用于定性检测白血病融合基因的引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测白血病融合基因的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及采用该引物组合或试剂盒进行白血病融合基因检测的多重巢式RT?PCR方法。本发明基于多重巢式RT?PCR技术，因此简单、快捷，灵敏度高。此外，本发明通过合理的引物搭配，有效避免了多对引物之间的相互作用，减少了检测误差。采用本发明的检测方法可以全面地对43种白血病融合基因进行定性检测，不仅可以节约试剂用量，降低检测成本，而且检测范围广，适于对临床上大批量样本进行检测。
【专利说明】
用于定性检测白血病融合基因的引物、试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于定性检测白血病融合基因的引物、 试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 白血病是儿童和青年中最常见的一种恶性克隆性疾病。多项研究表明大部分的白 血病患者中存在某种染色体结构的畸变(缺失、重复、倒位、易位等），这些是导致白血病发 生以及发展的重要原因。染色体结构的畸变，会导致原癌基因及抑癌基因的结构变异，使得 癌基因、原癌基因突变激活，抑癌基因缺失或失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。因而 不同的融合基因已经成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。如慢性髓细胞白血病 (CML)中的BCR-ABL1融合基因，急性早幼粒细胞白血病(APL)中的PML-RARA融合基因已成为 各自的分子标志并进一步成为治疗的靶标。2000年WHO关于白血病分型的标准中更是将其 中一些常见的异常归纳为白血病基本诊断的标准之一。鉴于白血病相关融合基因的检测对 于白血病诊断、分型、临床治疗选择、预后疗效评价以及微小残留病(MRD)检测上的临床价 值，融合基因检测技术的开发具有极大的临床意义和市场价值。
[0003] 目前，融合基因的检测方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交技术以及聚 合酶链式反应(PCR)。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比，PCR检测方法具有快速 有效、灵敏度高等优点，在临床上有较广的应用。多重PCR技术是指在同一个PCR体系中加入 多对引物，能够同时扩增出多个DNA片段。作为PCR重要的衍生技术，多重PCR可以同时扩增 多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点。巢式PCR是一种变异的PCR技术， 其使用两对引物扩增完整的片段。第一对引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢 式引物，其结合在第一次PCR产物的内部，使得第二扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优 点在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增 的概率极低。因此，巢式PCR能够提高PCR的灵敏度以及减少非特异扩增。
[0004] 然而，多重巢式PCR技术需要在同一个PCR反应体系中加入多对引物，这样就增加 了多对引物在反应体系中相互作用和形成引物二聚体的几率，从而降低了 PCR反应的特异 性和效率，甚至不能扩增出特异性目标产物。此外，随着人们对白血病研究的不断深入，越 来越多的白血病融合基因已被发现，当前检测白血病融合基因的方法已经远远不能满足人 们对于同时检测绝大部分融合基因的需求，亟需一种快速、有效且易于标准化的能同时定 性检测绝大部分白血病融合基因的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的白血病融合基因数据库，重 新设计了用于检测白血病融合基因的检测引物以及多重巢式RT-PCR方法。本发明的检测方 法快速、有效且易于对43种白血病融合基因进行标准化的定性检测。
[0006] 为此，本发明一方面提供了 一种用于检测白血病融合基因的引物组合，其由SEQ ID NO. 1-138所示的引物组成。
