一种快速检测水体中小瓜虫的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别涉及水体中小瓜虫DNA样本的采集、提取、扩增 及鉴定方面，具体是指一种水体小瓜虫快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 小瓜虫属于原生动物门、纤毛虫纲、膜口目、凹口科、小瓜虫属，是一种世界性分布 的淡水鱼类寄生虫，在高密度水产养殖中引起鱼类暴发性感染，导致大批鱼死亡，造成巨大 经济损失。
[0003] 为了有效控制该病的发生，国内外研究学者探讨了该病病原的部分生物学特性、 病理特点、物理化学及中草药对离体小瓜虫的杀灭效果、小瓜虫不同免疫疫苗的制造。除基 础研究外治疗性实验的结果不是效果不理想就是应用性较差。综合养殖经验和实验结果来 看，目前对于小瓜虫病的防治策略应以防为主，治为辅。所以，及时了解水体中小瓜虫的存 在状态，提前做好水体处理或及时转走养殖鱼体，是防止小瓜虫病爆发的最佳途径。
【发明内容】
[0004] 本发明的内容是为了及时发现水体中小瓜虫的存在情况，提供一种高效、快捷、准 确的水体小瓜虫检测方法，为最终通过小瓜虫DNA浓度来判断爆发小瓜虫病的可能性奠定 基础，用以指导实际的养殖操作。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供了一种快速检测水体中小瓜虫方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤1:根据养殖水域大小，采集水样；
[0007] 步骤2:将水样进行处理后，提取水体中的总DNA;
[0008] 步骤3:利用核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物 750bp，电泳检测；
[0009] 步骤4:将上述PCR产物切胶回收，连接载体后转入大肠杆菌DH5a中进行克隆，并尽 可能多的挑取单克隆个体进行测序；
[0010] 步骤5:利用DNAMAN6.0软件对测序结果进行比对，找出小瓜虫与测得的相似种之 间的差异位点并设计出至少2对针对小瓜虫的巢氏PCR引物；
[0011] 步骤6:利用上述引物对步骤3得到的PCR产物进行巢氏PCR，知道电泳检测结果显 示，有小瓜虫可扩增出条带，即可完成对水体中小瓜虫的检测。
[0012] 所述步骤1的采集水样为所需检测的养殖池池底、池壁不同范围内水样或水塘排 水口不同时间段的水样等体积混合物。
[0013] 所述步骤2中的水样处理为对所述水样采用25μπι滤膜进行真空抽滤，抽滤后将所 述的滤膜放入装有35ml无菌水的50ml离心管中，于祸旋振荡器上震荡混勾，8000rpm离心 5min，收集沉淀于-20°C保存;对沉淀物加入新的无菌水，反复吹洗后，装于1.5ml的离心管 中，lOOOOrpm离心5min，弃上清备用。
[0014] 所述步骤2中总DNA的提取采用试剂盒方法，凝胶电泳检测DNA提取情况后于-20°C 保存备用。
[0015] 所述步骤3中引物核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R分别为IC-ITS-F 5'-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3 ' 和IC-ITS-R 5 ' -TTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3 ' WCR扩增条件为： 94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，30 个循环，72°C 延伸 lOmin;
[0016] PCR扩增反应体系为每25μ1 体系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，浓度为lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0017] 电泳检测上述PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中，电压120V电泳15min，最后在凝胶成 像系统上拍照即可完成电泳检测。针对小瓜虫的巢氏PCR引物为2对，分别为n-ICl-F和n-ICl-R;n-IC2-F 和 n-ICl-R。经检测第一对引物(n-ICl-F 和 n-ICl-R)扩增 PCR 产物447bp，第 二对引物(n-IC2-F和n-ICl-R)扩增PCR产物为225bp。
[0018] 所述步骤4中挑取的单克隆个体20-40个，最后测序得到序列为15个。
