一种基于smad7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 猪为六畜之首，养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。猪肉在诸多 肉类产品中的比重一直保持在三分之一左右，是人们比较喜爱的副食之一。人们的生活不 断改善，传统的养殖技术已经不能满足人们对猪肉的需求量。随着现代育种技术的发展，猪 的生产性能显著提高，猪的健康养殖和育肥就显得格外重要。然而猪活体背膘厚不仅关系 到种猪的选育、生猪的生长发育、死亡率，而且还直接影响后期育肥效果。背膘厚度直接反 应猪脂肪含量的高低，对于校正到同一个体重标准下的猪群，背膘厚度数值越大，则瘦肉率 越低，骨骼肌含量越少，效益越低。因此，如何有效的降低猪活体校正背膘厚，是每个猪场经 营者及育种学家追求的目标。
[0003] 随着分子生物学的发展，分子标记辅助选择在猪育种中发挥越来越重要的作用， 大大加快了育种进程。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是育种中 运用较多的分子标记方法。
[0004] Smad(mothers against decapentaplegic-like protein)家族存在于细胞质中， 它最初是在研究果蝇BMP配体突变的时候发现的。Smad作为TGF-β受体激酶的底物存在， Smad家族主要可以分为3类：抑制型（inhibitory Smads，I-Smads)、激活型（receptor-regulated Smads，R-Smads)、公共介导型（common patrner Smads，C〇-Smads) 〇SMAD7(Smad family member 7)是Smad家族成员之一，属于抑制型在人当中定位于染色体18q21，长度为 3 lllbpeSMAD?蛋白是TGF-0(transforming growth factor-β)转化生长因子的抑制物，竞 争性抑制R-Smads的磷酸化，从而发挥它对TGF-β的信号通路的抑制作用。还有研究初步表 明SMAD7可能与转录因子协作加强MyoD的功能影响肌肉增殖分化。SMAD7主要是作为一个抑 制因子调节TGF-f3-SMAD2/3通路。SMAD7通过直接结合在受体复合物的胞质尾区阻止SMAD2/ 3不被TGF-βΙ型受体(ALK5)磷酸化，从而SMAD7发挥了抑制了 SMAD2/3和SMAD4复合物的形成 作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的方法。
[0006] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的方法是检测猪个体的基因型 是CC基因型还是TT基因型还是CT基因型，根据所述猪个体的基因型确定所述猪活体背膘 厚:TT基因型的猪个体的活体背膘厚高于CC基因型的猪个体或CT基因型的猪个体；
[0007] 所述CC基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体； [0008]所述CT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体； [0009]所述TT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体。
[0010] 上述方法中，所述检测猪个体的基因型是CC基因型还是TT基因型还是CT基因型为 如下A)或B):
[0011] A)直接测序猪个体的SMAD7基因；
[0012] B)测序含有SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸的PCR扩增产物； [0013]所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2):
[0014] 1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组 成的引物对A;
[0015] 2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;
[0016] 所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同 功能的核苷酸；
[0017] 所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同 功能的核苷酸。
[0018] 本发明的另一个目的是提供检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧 核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。
[0019] 本发明提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸的 基因型的物质在鉴定猪活体背膘厚性状中的应用。
[0020] 本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在制备鉴定猪活体背膘厚性状的产品中的应用。
[0021] 本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含量高的种猪中 的应用。
[0022]本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在制备选育选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含量高 的种猪的产品中的应用。
[0023]本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在猪育种中的应用。
[0024]本发明还提供了检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸 的基因型的物质在制备猪育种的广品中的应用。