[0007] 在本发明优选的实施方案中，该引物组合中SEQ ID NO. 1-69所示的引物组成第一 大组检测引物，SEQ ID N0.70-138所示的引物组成第二大组检测引物;第一大组检测引物 进一步由SEQIDN0.1-8、68、69所示的第一小组检测引物，SEQIDN0.9-15、68、69所示的 第二小组检测引物，SEQIDN0.16-21、68、69所示的第三小组检测引物，SEQIDN0.22-26、 68、69所示的第四小组检测引物，SEQ ID N0.27-33、68、69所示的第五小组检测引物，SEQ IDN0.34-38、68、69所示的第六小组检测引物，SEQIDN0.39-46、68、69所示的第七小组检 测引物，SEQIDN0.47-50、68、69所示的第八小组检测引物，SEQIDN0.51-54、68、69所示 的第九小组检测引物，SEQIDN0.55-59、68、69所示的第十小组检测引物，SEQIDN0.60- 67、68、69所示的第^^一小组检测引物组成;第二大组检测引物进一步由SEQ ID N0.70-77、 137、138所示的第一小组检测引物，SEQ ID NO.78-84、137、138所示的第二小组检测引物， SEQIDN0.85-90、137、138所示的第三小组检测引物，SEQIDN0.91-95、137、138所示的第 四小组检测引物，SEQIDN0.96-102、137、138所示的第五小组检测引物，SEQIDN0.103- 107、137、138所示的第六小组检测引物，SEQ ID N0.108-115、137、138所示的第七小组检测 引物，SEQIDN0·116-119、137、138所示的第八小组检测引物，SEQIDN0·120-123、137、 138所示的第九小组检测引物，SEQ ID N0.124-128、137、138所示的第十小组检测引物，SEQ ID从).129-136、137、138所示的第^^一小组检测引物组成。
[0008] 本发明通过选择相关基因断裂位点上游序列和下游序列，来进行特异性多重PCR 引物的设计。所设计的引物Tm值均在60°C附近，整合搭配各个引物，从而尽量避免了引物二 聚体产生，提高了 PCR扩增的特异性和效率。
[0009] 针对43种白血病融合基因，本发明设计的具体引物情况如表1所示。
[0010] 表1、本发明的引物情况表
[0014]
[0015] 本发明另一方面提供了一种用于检测白血病融合基因的试剂盒，其包含本发明所 述的引物组合。
[0016] 在本发明优选的实施方案中，试剂盒中SEQ ID N0.1-67所示的引物浓度为 2.5pmolAU，SEQ ID N0.70-136所示的引物浓度为3.5pmolAU，SEQ ID Ν0·68、69、137和 138所示的引物浓度为2.5ρηιο1/μ1。
[0017]在本发明进一步优选的实施方案中，试剂盒中进一步包含5%的DMS0。
[0018]本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测白血病融合基因试剂 盒中的应用。
[0019] 本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测 白血病融合基因中的应用。
[0020] 本发明最后一方面提供了一种检测白血病融合基因的多重巢式RT-PCR方法，其包 含以下步骤：
[0021] 1、获取待测样品的CDNA模板。
[0022] 2、采用本发明所述的引物SEQ ID N0.1-69,或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1 中获取的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增。
[0023]第一轮PCR扩增的引物为外侧引物，分为11管，每管中均为多重引物，采用20μ1的 反应体系：去离子水8· 18μ1、10 XStanard Taq Reaction Buffer 2μ1、2·5πιΜ dNTPs 1·6μ l、25mM MgCl2 0·12μ1、2·5ρηιο1/μ1 Primes 2yl、DMS0 lyl、cDNA Template 5yl、Hot Start Taq DNA聚合酶0 · ΙμL，反应条件为：首先95°C30s;其次95°C30s，58°C30s，68°C50s， 共25个循环。
[0024] 3、采用本发明所述的引物SEQ ID NO.70-138,或采用本发明所述的试剂盒，以步 骤2中获得的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增。
[0025] 第二轮PCR扩增的引物为内侧引物，同样地相对应分为11管，每管中也均为多重引 物，同样采用20μ1 的反应体系：去离子水 12.3yl、10XStanard Taq Reaction Buffer 2μ1、 2.5mM dNTPs 1·6μ1、3·5ρπιο1/μ1 Primes 2yl、DMS0 ΙμL、第 1 轮PCR产物lyl、Hot Start Taq DNA聚合酶Ο.?μL，反应条件为：首先95°C30s;其次95°C30s，58°C30s，68°C50s，共20个 循环。
[0026] 4、第二轮PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读。
