一种与棉花海岛棉纤维长度连锁的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及到一种与棉花海岛棉纤维长度连锁 的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民 经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维 品质的要求也越来越高。纤维品质的育种已成为我国棉花育种的主要目标之一。纤维长度 是纤维品质性状的一项重要指标，培育纤维较长的品种是纺高档纱和出高档棉织品的要求 之一，也是实现棉花机械化采收的一个重要要求。
[0003] 海岛棉纤维品质优良，但适应性差，产量低，而陆地棉产量高，适应性广，但品质差 (Percy et al.，2006)。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因 转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质和产量同步改良具有重要的意义。
[0004] 采用传统的育种方法，每一世代的纤维品质选择都需等到棉花吐絮后收取棉花乳 花后进行纤维品质检测后才能决定，而且纤维品质性状受环境影响较大，使得表型选择准 确性差、周期长、效率低，导致品质育种进展缓慢。棉花的纤维品质性状属于多基因控制的 数量性状。主要纤维品质性状与产量性状之间存在显著或不显著负相关（潘家驹，等， 1998)，给棉花纤维品质与产量的同步改良带来了难度。
[0005] 分子生物学以及数量性状基因位点作图方法的发展为棉纤维品质改良提供了有 效手段。借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发 育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基 因间的相互干扰，有利于快速皇集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大 地缩短了育种时间。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进 行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL检测（如Jiang et al.l998;Paterson et al.2003;Mei et al.2004;Lin et al.2005;杨蠢雷等，2009,2015;He et al.2007;Lacape et al.2005,2010;Yu et al.2013)，取得了很大研究进展，为纤维品质性状的分子标记辅 助选择打下了良好的基础，但QTLs或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种 中的不多。
[0006] 前人研究中多数是利用分离群体(如F^BCi)，遗传背景复杂，或只在单个环境下检 测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，多环境稳定的QTL少，且有些研究最初的目的只 是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应 用到育种中。染色体片段代换系(又叫导入系，或渐渗系），基因组中只含有少数供体亲本的 染色体片段，大部分遗传背景与受体亲本一致，减少了遗传背景的干扰，是QTL检测和研究 的理想材料。本发明是利用染色体片段代换系筛选出多环境稳定的QTLs及其连锁的标记， 通过标记辅助选择，得到纤维长度得到提高的单株系。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是:为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、 周期长、成本高等许多缺点，解决纤维品质育种进展缓慢的问题，本发明提供一种来自纤维 高优质材料海岛棉海1与棉花纤维长度QTL/主效基因连锁的分子标记，即：通过筛选来自纤 维高优质材料海岛棉海1中与纤维长度QTL/主效基因连锁的SSR分子标记，进行DNA水平上 的早期标记辅助选择，提高育种效率。
[0008] 本发明的提供的技术方案是：一种与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-l 和qFL-C22_l连锁的分子标记，qFL-C13_l和qFL-C22_l分别位于染色体C13和C22上，与qFL-C13-1紧密连锁的标记为CGR5242 1QQ;与qFL-C22-l连锁的标记为NAU297715Q，其中，分子标记 CGR52421()()的特异性引物CGR5242其正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ ID N0.2 所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为l〇〇bp;分子标记NAU297715〇的特异性引物 NAU2977其正向序列如SEQIDN0.3所示，反向序列如SEQIDN0.4所示，用该引物扩增出的 特异标记，条带分子量为150bp，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度具体 如下：
[0009]
[0010] 本发明还提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法及利用上述与棉花纤维长度 QTL/主效基因位点连锁的分子标记在棉花辅助育种以提高棉花纤维长度中的应用。
[0011] -种陆地棉纤维长度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：
[0012] (1)提取苗期单株DNA;
[0013] (2)使用与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13_l和qFL-C22_l连锁的分子标 记，分别为CGR52421Q()和NAU297715Q，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所 45和海岛棉海1基因型作为对照；
[0014] (3)对检测结果进行分析；
[0015] (4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的单株；
