箱放置2h，用2%的琼脂糖凝胶电泳 检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照； SEQ ID NO.2序列中存在两个酶切位点，一个固有酶切位点位于178bp处，另外一个由 于SNP突变产生的酶切位点位于340bp处，酶切产生三种基因型，AA基因型有178bp和401bp 两条带，杂合子AG基因型有162匕？、178匕？、23%?和40讣？四条带，66基因型有162匕？、178匕?和
【文档编号】C12Q1/68GK105838795SQ201610268426
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】李长春, 邹成, 罗文哲, 李菁璇, 张皓源, 吴宇, 胡岸, 赵书红, 余梅, 李新云
【申请人】华中农业大学