[0027]本发明在多重巢式RT-PCR的检测中，内参对照引物针对人E2A基因，且第一轮和第 二轮PCR扩增时，每管中均加入内参基因 E2A引物，阴性对照(水）中则不添加任何cDNA模板。 因此，在采用电泳进行检测时，只有当内参基因扩增出690bp的目的条带，且其中1管中能够 扩增出相应的融合基因目的条带，无模板对照品无扩增信号时，待测样本的检测结果才有 效且呈阳性。
[0028] 在本发明优选的实施方案中，SEQ ID N0.1-67所示的引物浓度为2.5pmOl/μl，SEQ IDN0.70-136所示的引物浓度为3·5pmol/μl，SEQIDN0·68、69、137和138所示的引物浓度 为2 · 5ρηιο1/μ1 〇
[0029] 在本发明进一步优选的实施方案中，在第一轮和第二轮PCR扩增时，体系内均加入 终体积为5 %的DMS0，以提高PCR扩增效率及特异性。
[0030] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
[0031] 1、与现有的染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比，本发明的检测方法基于多 重巢式RT-PCR技术，因此方法简单、快捷，灵敏度高。
[0032] 2、本发明的检测方法通过合理的引物搭配，可以有效避免多对引物之间的相互作 用，从而减少了检测误差。
[0033] 3、本发明的检测方法可以全面地对43种白血病融合基因进行定性检测，不仅可以 节约试剂用量，降低检测成本，而且检测范围广，适于对临床上大批量样本进行检测。
【附图说明】
[0034] 图1:43种白血病融合基因巢式RT-PCR的工作原理示意图。
[0035] 图2:实施例1中采用白血病融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体 系特异性的PCR反应产物结果图。
[0036] 图3:实施例2中采用白血病融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体 系灵敏性的PCR反应产物结果图。
[0037]图4:实施例3中采用本发明检测体系进行临床样本检测的结果图。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0039] 实施例1:利用融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体系的特异性
[0040] 本实施例以确定含有BCR-ABL1融合基因的K562阳性细胞系、AML1-ET0融合基因的 Kasumi细胞系以及不含融合基因的HL60阴性细胞系来验证本发明检测方法的可行性及特 异性。其中K562细胞系、Kasumi细胞系、HL60细胞系均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任 公司。
[0041 ]本实施例的具体检测方法如下：
[0042] 1、细胞培养
[0043] 按照细胞培养的标准操作培养K562细胞系、Kasumi细胞系以及HL60细胞系，置于 37 °C、5 % C02培养箱内培养。
[0044] 2、核酸提取
[0045] 建议使用TIANGEN RNAprep Pure Blood Kit试剂盒，按照试剂盒说明书操作来提 取细胞系中的RNA，之后立即进行逆转录。
[0046] 3、逆转录
[0047]建议使用Promega GoScript? Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明 书操作来获得cDNA。逆转录的cDNA用Nuclease-Free Water进行相应地稀释(根据总RNA浓 度进行计算），稀释后的cDNA用来进行巢式RT-PCR检测。
[0048] 4、多重巢式RT-PCR检测
[0049] (1)巢式卩0?第1轮反应
[0050] 20ul的反应体系中依次加入去离子水8 · 18ul、10 X Stanard Taq React ion Buffer 2ul、2.5mM dNTPs 1.6ul、25mM MgCl2 0.12ul、2.5pmol/ul Primes 2ul、DMS0 lul、cDNA Template 5ul、Hot Start Taq DNA聚合酶O.lul。
[0051 ] PCR反应条件为：95°C预变性30s; 95 °C变性30s，58°C退火30s，68°C延伸50s，共25 个循环。PCR结束的产物作为第2轮反应的模板。
[0052] (2)巢式PCR第2轮反应
[0053] 20ul的反应体系中依次加入去离子水12.3ul、10XStanard Taq Reaction Buffer 2ul、2.5mM dNTPs 1.6ul、3.5pmol/ul Primes 2ul、DMS0 lul、第 1 轮PCR产物lul、 Hot Start Taq DNA聚合酶O.lul。
[0054] PCR反应条件为：95°C预变性30s; 95 °C变性30s，58°C退火30s，68°C延伸50s，共20 个循环;最后68°C充分延伸5min。