[0016] 其中，所述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-l和qFL-C22-l连锁的分子 标记的特异性引物分别为CGR5242和NAU2977，CGR5242引物其正向序列如SEQ ID N0.1所 示，反向序列如SEQ ID N0.2所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为100bp; NAU2977其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的 特异标记，条带分子量为150b。
[0017] 上述方法中，步骤（1)苗期单株提取DNA;以陆地棉品种或品系（如鲁棉研28、中棉 所60)为受体亲本，海岛棉海1为供体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海 1为供体亲本，陆地棉品种为受体亲本杂交高代回交获得的染色体片段代换系及其衍生品 系，或者其染色体片段代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法 (Paterson et al. 1993)提取分离群体单株DNA;
[0018] 根据本发明的与陆地棉纤维长度辅助育种方法，使用SSR标记CGR52421() 0和 NAU297715Q在与海岛棉海1等有关的育种群体中对纤维长度性状进行分子标记选择，可提高 陆地棉的纤维长度。该方法所用的分子标记CGR5242iqq和NAU2977i5Q分别与棉花纤维长度性 状的2个QTLs: qFL-C13_l和qFL-C22_l (FL是纤维长度的英文单词fiber length的缩写;QTL 的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如： qFL-C13_l表示在第13条染色体上控制纤维长度的第1个QTL)紧密连锁。这2个纤维长度性 状的QTLs:qFL-C13-l和qFL-C22_l分别位于染色体C13和C22上，都来源于海岛棉海1，对棉 花纤维长度的贡献率分别为3.71-7.14%和3.69-5.60 %，加性效应分别为0.61-0.88cm和 0·53-0·68cm〇
[0019] 本发明不仅有助于筛选长纤维材料，为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品 系的纤维长度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为QTL的精细定位及基因克隆奠定 基础。通过这些分子标记选择可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质 的育种进程。
[0020] 使用本发明可以在棉花苗期预测纤维长度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选 纤维长度长的株系用于棉花纤维品质育种，提高选择的准确性和效率。
[0021 ]本发明所述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-l和qFL-C22-l连锁的分 子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的：
[0022] (1)以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45为受体亲本，通过杂交高代回交，连续自 交，构建了一套中棉所45为遗传背景的染色体片段代换系，共116个BC4F:家系（杨泽茂等， 2009)。经过连续自交，2009年获得2328个BC4F3单株。按家系随机挑选332个BC4F3单株2010 年种成BC4F3:4株行，混收BC4F3:4株行种子，201 1年种成两个环境的BC4F3:5株系（安阳和新 疆），混收BC4F3:5株系种子，2014年种成两个环境的BC4F 3:6株系(周□和新疆）。测定每个环境 中群体的纤维品质；
[0023] (2)对（1)中332个代换系及其亲本提取DNA，按照CTAB方法（Paterson et al.1993)提取 DNA;
[0024] (3)本发明人以中棉所36 X海lBQFi群体为作图群体，构建了一个SSR高密度分子 遗传连锁图谱(Shi et al.2015)，从该图谱上每隔大约5-10cM选择一个SSR标记，共筛选出 覆盖棉花全部26条染色体的520个标记位点，并用其对上述(2)332个染色体片段代换系材 料DNA进行基因型检测，以中棉所45和海1基因型作为对照；
[0025] (4)米用QTL IciMapping V4.0软件（http://www. isbreeding.net/software/)， 利用七个环境(2009年安阳，2010安阳，2011年安阳和新疆，2014年周口和新疆）的纤维长度 性状的表型数据和基因型数据进行纤维长度性状的多环境QTL定位分析，获得多环境稳定 的纤维长度性状QTLs，其中有2个QTLs在四个环境中表现稳定，是新发现的，这2个QTLS qFL-C13_l和qFL-C22_l，分别位于染色体C13和CC22上，增效基因都来源于海岛棉海1，对棉 花纤维长度的贡献率分别为3.71-7.14%和3.69-5.60 %，加性效应分别为0.61-0.88cm和 0.53-0.68cm;与这2个纤维长度性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CGR5242 1()0和 NAU2977i5〇。
[0026] 本发明的有益效果如下：
[0027] 本发明提供了一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，使用分子标记 CGR52421Q()和NAU297715Q在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维 长度 0 · 61-0 · 88cm和0 · 53-0 · 68cm。
[0028] 使用本发明中的分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维长度性状的选择效 率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，快速地提高现有陆地 棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育进程。
【附图说明】
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