[0019] 所述步骤6中，巢氏PCRPCR扩增条件为：94°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火 30s，72°C 延伸 30s，30 个循环，72°C 延伸 lOmin;
[0020] PCR扩增反应体系为每25μ1 体系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，浓度为lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0021] 本发明将环境分子生物学技术原理应用于养殖调查，在获取小瓜虫DNA时，只需在 目标水体一定范围、时间内进行水样采集即可，快速、简便、及时的了解了水体中小瓜虫的 存在情况，解决了小瓜虫病源发现难的问题，为最终通过水体小瓜虫DNA浓度测算小瓜虫病 爆发几率奠定基础，以解决小瓜虫病发现时由于病情严重治疗难的问题。相对于传统小虫 病的防治方法来讲，具有创新性，避免了药物治疗方法带来的药物残留，物理治疗方法的效 果不佳，生物治疗方法时间长的问题，防患于未然，极大的降低了小瓜虫病的爆发机率。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例的方法流程图。
[0023] 图2为本发明方法灵敏度检测、自然水体爆发小瓜虫过程、不同养殖水体小瓜虫存 在情况的DNA提取结果图。
[0024] 图3为本发明实施例使用IC-ITS-F和IC-ITS-R对上述三种情况下的小瓜虫DNA进 行第一次PCR的结果图。
[0025] 图4为本发明实施例使用n-ICl-F和n-ICl-R对上述三种情况下的小瓜虫第一次 PCR产物巢氏PCR的结果图。
[0026] 图5为本发明实施例使用n-IC2-F和n-ICl-R对上述三种情况下的小瓜虫第一次 PCR产物巢氏PCR的结果图。
[0027] 图6为通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的小瓜虫及相似种的序列，图中方 框表示为针对小瓜虫特异位点设计的2对特异性引物(n-ICl-F/n-ICl-R;n-IC2-F/n-ICl-R);其中，图6-ln-ICl-F为上游引物、6-2n-ICl-R为下游引物；图6-3n-IC2-F为上游引物、6-4n-ICl-R为下游引物。
【具体实施方式】
[0028] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一 步说明。
[0029] 附图2、3、4、5电泳图泳道点样顺序依次为:5个/L小瓜虫，10个/L小瓜虫，15个/L小 瓜虫，25个/L小瓜虫，40个/L小瓜虫，补充水源，铜鱼，空白对照，DNAMarker，第一阶段水样， 第二阶段水样，第三阶段水样，第四阶段水样，第五阶段水样，空白对照，DNAMarker，认养喂 养车间6号池水样，尾滩1号塘水样，尾滩3号塘水样，板房玻纤缸养殖池水样，第四车间5号 池水体，空白对照，DNAMarker。
[0030] DNAMrker条带大小从下往上依次为：100bp; 250bp; 500bp; 750bp; lOOObp; 2000bp; 3000bp；5000bp〇
[0031] 附图6为通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的，小瓜虫及相似种的序列，共10 个，其序列见SEQUENCE LISTING。
[0032] 实施例1
[0033] 方法灵敏度检测
[0034] 为了确定本发明可以有效的提取水体中的小瓜虫DNA，取严重感染小瓜虫的鱼体 (鱼体表面有很多小白点），用蒸馏水清洗鱼体三遍，用载玻片轻轻刮取鱼体表面的白色包 囊，将包囊连同其内的多子小瓜虫收集到无菌培养皿中，静置，吸取大量黏液于另一无菌 培养皿中并反复吹洗，将包裹在粘液中的小瓜虫分离出来，除去黏液。至此2个培养皿中存 在大量可供挑选的小瓜虫单个虫体(若黏液较多可再次重复上述操作以获取更多量的单独 虫体）。将5、10、15、25、40个小瓜虫分别放置与11^水中，按如图1所示实验流程进行实验，使 用滤膜孔径为25μπι的真空抽气栗对5个水样进行抽滤处理，将滤膜放入50ml的离心管中，于 祸旋振荡器上震荡混勾，8000rpm离心5min，倒去上清，加入新的无菌水，反复吹洗后吸入至 1.5ml的离心管中，lOOOOrpm离心5min，去上清，使用TIANGEN公司生产的试剂盒提取小瓜虫 总DNA并溶于TE缓冲液中，-20°C保存备用。图2-A为DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0035] 采用IC-ITS-F和IC-ITS-R序列作为通用性