[0055] (3)电泳检测
[0056] 用2%的琼脂糖凝胶电泳检测第2轮扩增产物，检测结果参见说明书附图2。其中图 2A为K562阳性细胞系的融合基因检测结果；图2B为Kasumi阳性细胞系的融合基因检测结 果；图2C为HL60阴性细胞系的融合基因检测结果；图2D为阴性对照(水)的检测结果。泳道1- 11分别代表第1-11管(R1-R11)中的反应产物，Μ为500bp标准分子量。
[0057] 从附图2可以看出，图2A、2B和2C中，R1-R11每个泳道中都扩增出690bp的内参基因 E2AJ562阳性细胞系中含有BCR-ABL1的融合基因，R6泳道中可以扩增出BCR-ABL1的目的条 带，如图2A所示；Kasumi阳性细胞系中含有AML1-ET0的融合基因，R4泳道中可以扩增出 AML1-ET0的目的条带，如图2B所示;HL60阴性细胞系中不含融合基因，R1-R11泳道中都扩增 不出目的条带，如图2C所示；阴性对照无模板扩增不出内参基因 E2A和融合基因，如图2D所 不。
[0058] 由此可见，本实施例的检测结果与融合基因阳性细胞系及阴性细胞系的特性相一 致，表明利用本发明的检测体系可以特异性地进行白血病融合基因的定性检测。
[0059] 实施例2:利用融合基因阳性细胞系和阴性细胞系检测本发明检测体系的灵敏度
[0060] 本实施例同样以确定含有BCR-ABL1融合基因的K562阳性细胞系、AML1-ET0融合基 因的Kasumi细胞系以及不含融合基因的HL60阴性细胞系来验证本发明检测体系的灵敏性。 具体检测方法如下：
[0061 ]以HL-60细胞系（不含融合基因的阴性细胞系）分别对K562细胞系（含有BCR-ABL1 融合基因的阳性细胞系）和Kasumi细胞系（含有AML-ET0融合基因的阳性细胞系）进行 100 %、10 %、1%、1%〇、0 · 5%〇、0 · 25%〇、0 · 125%〇 (稀释后阳性细胞系与阴性细胞系的比例）的 稀释，用稀释好的混合细胞系提取RNA并逆转录成cDNA，进行巢式RT-PCR检测。
[0062] 采用与实施例1相同的巢式PCR反应体系和反应条件，第二轮PCR扩增后产物的琼 脂糖凝胶电泳结果参见说明书附图3。图3A中泳道1 -7分别代表100 % K562、10 % K562、1 % 1(562、1%〇1(562、0.5%。1(562、0.25%。1(562和0.125%。1(562;图38中泳道1-7分别代表100% Kasumi、10 %Kasumi、1 %Kasumi、l%〇Kasumi、0 · 5%〇Kasumi、0 · 25%〇Kasumi和0 · 125%〇 Kasumi，M为500bp标准分子量。图3A和3B中每个泳道中都扩增出690bp的内参基因 E2A，图3A 的泳道1-6都扩增出472bp的BCR-ABL1融合基因，图3B的泳道1-6都扩增出353bp的AML1-ET0 融合基因。
[0063] 由此可见，当达到0.125%〇Κ562或0.125%〇Kasumi细胞（8000个HL60细胞中含有1个 K562或1个Kasumi细胞)时，本发明的多重巢式RT-PCR方法检测不到相应的融合基因，表明 本发明的多重巢式RT-PCR检测体系的检测灵敏度介于1/4000-1/8000(癌细胞与正常细胞 个数比）之间。
[0064]实施例3:采用本发明的检测体系进行临床样本的检测
[0065]本实施例采集临床白血病患者外周血或骨髓血样本150例，按照本发明的检测体 系进行43种融合基因的定性检测。其中25例临床样本经本发明的多重巢式RT-PCR检测为融 合基因阳性，125例为融合基因阴性。
[0066]利用本发明的多重巢式RT-PCR检测体系检测临床样本，操作步骤包括血液样本中 白细胞RNA提取、RNA逆转录为cDNA、巢式PCR第1轮反应、巢式PCR第2轮反应、分离PCR反应产 物、琼脂糖凝胶电泳。具体的操作方法同本发明实施例1。第2轮PCR扩增后产物的琼脂糖凝 胶电泳结果参见说明书附图4。其中图4A为采用本发明的多重巢式RT-PCR检测到的5种融合 基因异构体的电泳结果；图4B为采用本发明的多重巢式RT-PCR检测到的另外4种融合基因 异构体的电泳结果。图4A中泳道1、3、5、7、9依次代表的融合基因分别为CBFB-MYH11 (A型）、 E2A-PBX1、SIL-TAL1、AML1-ET0和BCR-ABLl(pl90型），泳道2、4、6、8、10依次代表相对应的阴 性对照。图4B中泳道1、3、5、7依次代表的融合基因分别为BCR-ABL1 (p210型）、PML-RARA(L 型）、PML-RARA (S型）和DEK-CAN，泳道2、4、6、8依次代表相对应的阴性对照。Ml为2000bp标准 分子量，M2为500bp标准分子量。图4A和4B中阴性对照中扩增不出内参基因 E2A和融合基因， 阳性样本中可以扩增出内参基因 E2A。
[0067]由此可见，利用本发明的多重巢式RT-PCR检测体系，检测出的白血病融合基因与 临床诊断相一致，表明本发明的多重巢式RT-PCR检测体系完全可以应用于临床检测。