[0025] 本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的产品。
[0026] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪活体背膘厚性状的产品为检测猪个体的SMAD7基 因第四内含子的第244位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质。
[0027]上述应用或产品中，所述检测猪个体的SMAD7基因第四内含子的第244位脱氧核糖 核苷酸的基因型的物质为如下1)或2)或3)或4):
[0028] 1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组 成的引物对A;
[0029] 2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B;
[0030] 所述序列A为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同 功能的核苷酸；
[0031] 所述序列B为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同 功能的核苷酸；
[0032] 3)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B的PCR试剂；
[0033] 4)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B或3)所述PCR试剂的试剂盒。
[0034]本发明的最后一个目的是提供一种选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/ 或骨骼肌含量高的种猪的方法。
[0035]本发明提供的选育猪活体背膘厚度值小和/或瘦肉率高和/或骨骼肌含量高的种 猪的方法包括选择CC基因型或CT基因型的猪进行育种；
[0036]所述CC基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体； [0037]所述CT基因型为SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。 [0038]上述方法或应用或产品中，所述SMAD7基因第四内含子的序列如序列1所示。
[0039]上述方法或应用或产品中，所述SMAD7基因第四内含子第244位脱氧核糖核苷酸也 即为猪SMAD7基因（NC_010446.4)第28948位核苷酸。
[0040]本发明发现了猪SMAD7基因的第四内含子的C244T位点对猪活体背膘厚有显著影 响，并基于上述SNP位点提供了一种基于SMAD7基因的猪活体背膘厚标记辅助选择方法。通 过试验证明：本发明用SMAD7基因第四内含子的第244位单核苷酸多态性来鉴定猪活体背膘 厚的方法与猪活体背膘厚的实际测定结果一致，对选择优良猪种有重要意义。
【具体实施方式】
[0041 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 实施例1、一种鉴定猪活体背膘厚性状的方法
[0044] 一、猪SMAD7基因的SNP位点的筛选
[0045] 1、猪耳组织样品DNA的提取
[0046]分别采集来自河北种猪场的323头大白猪的血液样品，样品采集后，保存于75%酒 精中，并于-20°C保存。采用苯酚-氯仿抽提法提取血液样品的基因组DNA，具体步骤如下： [0047] (1)耳组织样的准备:剪取大小适中的耳组织样，用生理盐水冲洗掉表面的杂质和 血污，放于1.5mL离心管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500yL的组织裂解液(北京百泰科 生物技术有限公司；产品编号:AU19011);
[0048] (2)根据所剪取的耳组织样的大小，向离心管中加入15~25yL的蛋白酶K(SIGMA- ALDRICH;产品编号：SRE0005);
[0049] (3)放于水浴摇床上，55°C消化过夜，确保耳组织样消化完全，得到消化彻底的耳 组织；
[0050] (4)将上述消化彻底的耳组织样于室温放置，加入等体积的Tris-饱和酚(江苏宝 莱生物科技有限公司），翻覆颠倒混勾5min;
[0051 ] (5)14000rpm/min离心10min，离心管中会出现分层现象，上层为含有核酸的水相， 下层为含有其他杂质的有机相。
[0052] (6)利用微量移液器小心吸取上层含核酸的水相，放置于一个新的1.5mL离心管中 (为了避免吸起下层的有机相，最好用去除尖头的蓝枪头），弃下层有机相；
[0053] (7)重复步骤(4)~(6);
[0054] (8)向含有水相的离心管中加入等体积的饱和酚:氯仿= 1:1，反复颠倒混匀5min， 14000rpm/min离心10min，然后吸取上层液体，放于一个新的1.5mL离心管中；
[0055] (9)重复步骤(8);
[0056] (10 )向其中加入饱和酚：氯仿：异戊醇的体积比为25 : 24 : 1，翻覆颠倒混匀， 14000rpm/min 离心 lOmin;
[0057] (11)吸除上层液体，加入2倍体积的无水乙醇（事先放于_20°C冰箱内预冷）沉淀 DNA，此时会在离心管内出现丝状或絮状DNA沉淀；
[0058] (12)用黄色枪头小心的挑出丝状或絮状DNA沉淀，放于一个新的1.5mL的EP管，向 其中加入70 %乙醇(-20°C预冷)500yL，洗涤DNA沉淀，温和颠倒30s，弃70 %乙醇；
[0059] (13)重复步骤(12);
[0060] (14)将含有DNA沉淀的离心管放于室温环境中，干燥20~30min;
[00611 (15)加入60~80yL的TE缓冲液或双蒸水溶解DNA沉淀（勿剧烈振荡或离心），将其 保存于_20°C冰箱内。
[0062] 2、目的片段的扩