[0068]以上结果表明，本发明的多重巢式RT-PCR检测体系可以全面地进行白血病43种融 合基因的定性筛查。本发明了的检测体系不仅节约试剂和样本的用量，同时降低了检测成 本，具有临床应用价值。
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[0083]
【主权项】
1. 一种用于检测白血病融合基因的引物组合，其由SEQ ID NO.1-138所示的引物组成。2. 根据权利要求1所述的引物组合，其中SEQ ID NO. 1-69所示的引物组成第一大组检 测引物，SEQ ID NO.70-138所示的引物组成第二大组检测引物;第一大组检测引物进一步 由SEQIDN0.1-8、68、69所示的第一小组检测引物，SEQIDN0.9-15、68、69所示的第二小 组检测引物，SEQIDN0.16-21、68、69所示的第三小组检测引物，SEQIDN0.22-26、68、69 所示的第四小组检测引物，SEQIDN0.27-33、68、69所示的第五小组检测引物，SEQID N0.34-38、68、69所示的第六小组检测引物，SEQIDN0.39-46、68、69所示的第七小组检测 引物，SEQIDN0.47-50、68、69所示的第八小组检测引物，SEQIDN0.51-54、68、69所示的 第九小组检测引物，SEQIDN0.55-59、68、69所示的第十小组检测引物，SEQIDN0.60-67、 68、69所示的第^^一小组检测引物组成；第二大组检测引物进一步由SEQ ID NO. 70-77、 137、138所示的第一小组检测引物，SEQ ID NO.78-84、137、138所示的第二小组检测引物， SEQIDN0.85-90、137、138所示的第三小组检测引物，SEQIDN0.91-95、137、138所示的第 四小组检测引物，SEQIDN0.96-102、137、138所示的第五小组检测引物，SEQIDN0.103-107、137、138所示的第六小组检测引物，SEQ ID N0.108-115、137、138所示的第七小组检测 引物，SEQIDN0·116-119、137、138所示的第八小组检测引物，SEQIDN0·120-123、137、 138所示的第九小组检测引物，SEQ ID NO. 124-128、137、138所示的第十小组检测引物，SEQ ID从).129-136、137、138所示的第^^一小组检测引物组成。3. -种用于检测白血病融合基因的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物组合。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中SEQ ID NO. 1-67所示的引物浓度为2.5ρπι〇1/μ1， SEQIDN0.70-136所示的引物浓度为3.5pmol/μl，SEQIDN0.68、69、137和138所示的引物 浓度为 2.5ρηιο1/μ1。5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其进一步包含5 %的DMS0。6. 权利要求1或2所述的引物组合在制备检测白血病融合基因试剂盒中的应用。7. 权利要求1或2所述的引物组合，或者权利要求3-5中任一项所述的试剂盒在检测白 血病融合基因中的应用。8. -种检测白血病融合基因的多重巢式RT-PCR方法，其包含以下步骤： (1) 获取待测样品的cDNA模板； (2) 采用权利要求1或2所述的引物SEQ ID NO. 1-69,或采用权利要求3-5中任一项所述 的试剂盒，以步骤(1)中获取的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增； (3) 采用权利要求1或2所述的引物SEQ ID NO.70-138,或采用权利要求3-5中任一项所 述的试剂盒，以步骤(2)中获得的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增； (4) 第二轮PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读。9. 根据权利要求8所述的方法，其中SEQ ID NO. 1-67所示的引物浓度为2.5ρπιο1/μ1， SEQIDN0.70-136所示的引物浓度为3.5pmol/μl，SEQIDN0.68、69、137和138所示的引物 浓度为 2.5ρηιο1/μ1。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中在第一轮和第二轮PCR扩增时，体系内均加入 终体积为5%的DMS0。
【文档编号】C12Q1/68GK105838793SQ201610254800
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】郑仲征, 杜金伟, 张鹏, 王宁娟, 潘捷, 杜可明
【申请人】上海荻硕贝肯生物科技有限公司